Nrp1~+T细胞对淋巴细胞增殖的调节作用以及对同种异体移植物的影响

目的 探讨表达神经纤毛蛋白质1(Nrp1)的T细胞(Nrp~+ T细胞)对体内外反应性淋巴细胞增殖的调节作用以及对同种异体移植物的影响.方法采用流式细胞术分选近交系C57BL/6j小鼠脾脏中的Nrp1~+ T细胞作为调节细胞,在刀豆蛋白A(Co-hA)的刺激下与标记了羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)的C57BL/6j小鼠脾脏单个核细胞等比例共培养5d,对比观察反应细胞的增殖情况.采用流式细胞术分选C57BL/6j小鼠脾脏的Nrp1~+T细胞、CD4~+ CD25~+ Treg细胞和CD4~+ CD25~- T细胞各1×10~6个,分别经尾静脉注入到以Balb/C小鼠作为供者,以C57BL/6j小鼠作为受者行皮肤移植的小鼠体内,另外建立供、受体均为C57BL/6j小鼠的同品系对照组(注入等体积的RPMI 1640培养基).对比观察各组移植皮肤的存活情况.结果 加入Nrp1~+ T细胞的实验组增殖指数为50.92%±2.30%,明显低于未加入调节性T细胞的对照组(90.31%±1.83%,P=0.0169).实验组移植皮肤存活时间注入Nrp1~+ T细胞者为20.66±1.1ld,注入Nrp1~- T细胞者为13.20±0.76d,注入CD4~+ CD25~+ Treg者为17.67±1.0d,均明显高于对照组(9.70±1.23d,P<0.01).结论 Nrp1作为一种新型的T细胞表面分子,在淋巴细胞增殖体系中起着重要作用;与注入CD4~+ CD25~+ Treg相比,注入Nrp1~+ T细胞可明显延长小鼠移植皮肤的存活时间.     

口服抗原对同种异体移植免疫反应的影响

将Wistar大鼠预先喂养同种异基因SD大鼠脾细胞7天，然后接受SD大鼠的皮肤移植，7天后，再接近SD大鼠的心脏移植，观察口服抗原后体外混合淋巴细胞培养（MLC）、体内迟发型超敏反应（DTH）以及心脏存活时间。口服抗原后，体外MLC及体内DTH反应均出现明显的抗原特异性降低，口服抗原组大鼠并接近供者皮肤致敏后的心脏移植存活时间达到7天，与对照组未致敏鼠的心脏移植存活时间一致；而未口服抗原组接受皮肤致敏后的心脏移植存活时间不超过2天。提示口服抗原可以使异基因抗原的特异性免疫应答降低，延长移植存活时间，阻皮肤移植物的事先致敏反应的发生，并使加速排斥反应时间明显延迟。     

微囊化周围神经组织腹腔移植的实验研究

目的 观察微囊化周围神经组织移植体内后的生物活性,分析其在体内存活的时效. 方法 采用注射的方法 将微囊化周围神经组织移植到小鼠的腹腔. 结果 微囊化周围神经组织移植6周后,在小鼠的腹腔内保持了原有的形状和结构,囊内的细胞正常生存并保持增殖功能. 结论 微囊化神经组织可在体内保持活性至少6周,完善微囊化技术有望延长其存活时效,提高其促进神经损伤修复的效果.     

混合表皮细胞与脱细胞真皮基质构建复合皮的移植和转归研究

探讨混合表皮细胞与脱细胞真皮体外构建的复合皮作创面移植后的转归。将BALB／c小鼠的表皮细胞和人表皮细胞按一定比例混合，种植于脱细胞真皮基质表面，经体外培养后形成复合皮，然后移植于BALB／c小鼠全层皮肤缺损创面，观察人表皮细胞的转归。结果显示，复合皮移植后可封闭创面，人表皮细胞多位于新生表皮上层，随时间延长，数量逐渐减少并最终被小鼠自体表皮细胞替代。提示两种不同的表皮细胞按一定比例混合培养构建复合皮可封闭全层皮肤缺损创面，可望节省自体皮源，缩短体外培养时间。     

