人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012) pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力.结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体.     

人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞(hDCs)信号传导通路抑制因子1(SOCS1)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因(NM-0037),筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(含U6启动子和EGFP)连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

缺氧对人牙周膜细胞增殖、迁移能力及IGF-1表达的影响

目的：探讨缺氧对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）生物学活性的影响。方法：选择第5代hPDLCs,在严重缺氧（1% O2）、轻度缺氧（5% O2）和常氧（21% O2）3种环境下培养,用MTT法评价细胞增殖率,用倒置显微镜观察细胞形态变化,细胞划痕试验评价细胞迁移能力,用免疫荧光染色染色研究细胞中低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）的表达及分布情况,用RT-PCR及Western blot检测HIF和IGF-1在不同氧浓度环境下的mRNA及蛋白表达水平。结果：①与正常hPDLCs相比,在1% O2浓度下,hPDLCs的数量在一个显微镜视野下明显减少,排列稀疏,结构发生改变。②hPDLCs的增长速率随着氧浓度的下降而减少,氧气浓度越低,增殖速率越慢。③在划痕处理后72 h,在3组不同氧浓度下,hPDLCs均向划痕区域迁移,但严重缺氧组的移动速率明显小于轻度缺氧和常氧组（划痕72 h：1% O2组0.917±0.023,5% O2组0.742±0.046,21% O2组0.453±0.039,F=530.237,P=0.002）。④HIF/DAPI染色结果显示在常氧条件下,HIF-1主要表达在细胞质中,随着氧气浓度降低,HIF逐渐转移至细胞核内。结论：缺氧能够抑制人牙周膜细胞的增殖和迁移能力,改变hPDLCs的形态。在缺氧条件下,HIF从细胞质转移到细胞核中,HIF和IGF-1的表达增加,提示缺氧微环境对人牙周膜细胞的生物学活性有一定影响。     

TNF-α刺激人牙周膜细胞表达MMP-9的研究

  目的 研究TNF-α对hPDLCs表达MMP-9的影响。方法 分别以1、2、5ng/mL浓度的TNF-α刺激hPDLCs 24h,以及2ng/mL浓度的TNF-α刺激hPDLCs 6h、12h、24h、48h,应用ELISA法测定细胞上清液中MMP-9的表达水平。结果 随着TNF-α浓度增大和作用时间延长,hPDLCs表达MMP-9均增加。结论 TNF-α能够以时间和剂量依赖的方式增强hPDLCs表达MMP-9。     

FGF2基因转染人牙周膜细胞及其稳定表达和鉴定

目的探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibrobbst growth factor,FGF2)基因在人牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)获得稳定表达的可能性。方法提取重组真核表达栽体pcDNA3-FGF2利用细胞培养和细胞基因转染技术体外转染pcDNA3-FGF2基因至PDLCs；利用免疫组化SABC法和免疫印迹杂交技术检测细胞转染4周后FGF2基因的表达情况。结果免疫细胞化学证实转染与未转染细胞均在胞浆内表达FGF2，免疫印迹杂交结果显示转染前后均表达17KD FGF2，但转染后表达量增高。结论在脂质体的介导下。重组真核表达载体pcDNA3-FGF2能够转染PDLCs并获得稳定表达。     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

靶向人Bax inhibitor-1的siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建靶向人Bax inhibitor-1的siRNA表达质粒.方法:借助siRNA设计工具,确定Bax inhibitor-1编码序列中4个可能的干扰位点,人工合成4对正反义脱氧寡核苷酸链(B1、B2、B3、B4),定向克隆至真核表达质粒pmU6,得质粒pmU6-B1、pmU6-B2、pmU6-B3、pmU6-B4.将重组质粒转染DH5α,PCR法筛选阳性克隆,DNA测序法检测插入序列的正确性.结果与结论:PCR和DNA测序结果证实各重组质粒的插入序列完全正确.靶向人Bax inhibitor-1的siRNA表达质粒构建成功.     

IL-6对牙周膜成纤维细胞分泌肌动蛋白的影响

目的探讨白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)对人牙周膜细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPLFs)合成肌动蛋白(actin)的影响。方法取体外培养的第5代HPLFs,分别用0 ng/ml(对照),0.1,1,10,100 ng/ml浓度的IL-6干扰48 h后应用免疫细胞化学方法观察细胞胞质中actin的合成情况。结果与对照组相比,HPLFs中actin的表达在1-100ng/ml IL-6干预后都明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 IL-6有抑制HPLFs合成肌动蛋白的作用。     

小型猪牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的:体外分离培养小型猪牙周膜细胞,为建立小型猪体内实验动物模型及进行牙周组织再生的研究奠定实验基础.方法:无菌拔除小型猪上下颌4颗切牙及4颗尖牙,采用组织块法原代培养小型猪牙周膜细胞并传代,绘制生长曲线,通过形态学和免疫组织化学染色方法对其进行鉴定.结果:组织块法成功培养小型猪牙周膜细胞,培养成功率为50%,其中切牙...     

