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相似文献
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1.
目的:研究胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞的影响.方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的兔关节软骨细胞,在单层培养条件下增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养,另一组在进行三维培养的同时,在培养液中加入IGF-Ⅰ 50 ng/ml,绘制各组细胞生长曲线,并与单层培养对照组细胞进行比较.将培养细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学检测,H-E染色观察细胞形态.进行不同浓度IGF-Ⅰ作用下的三维培养软骨细胞MTT检测,观察0、25、50、75、100 ng/ml IGF-Ⅰ对三维培养软骨细胞各时间点的促增殖作用.结果:IGF-Ⅰ可明显刺激三维培养条件下关节软骨细胞增殖及集落形成;不同浓度的IGF-Ⅰ均可促进关节软骨细胞增殖,以50 ng/ml浓度时D490值最高.培养6周后从凝胶体系中收获细胞的软骨特异性Ⅱ型胶原表达水平较转入三维体系前未见降低.结论:IGF-Ⅰ可明显刺激藻酸盐三维培养条件下的关节软骨细胞增殖及集落形成,且细胞表型稳定.  相似文献   

2.
【目的】研究胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )和透明质酸 (HA)联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响 ,判断其稳定软骨细胞表型的效果。【方法】分离培养人关节软骨细胞 ,从第 4代开始 ,用hIGF Ⅰ和HA联合培养 ,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化及RT PCR判断联合培养第 8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第 6代细胞为对照组。【结果】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡 ;RT PCR显示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性而Ⅰ型胶原mRNA表达阴性 ;甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒 ;Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化见 80 %~ 92 %的细胞染色呈阳性或强阳性 ,平均灰度分别为 85 92和 116 2 3,均显著低于对照组 ,说明处理组染色较对照组增强。【结论】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型 ,为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。  相似文献   

3.
IGF-1对成兔关节软骨细胞体外增殖的影响   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的研究单独应用胰岛素样生长因子1(IGF-1)对成兔的关节软骨细胞体外增殖的促进作用,为成人关节软骨的体外培养扩增的理论提供新思路。方法通过细胞形态学,细胞计数、细胞计量检测成兔关节软骨细胞的存活及增殖。结果成兔关节软骨细胞增殖活跃。结论在IGF-1的单独作用下成兔关节软骨细胞在体外增殖能力明显增强。  相似文献   

4.
滑膜间充质干细胞软骨分化能力的实验研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 探讨滑膜间充质干细胞软骨分化能力.方法 无菌状态下获取兔颞下颌关节滑膜组织,酶消化法进行滑膜间充质干细胞原代培养,并进行传代扩增.第3代细胞消化后离心成为细胞团块,用软骨诱导液培养,并以鸡尾酒法添加生长因子人重组转化生长因子β1(recombined human transforming growth factorβ1,rhTGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),即前3天2种生长因子共同使用,之后只用rhTGF-β1继续培养18d.细胞团块培养21 d后,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达.细胞团块培养在普通培养基中不添加rhTGF-β1和bFGF作为对照组.结果 滑膜间充质干细胞经过传代培养后,成为形态一致的梭形细胞;细胞团块经软骨诱导液、rhTGF-β1和bFGF培养后,免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原在细胞之间的细胞外基质中明显显色,并且细胞团块的周边要比中央浓染;原本二维培养状态下的梭形滑膜间充质干细胞变为球形的软骨样细胞形态.结论 滑膜间充质干细胞具有很强的成软骨能力,可以作为髁突软骨组织工程的种子细胞.  相似文献   

5.
黄建荣  刘尚礼等 《中山医科大学学报》2002,23(6):419-422,426,T002
目的:研究胰岛素样生长因子I(IGF-I)和透明质酸(HA)联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响,判断其稳定软骨细胞表型的效果。方法:分离培养人关节软骨细胞,从第4代开始,用hIGF-I和HA联合培养,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、II型胶原和aggrecan免疫组化及RT-PCR判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第6代细胞为对照组。结果:IGF-I和HA联合培养的第8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡;RT-PCR显示II型胶原mRNA表达阳性而I型胶原mRNA表达阴性;甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒;II型胶原和aggrecan免疫组化见80%-92%的细胞染色呈阳性或弱阳性,平均灰度分别为85.92和116.23,均显著低于对照组,说明处理组染色较对照组增强。结论:IGF-I和HA联合培养的第8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型,为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。  相似文献   

