蛋白激酶Cε对大鼠背根神经节持续受压后背角星型胶质细胞激活和机械痛敏的影响

摘要 目的：探讨大鼠背根神经节持续受压(chronic compression of the dorsal root ganglion,CCD)后,脊髓背角星型胶质细胞的激活情况,以及PKCε是否可以通过调节星型胶质细胞的活性而参与CCD后神经病理性疼痛。 方法：将大鼠随机分为 6组,每组大鼠8只：假手术组、CCD7天组、CCD14天组、CCD7天+BIM I组、CCD+DMSO组、CCD+PDBu组,分别通过鞘内注射不同药物,或对正常大鼠鞘注DMSO/PDBu后,测量大鼠机械刺激缩爪阈值（paw withdrawal mechanical threshold,PWMT）的变化,利用Western Blot技术检测脊髓背角PKCε和GFAP蛋白表达的变化,利用免疫荧光技术检测脊髓背角星型胶质细胞激活情况。 结果：CCD术后第4天,鞘内注射PKCε的激动剂PDBu 1—4h,明显降低CCD大鼠PWMT（P<0.05）,而给予BIM I 1—4h,可升高CCD大鼠PWMT（P<0.05）。从CCD术后第4天起,连续3天鞘注BIM I,可明显缓解大鼠的机械痛敏（4天,P<0.05）,但从停止注射后镇痛作用消失（P>0.05）。与假手术组比较,CCD后7天和14天,手术侧背角PKCε和GFAP表达升高,差异有显著性意义(P<0.05),星型胶质细胞激活增加,而注射BIM I可明显抑制PKCε和GFAP表达(P<0.05)和星型胶质细胞激活。PDBu可导致正常大鼠PWMT明显降低（P<0.05）,GFAP蛋白质表达量增加（P<0.05）,促进星型胶质细胞激活。 结论：大鼠背根神经节持续受压后,机械痛阈下降的同时,手术侧脊髓背角内PKCε和GFAP蛋白表达上调,星型胶质细胞激活增加。PKCε可能通过调节星型胶质细胞激活参与CCD后病理性神经痛的中枢敏化机制。     

氯胺酮对脊神经结扎大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响

目的：观察腹腔注射氯胺酮（KET）对脊神经结扎（SNL）大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响.方法：雄性SD大鼠42只随机分为五组：SHAM组;KET0组和NS0组结扎后分别腹腔注射KET 10mg/kg和生理盐水（NS）10 ml/kg;KET7组和NS7组,结扎7天后分别腹腔注射KET 10 mg/kg和NS.每组（除SHAM组）给药,每天两次,共7天.结扎后第4、7、14、21、28天行机械性痛敏实验,并用组化方法测定右侧脊髓背角胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞的变化.结果：与SHAM比较,KET0、NS0组机械痛敏试验的压力阈值（PWPT）下降,二者GFAP阳性细胞染色较SHAM深,GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别增加45.0%（P＜0.01）和86.7%（P＜0.01）;与NS7比较,KET7组PWPT升高,KET7组GFAP阳性细胞染色较NS7组浅,相对面积（不同时段）分别下降40.3%（P＜0.01）和24.6%（P＜0.01）.结论：低剂量的KET能抑制星形胶质细胞的激活,从而起到治疗神经病理性疼痛的作用.     

重复经颅磁刺激对神经病理性疼痛大鼠脊髓内星形胶质细胞的抑制作用

目的观察低频和高频重复经颅磁刺激（rTMS）对大鼠神经病理性疼痛的疗效及其对大鼠脊髓内星形胶质细胞标志物胶质酸性纤维蛋白（GFAP）的影响,探讨rTMS治疗神经病理性疼痛的机制。 方法28只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、假治疗组、低频rTMS组(1Hz)、高频rTMS组(20Hz),每组7只。假手术组仅暴露游离大鼠坐骨神经,不予结扎;其余3组经手术结扎坐骨神经制作神经病理性疼痛模型。术后第3天开始进行rTMS治疗,连续10d,刺激疼痛对侧大脑初级运动皮质。并于造模前、rTMS治疗前和治疗后测定疼痛行为学表现、机械痛觉和热痛觉,并于治疗结束后测定腰段脊髓内GFAP的表达。 结果造模后3d,假治疗组、低频rTMS组、高频rTMS组大鼠均出现明显的疼痛行为学表现,热痛潜伏时较假手术组均明显降低(P<0.05)。rTMS治疗后,高频rTMS组热痛潜伏时较假治疗组升高(P<0.05),而低频rTMS组无明显变化。与假手术组比较,假治疗组和低频rTMS组损伤侧脊髓背角内GFAP阳性表达细胞数量和染色强度均明显增加(P<0.05)。与假治疗组比较,高频rTMS组脊髓背角GFAP的表达显著下调（P<0.05）,而低频rTMS无此改变。高频rTMS组大鼠疼痛改善程度与脊髓背角中GFAP的表达呈负相关。 结论坐骨神经结扎导致的神经病理性疼痛伴有脊髓背角内星形胶质细胞增殖;高频rTMS可以通过抑制脊髓内星形胶质细胞的增殖和活性而缓解疼痛,低频rTMS则无明显效果。     

