诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和内皮细胞分化

目的 探索体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞和内皮细胞分化形成成骨细胞及内皮细胞共存体系的潜能和条件.方法 采用密度梯度离心法分离培养hMSCs,采用含30 mg/L内皮细胞生长添加剂的内皮细胞诱导液诱导1周,然后更换为含1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、30 μg/mL维生素C的成骨细胞诱导液继续诱导7～14 d.诱导前以只加10% FBS的HDMEM培养基作为对照.采用流式细胞术检测细胞表面分子,通过倒置显微镜观察细胞形态学变化.向成骨细胞诱导14 d后,采用茜素红染色观察钙结节形成.结果 经流式细胞术检测,诱导前分离培养的hMSCs表达CD90、CD105和CD44,不表达内皮细胞表面标志CD34和CD133,也不表达HLA-DR.诱导14 d后,hMSCs表面标志CD90和CD105的表达下降(P＜0.05),成骨细胞表面标志CD44和HLA-DR及内皮细胞表面标志CD34和CD133增加(P＜0.05).诱导过程中原先长梭形的细胞缩短,细胞出现分层.hMSCs向成骨细胞诱导14 d后,茜素红染色显示有钙结节形成.结论 hMSCs先后经内皮细胞诱导液和成骨细胞诱导液诱导,可在体外向内皮细胞和成骨细胞定向分化,形成内皮细胞和成骨细胞共存体系.     

诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和内皮细胞分化

目的 探索体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞和内皮细胞分化形成成骨细胞及内皮细胞共存体系的潜能和条件.方法 采用密度梯度离心法分离培养hMSCs,采用含30 mg/L内皮细胞生长添加剂的内皮细胞诱导液诱导1周,然后更换为含1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、30 μg/mL维生素C的成骨细胞诱导液继续诱导7～14 d.诱导前以只加10% FBS的HDMEM培养基作为对照.采用流式细胞术检测细胞表面分子,通过倒置显微镜观察细胞形态学变化.向成骨细胞诱导14 d后,采用茜素红染色观察钙结节形成.结果 经流式细胞术检测,诱导前分离培养的hMSCs表达CD90、CD105和CD44,不表达内皮细胞表面标志CD34和CD133,也不表达HLA-DR.诱导14 d后,hMSCs表面标志CD90和CD105的表达下降(P＜0.05),成骨细胞表面标志CD44和HLA-DR及内皮细胞表面标志CD34和CD133增加(P＜0.05).诱导过程中原先长梭形的细胞缩短,细胞出现分层.hMSCs向成骨细胞诱导14 d后,茜素红染色显示有钙结节形成.结论 hMSCs先后经内皮细胞诱导液和成骨细胞诱导液诱导,可在体外向内皮细胞和成骨细胞定向分化,形成内皮细胞和成骨细胞共存体系.     

骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞（MSCs）是干细胞领域的研究热点之一,体外培养为贴壁生长,表达多种表面标记物,可向骨、软骨、脂肪、成肌、神经等多种细胞定向分化,具有广阔的应用前景。近几年来,有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。现就骨髓MSCs诱导分化成骨细胞的研究进展作简要综述。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的相关研究

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞部分组成。这些贴壁的基质细胞部分包括多能间充质干细胞和分化的骨髓间充质基质细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)系统依靠增殖来自我更新,但是能够保持其干细胞的表型而引起成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成纤维细胞的分化[1]。如何定向诱导其成骨分化可为研究骨组织工程、骨折修复和骨质疏松等难题提供理论基础,具有重要的意义。本综述讨论了骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的相关研究。     

PDGF-BB诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的最佳干预时间及浓度,并鉴定其向成骨细胞分化的能力.方法 体外分离培养新西兰大白兔BMSCs原代细胞,选用3代细胞用于PDGF-BB干预实验.将筛选好的细胞接种于96孔培养板中,分为空白组:加DMEM完全培养基;对照组:BMSCs+...     

小寡核苷酸对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的：筛选具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用的小寡核苷酸（ODN）,探讨ODN对BMSCs向成骨细胞分化的影响。方法：取第3代BMSCs孵育24 h后进行成骨诱导,双盲法加入12条不同的ODN,PBS作为溶媒对照组,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN于不同工作浓度（4.0、 2.0、 1.0和 0.5 mg/L）、不同时间点（24、72和120 h）刺激经成骨诱导后的BMSCs内ALP的表达水平,筛选出具有促成骨分化作用的ODN。结果：与PBS溶媒对照组比较,ODN工作浓度为4.0和0.5 mg/L时,实验组与对照组ALP表达水平差异无显著性(P>0.05),ODN工作浓度为2.0和1.0 mg/L时,有2条ODN在不同时间点（24、72和120 h）均可促进BMSCs内ALP的表达（P<0.01）。结论：在12条不同的ODN中共筛选出2条具有促进BMSCs成骨分化作用的ODN,表明特定序列的ODN能够影响大鼠BMSCs向成骨细胞的分化。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