表达人骨形成蛋白2的成纤维细胞系的建立与鉴定

目的:建立能稳定表达BMP2的成纤维细胞系.方法:运用阳离子聚合物转染试剂,将含有人BMP2基因的真核表达载体pcDNA3.1-B2导入NIH3T3细胞,通过G418筛选获得阳性细胞克隆,RT-PCR、免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BMP2基因的稳定转染和蛋白表达.结果:转染细胞内有BMP2mRNA的转录,胞内及胞外有BMP2蛋白的表达.结论:采用阳离子聚合物转染法可成功地将外源性hBMP2基因导入NIH3T3细胞,为进一步研究诱导牙周膜细胞骨化分化建立基础.     

人ClC-2基因小分子干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建靶向人ClC-2基因小分子干扰RNA（siRNA）真核细胞表达载体。方法：根据DEQOR提供的siRNA设计原则和程序，设计两个靶向ClC-2基因的发夹状siRNA；通过化学合成的方法合成两对分别互补的寡核苷酸链，退火后得到编码该siRNA的ClC-2基因片段。将该片段连接至经BglⅡ和HindⅢ双酶切的真核细胞表达载体pSUPER．puro的多克隆位点，转化扩增提取质粒；对重组质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。脂质体Lipofectamine^TM2000介导瞬时转染，通过RT-PCR检测人胶质瘤细胞系BT-325细胞中ClC-2mRNA表达。结果：经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定，目的片段与真核细胞表达载体pSUPER．puro连接正确。转染两重组质粒细胞的ClC-2mRNA表达明显降低。结论：成功构建人ClC-2基因干扰真核表达载体2个。分别命名为pSUPER．puro-siClC-21和pSUPER．puro-siClC-22，可用于进一步研究ClC-2基因对人胶质瘤侵袭和迁移活动的影响。     

人睾丸特异表达基因TDRG1shRNA表达载体的构建及其表达

目的:构建人睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达质粒, 并研究其在NTE-2 细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1 基因的寡核苷酸, 经退火成双链, 克隆至载体pGPU6/GFP/Neo 中, 构建TDRG1shRNA 表达载体, 得到重组质粒TDRG1-shRNA486, TDRG1-shRNA738, TDRG1-shRNA921 和一个阴性对照, 使用Lipofectamine^TM 2000 转染shRNA 至NTE-2 细胞, 应用RT-PCR 法检测转染后NTE-2 细胞TDRG1 mRNA 的表达水平。结果:经测序证实, 插入的DNA 片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486 的NTE-2 细胞TDRG1 基因的mRNA 表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达载体, TDRG1-shRNA 在NTE-2 细胞内成功表达。     

人牙周膜干细胞的分离培养及鉴定

目的:探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法:体外分离培养人牙周膜细胞,光镜下及HE染色鉴定细胞形态学特征。免疫组化法检测波形蛋白、角蛋白、CD44的表达。成骨诱导法培养人牙周膜干细胞向成骨细胞分化。结果:体外成功分离培养人牙周膜干细胞。角蛋白阴性表达,波形蛋白阳性表达,CD44阳性表达。诱导成骨结果显示人牙周膜干细胞具有潜在的多向分化潜能。结论:人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为成骨样细胞,具有多向分化的潜能。     

人牙周膜细胞在弹性牵张力作用下核心结合因子的表达

目的：探讨人牙周膜细胞在张应力作用下的成骨特性和核心结合因子(coxe—bindingfactoral，cbfal)在正畸成骨中的作用机制．方法：人牙周膜细胞体外原代培养，弹性膜及体外培养细胞加载系统加载弹性牵张力，免疫组化方法检测cbfal多克隆抗体在人牙周膜细胞的表达．结果：未加力的正常人牙周膜细胞cbfal抗体检测为阴性，弹性牵张力作用下人牙周膜细胞有cbfal阳性表达．结论：弹性牵张力可以诱导人牙周膜细胞向成骨样细胞分化；cbfal可能是正畸成骨的调控途径之一。     

bFGF对牙周膜细胞合成纤维连接蛋白的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人牙周膜细胞(PDLF)合成纤维连接蛋白(Fn)的影响. 方法 取体外培养的PDLF,按加入的bFGF终浓度分为0 ng/ml(对照),1 ng/ml,10 ng/ml,50 ng/ml,100 ng/ml bFGF五组,继续培养72 h后应用免疫细胞化学方法 观察细胞胞质中Fn的合成情况. 结果 与对照组相比,PDLF中Fn的表达在1-100 ng/ml bFGF都明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05),其中在10-50 ng/ml bFGF时增加水平最为显著,达到最佳效果. 结论 bFGF有促进PDLC合成纤维连接蛋白的作用.