米诺环素对神经病理性疼痛大鼠脊髓水平OX-42表达的影响

目的:观察米诺环素对CCI大鼠脊髓水平OX-42表达的影响,探讨小胶质细胞在神经病理性疼痛中的作用.方法:将70只SD大鼠随机分成5组:Ⅰ组:对照组(n=10)、Ⅱ组:假手术组(n=15)、Ⅲ组:预给药组(n=15)、Ⅳ组:术后给药组(n=15)、Ⅴ组:生理盐水组(n=15).用von Freyfilaments测定大鼠50%缩足阈值的变化;Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组大鼠于模型建立后给予米诺环素或者生理盐水,并于术后7、11、13、14、15天从实验组随机取出3只大鼠取其相应节段的脊髓组织,用免疫组织化学的方法观察其特异性标志物OX-42的染色情况.结果:(1)坐骨神经结扎后7d大鼠出现机械性触痛,至实验结束痛行为稳定并持续存在.(2)Ⅴ组脊髓背角小胶质细胞在术后7d发生激活,至术后11d小胶质细胞被强烈的激活,之后有减退的趋势;Ⅳ组小胶质细胞有明显的激活;Ⅱ 组和Ⅲ组亦可见小胶质细胞有轻微的激活.结论:脊髓水平小胶质细胞的激活可能对神经病理性疼痛的产生发挥重要作用;米诺环素预先给药可以缓解神经病理性疼痛.     

吗啡联合加巴喷丁对术后持续性痛大鼠脊髓小胶质细胞的影响

目的:观察鞘内注射吗啡联合加巴喷丁对皮肤/肌肉切口和牵拉(skin/muscle incision and retraction,SMIR)术后持续性痛大鼠脊髓背角小胶质细胞活化的影响。方法:选择鞘内置管成功的雄性SD大鼠120只,随机分为5组(n=24):假手术组、术后持续性痛组、吗啡组、加巴喷丁组和吗啡联合加巴喷丁组。按Flatters法制作大鼠SMIR术后持续性痛模型;应用机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)评定大鼠的疼痛行为学;应用免疫荧光技术检测脊髓背角活化的小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白分子-1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)的表达。结果:与假手术组比较,术后持续性痛组的MWT在术后第3 d、7 d、12 d、22 d明显下降(P<0.05),脊髓背角Iba-1表达在术后第3 d、7 d明显增加(P<0.05);与术后持续性痛组比较,吗啡组和加巴喷丁组的MWT和脊髓背角Iba-1的表达无明显变化;与术后持续性痛,吗啡组和加巴喷丁组比较,吗啡联合加巴喷丁组的MWT在术后第3 d、7 d、12 d、22 d明显增加(P<0.05),脊髓背角Iba-1表达在术后第3 d、7 d明显减少(P<0.05)。结论:吗啡联合加巴喷丁对大鼠SMIR术后持续性痛有镇痛作用,可能与抑制脊髓背角小胶质细胞的活化有关。     

丙泊酚对慢性神经痛大鼠脊髓星形胶质细胞激活的影响

目的 :研究丙泊酚对慢性神经痛大鼠脊髓星形胶质细胞激活的影响。方法 :Wistar大鼠 4 0只 ,随机分为 4组 ,Ⅰ组为正常对照 ;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组结扎左侧坐骨神经 ,术后第 7天 ,Ⅰ、Ⅱ组腹腔均注射生理盐水 5 0ml·kg 1,Ⅲ、Ⅳ组腹腔分别注射丙泊酚 5 0、75mg·kg 1( 1mgoml 1) ,共 7d ;术后第 6、10和 13天 ,使用VonFrey纤维分别测定各组动物触诱发痛阈 ,观察丙泊酚对其影响 ;随后取脊髓切片 ,观察星形胶质细胞在脊髓背角的分布。结果 :①与Ⅰ组比较 ,Ⅱ组双侧的 5 0 %缩足阈值 (PWTs)在术后第 6、10和 13d均较低 (P <0 .0 5 ) ;与Ⅱ组比较 ,Ⅲ、Ⅳ组双侧的PWTs在术后第 10、13天升高 (P <0 .0 5 )。②Ⅱ组星形胶质细胞在脊髓背角的分布密度 (AD)、平均光密度 (AOD)和积分光密度 (IOD)值显著高于Ⅰ组 (P <0 .0 1) ,Ⅲ、Ⅳ组低于Ⅱ组 (P <0 .0 5和P <0 .0 1)。③与Ⅱ组比较 ,Ⅲ、Ⅳ组星形胶质细胞在脊髓背角数量、体积依次减少。结论 :慢性神经痛大鼠的脊髓星形胶质细胞被激活 ,丙泊酚可抑制激活 ,抑制程度与剂量有相关性     