6.
目的 对比不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对国产多孔钽-软骨细胞复合物维持软骨细胞表型和去分化作用的影响.方法 分离培养3周龄新西兰幼兔膝关节软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、番红O (Safranin O)染色鉴定软骨细胞;取第3代软骨细胞分为5组:A组(1 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞),B组(10 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞),C组(50 ng/mL bFGF-多孔钽软骨细胞),D组(多孔钽-软骨细胞)及E组(软骨细胞);MTT法检测不同浓度bFGF对多孔钽-软骨细胞生长及增殖状态的影响;扫描电镜观察bFGF-多孔钽-软骨细胞复合物细胞形态及生长;Ⅰ、Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ型胶原免疫细胞化学染色检测软骨细胞表型变化及去分化状态;real time-PCR检测软骨细胞Ⅱ、Ⅹ型胶原mRNA表达.结果 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色及Safranin O染色均呈阳性反应,证实所分离培养的细胞为软骨细胞;1、10、50 ng/mL bFGF均可促进软骨细胞增殖,各实验组(A~D组)软骨细胞增殖与对照组(E组)相比,差异有统计学意义,其中10 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞增殖最为明显(P<0.05);组间比较差异有统计学意义(P<0.05);扫描电镜观察:各组软骨细胞在多孔钽表面及孔隙内生长、黏附,早期呈不等的球形,24 h后胞质延展并向周围伸出多条突起,相互连接、延展向孔隙内部生长,细胞间相互融合并覆盖支架材料;Ⅰ、Ⅱ、Ⅸ和Ⅹ型胶原免疫细胞化学染色显示10 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞组(B组)Ⅱ和Ⅸ型胶原表达高于对照组(E组,P<0.05),组间差异也有统计学意义(P<0.05);而Ⅰ和Ⅹ型胶原表达则低于对照组(E组,P<0.05);real time-PCR检测软骨细胞Ⅱ、Ⅹ型胶原mRNA表达显示:各实验组(A~D组)Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组(E组,P<0.05),而Ⅹ型胶原mRNA表达量则低于对照组(E组,P<0.05).结论 bFGF能维持多孔钽-软骨细胞复合物软骨细胞表型,抑制去分化,加强软骨细胞分泌功能.  相似文献   

7.
目的观察携带有绿色荧光蛋白(gree fluorescent protein,GFP)标记的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)cDNA转染兔软骨细胞后的主要生物学特性。方法取兔膝关节软骨细胞体外培养至第二代,HGFcDNA转染软骨细胞,空白质粒组为对照组;噻唑蓝(MTT)检测软骨细胞的增殖能力,SABC免疫组化及原位杂交法测其Ⅱ型胶原在转染前后的变化与mRNA的表达。结果软骨细胞在转染后可较长时间的保持其软骨细胞的生物学特性,并可促进软骨细胞的增殖,SABC免疫组化测第VI代软骨细胞的Ⅱ型胶原表达仍呈强阳性,而对照组软骨细胞则明显减弱,说明HGF基因转染软骨细胞后可表达其生物学功能。基因瞬间转染率大约为31.23名。结论GFP标记的HGF基因以脂质体为载体转染兔膝关节软骨细胞后可发挥其生物学功能,加速细胞的生长,在荧光显微镜下可直观的计算软骨细胞的瞬间转染率。  相似文献   

8.
目的使用特定细胞因子刺激诱导分离扩增后的兔骨髓间充质干细胞(Mesenchynml stem cells,MSCs),在体外试验中使其分化为软骨细胞,为后续构建工程化半月板研究提供种子细胞,探讨兔MSCs重建半月板组织的可行性和有效性。方法用碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)和转化生长因子β1(Transforming growth factor-βl,TGF-β1)协同刺激已分离并经体外传代培养扩增的兔MSCs,通过倒置细胞显微镜观察及免疫组化检测,证明其已经向软骨细胞系分化。结果用bFGF和TGF-β1协同刺激已分离并经体外扩增的兔MSCs后,细胞生长速度增快,免疫组织化学检测提示向软骨细胞系分化。结论兔MSCs可向软骨细胞分化;bFGF和TGF-β1能加快MSCs的体外增殖并促使其向软骨细胞系分化,可为构建工程化半月板提供理想的自体来源种子细胞。  相似文献   