H_(22)热固化瘤苗在荷瘤小鼠中的抗癌作用

目的:探讨肿瘤细胞体外经热处理后的抗肿瘤效应。方法:采用普通水浴加热方法将小鼠H_(22)肝癌细胞经处理后制成瘤苗,腹腔移植H_(22)细胞,然后用瘤苗免疫LCR小鼠,观察小鼠的平均存活天数。结果:水浴加热完全杀死H_(22)细胞,制备的瘤苗能显著保护荷瘤小鼠的存活时间(P<0.01)。结论:采用水浴加热方法制备的肿瘤瘤苗能增强机体的抗瘤作用。     

同种异体骨髓基质细胞移植在急性辐射损伤小鼠体内的迁移

目的探讨小鼠在接受全身大剂量辐射后,移植体外扩增并已获标记的同种小鼠骨髓基质细胞(MSCs)。观察移植的MSCs在受体体内的存活、迁移和分布情况,揭示MSCs治疗急性辐射造血损伤的机制。方法将受体小鼠(20只)随机分为4组,每组5只:1、2、3周组和照射对照组。在体外对同种小鼠MSCs进行培养、扩增,取第三代MSCs,用Hoechst 33342标记后,通过尾静脉移植到已接受全身大剂量辐射的小鼠体内,于移植后1、2、3周取受体小鼠心、肝、脾、肺和肾做冰冻切片,在荧光显微镜下观测移植的MSCs在小鼠体内主要脏器的分布。结果接受MSCs移植的小鼠均存活至处死前,照射对照组小鼠在实验期内有3只死亡。在移植后各个时间点,几乎未见MSCs在受体小鼠心、肝、肺、肾内分布,而大量的MSCs则集中分布于受体小鼠脾表面。结论静脉移植的同种异体MSCs能在急性辐射损伤小鼠体内长期存活,具有向特定损伤部位迁移的能力,参与了急性辐射损伤后造血的重建。     

携人胰岛素样生长因子-1基因的成肌细胞移植后在体存活及产物表达的研究

目的:观察并探讨携人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因的成肌细胞移植入雄性C3H小鼠体内后的存活、转归以及移植后hIGF-1基因的表达。方法:84只雄性C3H小鼠随机(20~30g,7~11w)分为A组(正常小鼠转基因细胞移植组)、B组(正常小鼠空白成肌细胞移植组)、C组(受伤小鼠转基因细胞移植组)和D组(受伤小鼠空白成肌细胞移植组),每组20只,另4只作正常对照。A、B两组分别于右侧腓肠肌中段注射转基因成肌细胞或空白成肌细胞;C、D两组以重力打击造成小鼠右侧腓肠肌中段钝挫伤,伤后第3天分别于致伤局部注射转基因成肌细胞或空白成肌细胞。注射细胞后第2、5、10、20、30天,各组随机抽取4只小鼠处死,取右侧腓肠肌中段检测,Br-dU免疫组化染色检测外源细胞在体内的存活情况;4组另行hIGF-1免疫组化染色及实时PCR检测外源转基因细胞在体内表达hIGF-1情况。结果:各组小鼠均有BrdU免疫组化阳性染色,A、C两组均有hIGF-1mRNA表达及hIGF-1分泌,B、D两组未检测到hIGF-1mRNA表达及hIGF-1分泌。结论:携hIGF-1基因的成肌细胞移植入正常及钝挫伤小鼠体内后,可存活一段时间,并能稳定地分泌hIGF-1因子。     

131I-抗CD45单抗对淋巴造血组织选择性照射的研究

目的 探讨^131I—抗CD45单克隆抗体(McAb)对小鼠淋巴造血组织选择性照射的效果。方法 由鼠尾静脉注入^131I—抗CD45 McAb和^125I—IgG，观察^131I—抗CD45 McAb在小鼠体内的分布情况。结果 ^131I—抗CD45 McAb较^125I-IgG从血液中清除更快。骨髓、脾脏可快速摄取^131I—抗CD45 McAb，其在骨髓、脾脏中有选择性积聚^125I-IgG呈非特异性分布。结论 ^131I—抗CD45 McAb在小鼠体内分布具有特异性，可对淋巴造血组织产生选择性照射。     

运动对带瘤机体免疫功能的影响

观察了运动对移植艾氏腹水瘤(EAC)后小鼠IL-2产生活性、T细胞集落形成能力及存活时间的影响。发现经10天运动锻炼后带瘤鼠脾细胞产生IL-2活性、T细胞集落形成能力的衰退幅度减小,存活时间延长。提示运动延缓带瘤机体免疫功能衰退是运动抗肿瘤的途径之一。     