葡萄糖、胰岛素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 观察不同浓度葡萄糖及胰岛素(INs)对骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞(OB)分化能力的影响,探讨葡萄糖及INs对骨代谢的作用机制.方法 采用体外细胞培养技术自大鼠股骨和胫骨中分离BMSC进行纯化,培养,然后在成骨培养基中诱导BMSC分化为OB,并用不同浓度的葡萄糖(5.6、25、50 mmol/L)及加或不加INs(0.6 μg/ml)干预诱导过程,光镜下观察茜素红染色分化后的OB钙结节的细胞比例.Realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)及转录因子Runx2 mRNA表达.结果 随着糖浓度升高,茜素红染色红色钙结节数目明显减少,PCR结果显示ALP,BGP及Runx2 mRNA表达也明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).提示随着糖浓度增加成骨分化逐渐减少,在同等糖浓度下,加入INs干预组,茜素红染色阳性细胞计数明显增加,PCR结果ALP,BGP及Runx2 mRNA表达明显升高(P<0.01),提示INs可提高OB分化.结论 葡萄糖呈量效性地抑制BMSC向OB分化,这可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一.INs可促进BMSC向OB分化,并可改善高糖对BMSC向OB分化的抑制作用.     

骨髓间充质干细胞对心肌梗死治疗的研究进展

骨髓间充质干细胞拥有心肌再生的能力,移植后能够产生心肌样细胞,促进血管生成,分泌多种生长因子与细胞因子。本文总结了心肌修复的分子机制,探讨了心肌梗死后心肌潜在的再生能力,回顾了以往研究中干细胞移植对心肌梗死后心肌修复的治疗效果,为制定临床策略提供了新的思路。     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

成神经细胞分化的骨髓间充质干细胞向干细胞因子的趋化性迁移

目的研究成神经细胞分化不同阶段的骨髓间充质干细胞（BMSCs）向干细胞因子（SCF）的趋化性迁移。方法 Percoll密度梯度离心法分离培养SD大鼠BMSCs,体外传代并扩增纯化,通过免疫荧光染色及多向分化对其进行鉴定。采用碱性成纤维生长因子（bFGF）、丁羟基茴香醚（BHA）联合诱导剂对BMSCs进行成神经细胞诱导,观察分化各时期的细胞形态变化。利用Dunn chamber研究SCF对不同分化阶段BMSCs趋化性迁移的影响。结果 Dunn chamber迁移实验显示,SCF诱导实验组细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组（P〈0.05）,表明SCF对BMSCs具有趋化作用。此外,分化不同状态的BMSCs向SCF的趋化迁移程度也不同。结论 BMSCs可以分化为神经样细胞,其对SCF的趋化性迁移与分化状态密切相关。     

In Vitro Chondrogenic Phenotype Differentiation of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

In order to study the chondrogenic phenotype differentiation of adult sheep bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in a defined medium as potential seed cells for cartilage tissue engineering, MSCs were isolated by density centrifugation with Percoll solution from bone marrow aspirated from sheep iliac crest. The third passage of MSCS were induced with H-DMEM containing TGF-β3 .IGF-I, Dexamethasone and VitC. The shape and ultrastructure of cells were observed, toluidine blue stain for GAG and immunohistochemistry for type II collagen were applied for chondrogenic phenotype identification. After 14 days of induction, MSCs changed from a spindlelike appearance to a polynal shape, a large amount of endoplasmic reticulum, Golgi complex and mitochondria were observed, and the differentiation of MSCs chondrogenic phenotype was verified by positive staining of toluidine blue and immunohistochemistry. MSCs derived from bone marrow can differentiate to chondrogenic phenotype when induced in vitro and can be used as optimal seed cells for cartilage tissue engineering.     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外黄芪诱导分化为神经元样细胞.方法 通过密度梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞进行培养,观察细胞的形态和生长情况,分离纯化,传代扩增.采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态变化,以免疫组织化学染色方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.用RT-PCR方法半定量分析相关基因neurogenin-1(Ngn-1)和Wnt-1基因在诱导过程中的表达.结果 经传代后,骨髓间充质干细胞呈纤维细胞样,有较强的增殖能力.经黄芪诱导后,细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP表达阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞.Ngn-1和Wnt-1基因在黄芪诱导后明显上调.结论 大鼠骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,并在黄芪诱导下向神经元样细胞分化.Ngn-1和Wnt-1基因在其分化过程中起正调控作用.     