9.
目的:观察成纤维细胞生长因子(FGF)对培养兔关节软骨细胞基质及转化生长因子β1(TGFβ1 )表达的影响。方法:培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞,在每次换液时加入FGF100 ng/m l,铺满后收集细胞,作关节软骨细胞TGFβ1检测及电镜免疫组织化学观察。采用氯胺T法和Antonopoulos法,作细胞基质的胶原和蛋白多糖含量测定。结果:FGF能明显促进胶原和蛋白多糖的合成,并且与剂量、时间呈正相关(P< 0.01)。光镜下实验组细胞明显呈棕色,电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒粘附。结论:FGF能促进关节软骨细胞TGFβ1 的表达及基质合成,推迟了关节软骨细胞的成熟,维持细胞的软骨表现型,这些作用有利于关节软骨损伤后的修复,可能具有一定的临床意义。  相似文献   

10.
周叶  高越  王晓楠  朱立  厉蓓 《浙江医学》2017,39(23):2101-2105
目的验证体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔软骨细胞的可行性,探讨凋亡及抗凋亡基因在软骨细胞传代中的变化,寻找关节软骨退变老化研究的最适宜靶细胞。方法在无菌条件下取6周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养;形态学观察时采用甲苯胺蓝染色法对关节软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测P0~P4代软骨细胞烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)、信息沉默因子1(Sirt1)、p53、Bax基因的mRNA相对表达量,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各代关节软骨细胞增殖情况。结果显微镜下观察兔原代软骨细胞大多呈透亮椭圆形、短梭形、多角形特征,72h全部贴壁生长。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色,细胞核染成深蓝色;前3代软骨细胞表型稳定,增殖力良好;连续培养至P4代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。随着软骨细胞的传代,NAMPT的表达量逐渐下调。与P0代软骨细胞相比,Sirt1的表达量在P1代细胞中明显上调,在P2代细胞急剧下降至P0代以下,在P3~P4代细胞中Sirt1的表达量逐渐下调。凋亡基因p53和Bax的表达量随着软骨细胞的传代而上调。前3代软骨细胞增殖差异无统计学意义(均P>0.05);在培养到第4~7天时,P1~P3代与P4代软骨细胞增殖差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞是切实可行的。随着软骨细胞的传代,抗凋亡基因NAMPT、Sirt1的表达逐渐下调,凋亡基因p53、Bax的表达逐渐上调。P1~P3代关节软骨细胞作为研究关节软骨凋亡的细胞体系是合适的。  相似文献   

11.
目的:以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法:取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果:体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论:用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。  相似文献   

12.
目的:通过诱导兔骨髓间充质干细胞(MSCs),观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法:纯化兔骨髓间充质干细胞;用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞;以MTT测定诱导细胞的增殖活性;免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达;诱导后的细胞移植于白兔膝关节内,X线摄片观察软骨修复形成情况。结果:诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高,移植后效果明显。结论:兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。  相似文献   

13.
目的:研究碱性成纤维细胞因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)在单一和联合应用时,对体外培养关节软骨细胞增殖的影响,初探符合组织工程需要的合适浓度的bFGF与TGF-β1的组合。方法:第四代幼兔关节软骨细胞,以bFGF(1,5,10ng/m1)或TG-β1(0.1、0.5、1.0ng/m1)及bFGF(10ng/m1)+TGF-β1(1ng/m1)的单独和联合刺激组为实验组,以常规培养组为对照组,通过Cell Titer96AQueous单溶液细胞增殖分析法测定细胞增殖效应。结果:单独应用时,10ng/ml的bFGF和1ng/ml的TGF-β1。分别为各自最有效的促增殖浓度(P〈0.01);以此浓度联合刺激条件下的细胞增殖活性与对照组及单因子浓度组相比,均有显著升高(P〈0.05)。结论:合适浓度的bFGF与TGF-β1联合使用,能有效促进体外培养软骨细胞的增殖,有助于组织工程种子细胞问题的解决。  相似文献   

14.
目的:建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法:采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应(RT PCR)法观察其生物学特性.结果:通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论:本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.  相似文献   

15.
TGF-β1与IGF-Ⅰ对体外培养兔软骨细胞增殖的影响   总被引:9,自引:0,他引:9  
目的探讨转化生长因子-β 1(TGF-β 1)与胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)联合作用对关节软骨细胞增殖行为的影响.方法采用兔关节软骨细胞体外单层培养方法,将TGF-β 1与IGF-Ⅰ作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨多因子对关节软骨细胞增殖行为的影响.结果(1)TGF-β 1组的最佳效应浓度为5 μg/L,IGF-Ⅰ组的最佳效应浓度为50 μg/L.(2)TGF-β 1组(5 μg/L)、IGF-Ⅰ组(50 μg/L)以及两因子联合使用组软骨细胞增殖均较对照组高(P<0.01),联合使用组促增殖作用最强,优于单一的TGF-β 1最佳效应浓度组和IGF-Ⅰ最佳效应浓度组(P<0.05).结论TGF-β 1与IGF-Ⅰ联合运用早期促软骨细胞增殖作用优于单一的TGF-β 1或IGF-Ⅰ,在软骨细胞增殖过程中TGF-β 1和IGF-Ⅰ有良好的协同作用.  相似文献   