α-黑素细胞刺激素对同种异体小鼠异位心脏移植排斥反应的抑制作用

目的 观察小黑素细胞刺激素（α-MSH）对同种异基因小鼠移植心脏存活时间的影响,以了解其在移植免疫中的作用。方法 小鼠颈部心脏移植的Cuff模型,腹腔给予α-NSH,观察移植心脏的存活时间和病理改变。结果 移植小鼠给予α-NSH后,移植心脏的存活时间比对照组显著延长,心脏病理显著改善,其中以50μg组效果最佳。结论 α-MSH能抑制同种异基因小鼠的心脏移植排斥反应。     

抗独特型抗体对小鼠特异性低免疫反应状态的诱导作用

目的：探讨抗独特型抗体对小鼠特异性低免疫反应状态的诱导作用。方法：以C57BL／6小鼠脾细胞免疫BALB／C小鼠制备抗同种品系抗体（Abl),Abl交联KLH后,免疫BALB／C小鼠诱导产生抗独特型多克隆抗体（Ab2),以之为移植受体,,观察Ab2对小鼠特异性低免疫反应状态的诱导作用。结果：Ab1交联KLH和弗氏佐可有效诱导抗独特型抗体（Ab2),和对照组相比,Ab2诱导组小鼠移植物的存活时间明显延长,结论：移植前在受体体内诱导产生以移植物抗原为模拟抗原的抗独特型的抗体,可以对小鼠特异性低免疫反应状态起到有效的诱导作用。     

125I-抗MIF McAb体内检测同种移植排斥过程中MIF的产生和分布

目的　探讨12 5I标记抗巨噬细胞移动抑制因子 (MIF)单克隆抗体 (McAb)体内检测小鼠同种皮肤移植排斥过程中MIF的产生和分布情况。方法　①利用Iodogen法 ,用Na12 5I标记抗MIFMcAb(Ⅲ D 9)及对照抗体 (HB4 5 )。②制备小鼠同种皮肤移植模型 ,并作组织学鉴定。③分别腹腔注射12 5I Ⅲ D 9和12 5I HB4 5 ,观察同种移植排斥过程中MIF在小鼠体内的产生和分布。结果　①12 5I Ⅲ D 9标记率为 76 6 7% ,比活度为 2 9 5 2TBq/mmol。②小鼠同种移植皮片的排斥期平均为 (13 4±2 5 )d。病理切片示 ,在排斥高峰期细胞浸润明显增多 ,主要为巨噬细胞和淋巴细胞。③移植术后早期 ,12 5I Ⅲ D 9和12 5I HB4 5在移植皮片中的放射性均高于正常皮肤 ,但两者无明显差异。在移植排斥期 (移植后 12d) ,12 5I Ⅲ D 9在移植皮片中的放射性明显高于12 5I HB4 5组 (P <0 0 1)。结论　小鼠同种皮肤移植排斥反应过程中MIF表达量随排斥反应出现明显增加 ,并在移植皮片局部呈特异性分布 ,提示MIF表达量增高与移植排斥反应密切相关。     

转EGF基因表皮细胞的生物学活性及移植实验

为探讨转表皮细胞生长因子(EGF）基因的人表皮细胞在体外培养条件下及移植后EGF的表达，于体外培养转EGF基因的人表皮细胞，采用ELISA法测定不同培养时间及不同传代数时培养上清中EGF的含量。然后将转基因的人表皮细胞种植于无细胞真皮替代物表面，于体外培养后形成复合皮，移植于裸鼠全层皮肤缺损创面，移植后3周以抗EGF抗体免疫组化染色观察移植后EGF的表达。结果显示，转EGF基因表皮细胞传至第5代仍可分泌EGF，达pg级水平；含转基因表皮细胞的复合皮移植后1—3周、抗EGF染色阳性。提示转EGF基因表皮细胞在体内与体外均可稳定地表达外源基因产物，可望应用于组织工程皮肤的构建。     