人骨髓间充质干细胞向Leydig细胞或产类固醇激素细胞体外诱导分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向睾丸Leydig细胞分化,并确定诱导条件。方法将分离培养所获得的第3代MSCs细胞经含黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板衍化生长因子(PDGF)及白介素-1α(IL-1α)的诱导液诱导,按诱导液中各因子浓度不同分为A、B、C组和对照组,分别于7d、14d、21d时观察细胞形态变化,并行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,检测各组细胞3β-HSD的表达。以人睾酮ELISA试剂盒检测诱导细胞分泌类固醇的功能情况。结果诱导10～14d后,细胞具有Leydig细胞的形态特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,本研究条件下,随着诱导液中各因子浓度加大及诱导时间延长,诱导细胞3β-HSD表达阳性数和阳性率逐渐增多,以A组浓度及21d为最佳诱导浓度及时间(P<0.05),并且A组诱导21d分泌睾酮量最高(P<0.05)。结论人骨髓MSCs经体外诱导后可以分化为Leydig细胞或产类固醇细胞。     

不同剂量骨髓间充质干细胞对大鼠急性肺损伤的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠急性肺损伤的作用及机制。方法雄性Wister大鼠4只,用于骨髓间充质干细胞采集;分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传致第Ⅳ代备用。雌性Wister大鼠64只,随机分为对照组(C组)、内毒素肺损伤组(LPS组)、骨髓间充质干细胞治疗大剂量组(MSCH组)和小剂量组(MSCL组)。C组和肺损伤模型经气管内分别注入生理盐水和内毒素,1小时后,C组和LPS组大鼠经尾静脉注入生理盐水,MSC组(MSCH组和MSCL组)大鼠经尾静脉注入骨髓间充质干细胞混悬液2 mL(1×106和1×105两个剂量)。分别在24 h和72 h留取标本,检测肺组织形态学、肺组织湿干重比、支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞总数、蛋白含量、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-8(IL-8)水平。结果 LPS组和C组比较,肺组织病理评分、湿干重比、BALF中白细胞总数、蛋白含量、TNF-α及IL-8水平显著升高;MSC两组较LPS组各炎症指标均有明显改善,且MSCH组较MSCL组效果显著。结论 MSC移植可显著减轻内毒素诱导的急性肺损伤,且这种作用强度是剂量相关的。     

大鼠骨髓间充质干细胞的优化获取及生物学鉴定

目的 优化骨髓间充质干细胞的体外获取方法并鉴定。方法 取幼年SD大鼠骨髓，分离骨髓间充质干细胞，观察细胞形态特征、生长状况及表面抗原表达。结果 分离培养的细胞有两种不同的形态，一种为小梭形细胞，一种为大扁平细胞。第9代以前生长性状稳定，增殖能力强，细胞倍增时间为48．2h；超微结构显示为早期幼稚细胞形态；免疫细胞化学检测细胞表达CD44、CD54、CD71，但不表达CD34、CD68、层粘连蛋白；在有限的传代数内，抗原表达无改变；与传统方法相比，细胞纯度高。结论 分离培养的细胞成分单一，具有干细胞特性，适用于干细胞生物学和组织工程学的研究。     

低氧抑制人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的 探讨低氧对人间充质干细胞(hMSCs)分化为成骨细胞的影响,为骨组织工程学提供实验依据.方法 根据培养氧浓度及培养液类型随机分为4组:正常氧组(n)(20%O2 DMEM-LG),低氧组(h)(1%O2WDMEM-LG),正常氧成骨诱导组(nos)(20%O2 条件培养液)及低氧成骨诱导(hos)(1%O2 条件培养液).观察细胞形态变化,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,定量分析ALP、I型胶原蛋白(COLIA2)、骨钙素(OC)及骨粘连蛋白(BSP)mRNA表达情况,钙结节使用茜素红染色.结果 与nos组相比,n、h及hos组hMSCs生长形态改变不明显,并且不受条件培养液的影响.hos组hMSCs的ALP活性逐渐增高,但明显低于nos组,两者差异有统计学意义(P<0.01);培养4周后,与其它组相比,nos组的hMSCs可见到明显的染成红色的钙结节及钙盐沉积.定量RT-PCR检测,nos组hMSCs的ALP、OC、COLIA2及BSP mRNA表达量从7 d时开始明显增加,ALP 14 d后达到峰值,随后活性开始降低,OC、COL1A2及BSPmRNA继续增高,hos组ALP及BSP mRNA 14 d后开始增加,但明显低于nos组(均P<0.05).结论 低氧环境在体外抑制hMSCs成骨细胞分化,延迟hMSCs成骨.