神经病理性疼痛大鼠脊髓中星形胶质细胞GFAP及FGFRs不同表达的观察

目的:观察神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)大鼠脊髓成星形胶质细胞(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及纤维生长因子受体家族成员1~4(fibroblast growth factor receptor 1~4,FGFR1~4)的表达变化。方法:体重180~200g的SD雄性大鼠40只随机分为2组(n=20),分别制作模型:假手术组(sham)和模型组(SNI)。术后1,3,5,7天使用von Frey纤维针测量大鼠术侧机械痛域值(mechanical pain threshold,MPT),并在相应的时间点取各组大鼠L4~L6脊髓,使用激光共聚焦检测脊髓背角星形胶质细胞GFAP表达水平以及激活状态,实时荧光定量PCR检测GFAP mRNA、FGFRs mRNA表达水平的变化情况。结果:与sham组相比,SNI组大鼠痛域值随时间下降明显,脊髓星形胶质细胞GFAP阳性细胞数和GFAP mRNA表达从术后3天起逐渐升高。FGFRs家族成员间mRNA变化存在差异:与sham组相比SNI大鼠FGFR1 mRNA表达术后第1天高。SNI组和sham组大鼠FGFR2~4 mRNA在术后5天之内维持在低水平,而SNI组大鼠在第7天显著升高,两组之间差异显著。结论:NP中脊髓星形胶质细胞GFAP的改变以及不同FGFRs mRNA的变化可能对于NP的发生与维持有重要意义。     

补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响

目的:观察补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响。方法:81只补体C3基因敲除小鼠随机分三组(n=27):A组:假手术组;B组:慢性坐骨神经结扎模型(CCI)组;C组:CCI模型补体C3干预组。测定小鼠的热痛阈值和机械痛阈值,并取腰5、6脊髓节段测定GFAP mRNA和GFAP表达。结果 :术前三个组小鼠热和机械痛阈无明显差异,术后1天A组热和机械痛阈下降,其后恢复。B组和C组继续下降,C组下降幅度更大(P<0.05)。术后第1天,B组和C组胶质细胞激活轻微,术后第3、7天B组和C组脊髓组织GFAP mRNA和GFAP表达量逐渐增加,且C组其表达量明显高于B组。结论 :补体C3的存在与神经病理性模型小鼠星形胶质细胞激活显著相关,并由此影响到慢性疼痛状态的出现和维持。     

蛛网膜下腔注射胶质细胞源性神经营养因子对神经病理性痛大鼠机械性痛敏和冷诱发的持续性疼痛的影响

目的:探讨蛛网膜下腔注射胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对大鼠脊神经结扎神经源性痛的影响.方法:采用大鼠L5～6脊神经结扎模型,将SD雄性大鼠随机分为正常组(n=6);假手术组(n=10);单纯脊神经结扎(spinal nenre ligation,SNL)组(n=10):蛛网膜下腔注射生理盐水;GDNF治疗组(n=10):蛛网膜下腔注射GDNF.大鼠脊神经结扎后不同时间点进行行为学评估,以引起50%缩足的机械刺激阈值评价机械性痛觉超敏,5min内在5±1℃冷板上的缩足次数反映冷诱发的持续性疼痛.结果:各组术前基础机械痛阈和冷刺激痛阈比较差异无统计学意义(P>0.05).与假手术组相比,SNL组术后第1d开始出现机械痛阈和冷刺激痛阈降低(P<0.05),一直持续到第14d,GDNF组术后7、14d时冷刺激痛阈差异无统计学意义(P>0.05);与SNL组相比,GDNF组术后第3d时机械痛阈升高,第5d时冷刺激痛阈升高(P<0.05),均持续到术后14d.结论:蛛网膜下腔注射GDNF能减轻神经病理性疼痛大鼠机械性痛敏和冷诱发的持续性疼痛.     