16.
目的 探讨软骨细胞在体外传代培养过程中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体(FGFR)表达的变化趋势,以及它对软骨细胞增殖和细胞外基质(ECM)合成的影响。方法 采用猪耳软骨细胞在体外进行扩增传代,收集第1~6代的细胞样品行RT-PCR和Western blotting检测,从mRNA和蛋白水平来反映bFGF和FGFRs的表达。另取第1~6代软骨细胞,以含10ng/mL bFGF的培养液进行培养,比较其与空白对照组细胞在增殖速率和ECM合成等方面的差异。结果 bFGF、FGFR1和FGFR2在第1~3代软骨细胞中表达减少的趋势较为平缓;第4、5代时,有大幅的向下跃迁;在第6代时仅微量表达或消失。这一现象与体外培养软骨细胞增殖速率的下降相平行,第4代及以后代次细胞对bFGF刺激无反应。结论 bFGF和FGFRs表达的减弱与软骨细胞在体外培养过程中的老化进展可能有密切的关系。  相似文献   

17.
为探寻软骨损伤修复的理论依据 ,取新西兰幼兔关节软骨组织 ,经消化后将软骨细胞分别接种在含有bFGF和缺乏bFGF的培养液中进行培养 ,测软骨细胞对 [3H] 脯氨酸的摄取量 ,观察载玻片上单层细胞经Vangieson染色后的胶原形态和电镜下胶原的形态 ,观察在细胞汇合生长情况下 ,bFGF对软骨细胞表型表达的影响。结果 :在含有bFGF和缺乏bFGF培养基中生长的软骨细胞对 [3H] 脯氨酸的摄取量的对数值有明显差异 (P <0 .0 5) ;电镜下可见加入bFGF培养出的软骨细胞分泌的胶原比未加bFGF培养出的软骨细胞分泌的胶原排列有序 ;加入bFGF后汇合生长的细胞表型无变化 ,而缺乏bFGF软骨细胞发生成纤维细胞样变。提示 :bFGF可促进软骨细胞合成胶原 ,对维持汇合生长的软骨细胞正常表型有重要作用。  相似文献   

18.
目的观察IGF-Ⅰ、TGF-β1和BMP-2对培养兔关节软骨细胞增殖的作用.方法采用体外培养兔关节软骨细胞的方法,利用3H-TdR掺入反映软骨细胞增殖.结果 IGF-Ⅰ和TGF-β1均可促进软骨细胞3H-TdR掺入增加,并有一定的协同作用.而BMP-2对软骨细胞3H-TdR掺入无显著影响,但与TGF-β1和IGF-Ⅰ合用时却有抑制3H-TdR掺入的作用.结论生长因子之间的不同组合可以协同或拮抗方式影响软骨细胞的增殖,提示生长因子在关节软骨退变和防治上可能有重要的意义.  相似文献   

19.
目的探讨软骨细胞在体外传代培养过程中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体(FGFR)表达的变化趋势,以及它对软骨细胞增殖和细胞外基质(ECM)合成的影响.方法采用猪耳软骨细胞在体外进行扩增传代,收集第1~6代的细胞样品行RT-PCR和Western blotting检测,从mRNA和蛋白水平来反映bFGF和FGFRs的表达.另取第1~6代软骨细胞,以含10ng/mL bFGF的培养液进行培养,比较其与空白对照组细胞在增殖速率和ECM合成等方面的差异.结果 bFGF、FGFR1和FGFR2在第1-3代软骨细胞中表达减少的趋势较为平缓;第4、5代时,有大幅的向下跃迁;在第6代时仅微量表达或消失.这一现象与体外培养软骨细胞增殖速率的下降相平行,第4代及以后代次细胞对bFGF刺激无反应.结论 bFGF和FGFRs表达的减弱与软骨细胞在体外培养过程中的老化进展可能有密切的关系.  相似文献   

20.
吴义龙  庄科雄  王其友 《实用全科医学》2011,(8):1167-1168,F0003
目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子β1(TGF.B1)对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6~9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子(b—FGF)和转化生长因子(TGF.131)诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子(b—FGF)和转化生长因子(TGF—β1)作用下可被诱导分化为软骨样细胞。  相似文献   

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