抗CD49d McAb联合rhG-CSF动员的PBSC救治放射损伤小鼠

目的观察抗CD49d单克隆抗体(McAb)联用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员的外周血干细胞(PBSC)救治放射损伤小鼠的效果.方法8.5 Gy60Co γ射线照射的BALB/c小鼠,分别接受经rhG-CSF(1组)、抗CD49d McAb(2组)、rhG-CSF联合抗CD49d McAb(3组)动员的PBSC移植.并以生理盐水组为对照,观察受体小鼠的4周存活率、外周血白细胞(WBC)、骨髓有核细胞(BMNC),粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)及脾集落形成单位(CFU-S)等指标.结果实验3组小鼠的4周存活率、WBC、BMNC,CFU-GM、CFU-S数均明显高于对照组、1组和2组,差异具有显著性或非常显著性(P＜0.05或P＜0.01).结论抗CD49d McAb联合rhG-CSF使用能协同动员小鼠PBSC,并能成功救治放射损伤小鼠.     

调节性树突细胞对皮肤移植小鼠IL-10+调节性B细胞的影响

目的 探讨吞噬了供者凋亡淋巴细胞的未成熟树突细胞(imDC)对皮肤移植受体小鼠外周血IL-10+CD19+调节性B细胞(Breg)比例及移植物存活时间的影响.方法 以C57BL/6小鼠作为受者,BALB/c小鼠为供者,建立小鼠皮肤移植模型.分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,经小鼠重组白细胞介素4(IL-4)和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)共同诱导,制备并培养imDC.分离BALB/c小鼠脾淋巴细胞(SP),经光化学照射方法(PUVA)处理,得到供者小鼠脾淋巴细胞(PUVA-SP).在体外将PUVA-SP与C57BL/6小鼠骨髓来源的imDC共同培养,得到PUVA-SP DCs.根据受体小鼠术前接受的静脉输注成分将其随机分为4组(n=14):PUVA-SP DC组、imDC组、成熟树突细胞(maDC)组和PBS对照组.于手术前7d分别从尾静脉注入1×106个(0.2ml)PUVA-SP DC、imDC、maDC或0.2ml PBS.于移植术后观察受体小鼠的移植物存活时间、外周血IL-10+CD19+ Breg比例及IL-10的表达情况.结果 移植术后,受体小鼠外周血IL-10+CD 19+Breg细胞占CD19+B细胞的比例在PUVA-SP DC组为7.48％,明显高于imDC组(4.12％)、maDC组(3.01％)和PBS对照组(2.37％).PUVA-SP DC组小鼠血清中IL-10表达水平为58.2±0.9ng/ml,与maDC组(20.1±1.6ng/ml)、imDC组(26.2±1.3ng/ml)及PBS对照组(19.0±0.6ng/ml)比较显著升高(P＜0.01).PUVA-SP DC组移植物存活时间为62.3±2.6d,显著长于maDC组(20.7±1.9d)、imDC组(12.1±1.0d)和PBS对照组(11.0±1.3d,P＜0.01).结论 移植术前输注PUVA-SP DCs可显著延长移植物存活时间,增加受者体内IL-10的表达水平,诱导产生较多分泌IL-10的调节性B细胞.     

小鼠移植物抗宿主病模型的建立及其初步应用

建立小鼠GVHD模型 ,用以评价人CD4 0 Ig融合蛋白治疗的有效性。以雄性C5 7BL/ 6小鼠作为脾细胞供者 ,照射后的雌性BALB/c小鼠作为受者 ,分别将 2 5×10 7和 5 0× 10 7/L脾细胞在60 Co射线亚致死剂量照射后经尾静脉注入 30只受者小鼠体内 ,建立小鼠GVHD模型。然后 ,在GVHD诱导后第 0、2、4天分 3次经尾静脉注射CD4 0 Ig融合蛋白各 5 0、15 0、4 5 0 μg,观察CD4 0 Ig融合蛋白对GVHD小鼠的治疗效果。结果显示 :3注射脾细胞 4～5天后 ,小鼠开始出现GVHD典型体征 ,第 10天受体小鼠体内扩增出雄性供体小鼠Y染色体特异片段。CD4 0 Ig融合蛋白治疗可显著延长GVHD小鼠的平均存活时间。此结果表明 ,已成功地建立了小鼠GVHD模型 ,可用于评价抗GVHD的治疗效果。     