深部脑磁刺激改善大鼠卒中后抑郁样行为

目的：探讨深部脑磁刺激（DMS）对卒中后抑郁（PSD）模型大鼠抑郁样行为的治疗作用及其可能机制。方法：糖水偏好实验和旷场实验筛选42只正常的雄性成年SD大鼠,随机分为假手术组（Sham组,n=6）、卒中组（Stroke组,n=12）、卒中后抑郁组（PSD组,n=12）、深部脑磁刺激治疗组[（PSD+DMS）组,n=12];后3组颈总动脉线栓再灌注法构建脑缺血模型;假手术组只分离颈总动脉不结扎;PSD组和（PSD+DMS）组接受3周慢性温和应激制备PSD模型;（PSD+DMS）组每天接受40 min的40 Hz深部脑磁刺激治疗,共2周。旷场实验检测各组大鼠运动功能和焦虑样行为;糖水偏好实验检测各组大鼠快感缺失抑郁样行为;免疫荧光染色检测各组大鼠前额叶小胶质细胞激活标志物Iba-1的表达水平;蛋白质免疫印迹技术检测各组大鼠前额叶小胶质细胞激活阳性蛋白CD11b及炎性因子IL-1β和TNF-α的表达。结果：（PSD+DMS）组大鼠抑郁样行为较PSD组明显好转。卒中组大鼠前额叶小胶质细胞激活增加,炎性因子IL-1β和TNF-α的蛋白表达升高,PSD组大鼠前额叶小胶质细胞激活进一步增加,炎性因子...     

鞘内注射TLR3反义寡聚核苷酸对脊神经结扎大鼠的镇痛作用

目的:探讨脊髓星形胶质细胞TLR3在神经病理性疼痛中的作用.方法:雄性SD大鼠,体重180～250 g.实验一:72只鞘内置管大鼠随机分为:生理盐水(Ns)20 μl脊神经结扎(SNL)(A 组),错义寡聚核苷酸(MM-ODN)20μg/d+SNL(B组),反义寡聚核苷酸(AS.ODN)20μg/d+SNL (C组).实验二:72只SNL后7天大鼠随机分为:SNL+NS 20μl(D组),SNL+MM-ODN 20μg/d(E组),SNL+AS-ODN 20μg/d(F组).实验一和实验二分别于SNL前1天和后7天开始鞘注,每天一次,共7天;于术后-1、1、3、5、7、10、14天和-1、7、10、12、14天行行为学实验.实验一和实验二分别于术后7天和14天每组各随机取6只大鼠利用免疫组织化学法观察脊髓背角GFAP的表达,并于术后-1、3、7、14天和术后7、10、14天每组各随机取6只大鼠断头处死,取L4～5脊髓节段采用RT-PCR法测定TLR3和IL-6 mRNA的表达.结果:实验一:与A组比较,C组PWPT升高并持续至术后14天(P<0.05),C组各时间点PWL无明显变化(P>0.05);与A组和B组比较,C组脊髓背角GFAP免疫反应阳性产物表达相对面积分别下降46.4%(P<0.01)和45.7%(P<0.01);与A组和B组比较,C组鞘内注射AS-ODN抑制了TLR3受体和IL-6 mRNA的表达.实验二D组、E组和F组在PWPT、PWL、GFAP表达和TLR3及IL-6 mRNA表达方面的差异无统计学意义(P>0.05).结论:脊髓背角星形胶质细胞TLR3可能参与了神经病理性疼痛的发生与发展.     

损伤大鼠L5脊神经及其前后根对痛行为的影响

目的:观察大鼠腰5脊神经和脊神经根不同部位损伤对诱导神经病理性疼痛的不同作用。方法:采用腰5脊神经结扎加切断(lumbar5 spinal nerve ligation,L5 SNL)、腰5前根切除(lumbar5 ventral rhizotomy,L5 VR)和腰5背根切除(lumbar5 dorsal rhizotomy,L5 DR)诱导大鼠痛觉过敏,结合痛行为学测试观察病理性疼痛的发展过程。结果:(1)L5SNL可引起大鼠病理性疼痛。双侧后肢50%撤足阈值(paw withdrawal threshold,PWT)和撤足潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)于术后1d明显下降,痛觉过敏的症状,在同侧后肢持续了5周,在对侧后肢也保持3周。(2)L5 VR也可诱导大鼠产生病理性疼痛。双侧后肢50%PWT和PWL于术后1d明显降低,并维持到了术后第5周。(3)L5DR没有引起大鼠产生痛觉过敏症状。与术前基础值和假手术组比较,L5DR后50%PWT和PWL均无明显变化。结论:选择性损伤运动纤维和损伤脊神经均能诱导大鼠产生病理性疼痛,但脊神经背根损伤不引起痛觉过敏。     

The role of uninjured nerve in spinal nerve ligated rats points to an improved animal model of neuropathic pain.

L5 and L6 spinal nerve ligation (SNL) in rats leads to behavioral signs of neuropathic pain including mechanical allodynia. The purposes of this study were to investigate the role of the intact L4 spinal nerve in the development of mechanical allodynia following L5 and L6 SNL and, as a result, to develop a modified model of neuropathic pain. As a first set of experiments, in addition to tight ligation of the left L5 and L6 spinal nerves, the intact L4 spinal nerve was manipulated either (1) by gentle repeated stretching of the L4 spinal nerve immediately after L5 and L6 SNL or (2) by intermittent mechanical stimulation to the ipsilateral paw during the first week after SNL. Tactile sensitivity was measured by determining the foot withdrawal threshold before and after SNL. Mild irritation of L4 spinal nerve and application of mechanical stimuli to the ipsilateral paw significantly increased the development of mechanical allodynia after SNL. In a second set of experiments, SNL was produced by tightly ligating only the left L5 spinal nerve with or without a loop of 5-0 chromic gut placed loosely around the L4 spinal nerve. This additional L4 loop significantly increased long-lasting tactile sensitivity compared to L5 SNL alone. These results suggest that afferent activity of the intact L4 spinal nerve aids in the development of mechanical allodynia in the SNL model of neuropathic pain. The addition of a chromic gut loop around the intact L4 spinal nerve can augment the development of mechanical allodynia following SNL of L5. We propose this latter as a useful and practical animal model of neuropathic pain.     

脊髓背角P38MAPK活化在大鼠切口痛形成中的作用

目的:研究切口痛大鼠脊髓背角磷酸化p38有丝分裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)表达的变化和鞘内注射p38MAPK特异性抑制剂SB203580对切口痛大鼠疼痛的影响.方法:雄性SD大鼠随机分为假手术组(SH组)、切口痛组(IP组)、药物组和DMSO组.按Yaksh法施行鞘内置管.按Brennan法建立大鼠切15口疼痛模型.采用Hargreaves法(热痛觉过敏)测定热刺激缩足反射潜伏期(TWL).应用免疫组织化学法检测脊髓背角p-p38MAPK表达的变化.结果:与SH组相对应的时间点和术前值比较,IP组和DMSO组大鼠在术后2 h、3 h、6h、ld、2 d和3 d的TWL均明显缩短(P<0.05或P<0.01),但IP组和DMSO组各相对应的时间点比较无明显差异;与IP组和DMSO组相对应的时间点比较,药物组大鼠在术后2 h、3 h、6 h、1 d和2 d的TWL均明显延长(P<0.05或P<0.01).与SH组比较,IP组和DMSO组P-p38MAPK阳性细胞数增加(P<0.01);与IP组和DMSO组比较,药物组P-p38MAPK阳性细胞数降低(P<0.01或0.05),IP组和DMSO组间差异无统计学意义(P>0.05).IP组和DMSO组p-p38MAPK阳性细胞数在术后6h开始增加,1d达到高峰,然后逐渐下降,5d后逐渐恢复.结论:脊髓背角p38MAPK活化参与切口痛的形成与发展.     

Gene transfer to interfere with TNFalpha signaling in neuropathic pain

We examined the role of spinal tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) in neuropathic pain of peripheral nerve origin. Two weeks after selective L5 spinal nerve ligation (SNL), rats exhibiting mechanical allodynia and thermal hyperalgesia showed a marked increase in full-length membrane-associated TNFalpha (mTNFalpha) in the dorsal horn of spinal cord, in the absence of detectable soluble TNFalpha peptide. Local release of the soluble p55 TNF receptor, achieved by herpes simplex virus vector-based gene transfer to dorsal root ganglion, resulted in a reduction of mTNFalpha and concomitant reductions in interleukin-1beta and phosphorylated p38 MAP kinase. Subcutaneous inoculation of soluble p55 TNF receptor expressing HSV vector into the plantar surface of the hind foot ipsilateral to the ligation 1 week before SNL delayed the development of both mechanical allodynia and thermal hyperalgesia; subcutaneous inoculation into the hind foot ipsilateral to the ligation 1 week after SNL resulted in a statistically significant reduction in mechanical allodynia and thermal hyperalgesia that was apparent 1 week after inoculation. These results suggest a novel 'reverse signaling' through glial mTNFalpha, which may be exploited to downregulate the neuroimmune reaction in spinal cord to reduce chronic neuropathic pain.