凝血酶促进肺癌Glc-82移植瘤的发展及其机制探讨

目的探讨凝血酶在体内促进肺癌Glc-82移植瘤的发展及其作用机制。方法细胞黏附试验和细胞迁移试验观察凝血酶对Glc-82细胞黏附特性和转移特性的影响,裸鼠移植瘤实验观察凝血酶对Glc-82移植瘤荷瘤小鼠体质量、瘤质量、肺结节及生存期的影响,Western印迹法观察凝血酶对移植瘤组织细胞外信号调节激酶（ERK）、黏着斑激酶（FAK）和抑癌蛋白PTEN（10号染色体上检出的磷酸酶和张力蛋白同源蛋白）的影响。结果凝血酶在体外显著促进Glc-82细胞的黏附和迁移;在体内,凝血酶可降低荷瘤小鼠的体质量、增加瘤质量占体质量比、部分凝血酶组小鼠肺转移增多、荷瘤小鼠的生存时间缩短;Western印迹结果显示,凝血酶可促进肿瘤组织ERK的激活,促进FAK的表达,并且抑制抑癌基因PTEN的表达。结论凝血酶促进肺癌Glc-82移植瘤的恶性进展,可能与促进肿瘤细胞的黏附和迁移特性,促进肿瘤组织ERK、FAK的激活及表达有关,并可能通过抑制抑癌蛋白PTEN的表达而发挥作用。     

J2小分子化合物能有效抑制小鼠急性移植物抗宿主反应的实验研究

目的:采用小鼠急性移植物抗宿主疾病(aGVHD)模型,对小分子化合物(J2)体内免疫抑制活性进行初步评价.方法:以近交系C57BL/6(H-2Kb)小鼠作为供者,BALB/c(H-2Kd)小鼠作为受者,给予受者鼠8 Gy 60 Co全身照射.4～6 h后行骨髓细胞与脾细胞移植.通过对受体鼠基因型的检测、aGVHD发生的基本特征、生存期以及器官组织的病理学分析,对J2可能的预防或治疗作用做初步评估.结果:建立的异基因骨髓移植动物模型具有aGVHD的基本特征,可用于免疫抑制化合物的体内评价.与未给药对照相比,J2口服喂药能够有效延长aGVHD小鼠的生存时间,并能减轻aGVHD所导致的皮肤、肝、小肠以及脾脏等组织病理损伤,呈一定的剂量依赖效应.结论:小分子化合物J2在体内具有一定的免疫抑制功能.     

shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中的长期高效表达

目的构建在小鼠造血干细胞中高效表达的shRNA重组慢病毒载体并研究其在小鼠造血系统中的长期稳定表达。方法将p-CMV和重组并鉴定正确的p-SFFV慢病毒载体与辅助病毒载体PAX2和PMD2G混合后,采用磷酸钙方法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟慢病毒感染经流式细胞仪分选并体外培养的小鼠骨髓造血干细胞,分析其表达效率后,选取感染效率较高的p-SFFV慢病毒载体感染小鼠骨髓造血干细胞,并通过骨髓移植技术输入放射线照射后的小鼠体内。在移植后4周和9周分别获取小鼠外周血样本,移植后16周获取小鼠骨髓样本,分析供体细胞在小鼠体内的表达。结果成功重组了p-SFFV慢病毒载体并在小鼠骨髓造血干细胞中高效表达（感染效率72.4%）;骨髓移植实验表明,携带外源性shRNA的慢病毒载体可在小鼠造血系统内长期稳定表达（感染效率92%）。结论shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中可长期稳定表达。     

给照射小鼠移植长期培养的骨髓细胞

试图以除去T细胞的骨髓移植而形成同种H-2不相配的小鼠骨髓嵌合体研究已取得明显进展。一些实验,移植经抗Thy~(-1),2处理的骨髓,可使照射小鼠活存几乎达到100%(>100天)。但有人使用不同品系小鼠为供、受体时则同种小鼠骨髓移植后8周以上的活存率仅5%。动物不是死于抗宿主病,而是死于骨髓未移植成活或由于嵌合体缺乏免疫机能所致。作者曾移植长期培养的造血细胞并形成了同种移植的嵌合体。长期培养可使小鼠骨髓在体外能维持CFU—S的生长、分化和成熟,使祖细胞、成熟中性粒细胞、具有吞噬功能的单核细胞和巨核细胞增加至20周以上。只有当起细胞诱导环境作用的贴壁层细胞存在的条件下,体外造血才能形成。体外培养中粒系细胞能迅速生长,可是用核型分析或功能测试方法,既