ATP抑制不死化人成纤维细胞增殖信号转导机制的研究

目的:探讨ATP抑制不死化人成纤维细胞增殖信号转导机制。方法:观察0.4mmol/LATP与不死化人成纤维细胞共培养不同时间下,细胞内游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)和三磷酸肌醇(IP₃)浓度的变化特点和意义,以及分别应用Ca²⁺和K⁺通道拮抗剂时,细胞增殖率的改变。结果:ATP与不死化人成纤维细胞共培养时,[Ca²⁺]i明显升高,IP₃浓度明显降低(均P＜0.01)。分别应用Ca²⁺和K⁺通道拮抗剂时,细胞增殖率都显著增高(均P＜0.01)。结论:ATP抑制不死化人成纤维细胞增殖过程中有钙通道和钾通道以及IP₃的参与。     

ATP对人不死化成纤维细胞增殖及其细胞膜蛋白表达的影响

目的探讨ATP对不死化人成纤维细胞增殖及其细胞膜蛋白表达的影响。方法将正常人TIG-7和0UMS-36细胞株，不死化人KMST-6和SUSM-1细胞株在不同浓度的ATP，ADP，AMP条件下分别进行24和96h的常规细胞培养，观察存活细胞数目，DNA的合成和[     

ATP对人不死化成纤维细胞增殖及其细胞膜蛋白表达的影响

目的：探讨ATP对不死化人成纤维细胞增殖及其细胞膜蛋白表达的影响。方法：将正常人TIG-7和OUMS-36细胞株,不死化人KMST-6和SUSM-1细胞株在不同浓度的ATP、ADP、AMP条件下分别进行24和96 h的常规细胞培养,观察存活细胞数目,DNA的合成和[³²P]-ATP标记膜蛋白的表达。结果：培养96 h后,0.4 mmol/L ATP对不死化细胞KMST-6的抑制率为77%且DNA合成明显地被抑制,而正常OUMS-36细胞抑制率为41%且DNA合成无明显改变。在1 mmol/L ATP时,多数KMST-6细胞发生死亡,而正常OUMS-36细胞的增殖无明显影响。当ADP、AMP和腺苷或磷酸处理的细胞,仅有ADP处理的不死化细胞存活数目减少（P<0.01）。与正常细胞比较,不死化细胞30 kD、31 kD、33 kD和40 kD的[³²P]-ATP标记膜蛋白呈高表达。结论：ATP对不死化人成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用,并且使磷酸化细胞膜蛋白表达增高。     

ATP受体家族研究进展

目前已获得编码三磷酸腺苷（ＡＴＰ）受体的克隆基因。ＡＴＰ受体属于巳嘌呤类受体，它有许多亚型，它们各有自己的特点和作用。     

H_2S抑制ATP诱导的大鼠小胶质细胞活化及IL-1β的释放

目的:观察硫化氢(H_2S)供体硫氢化钠(Na HS)对三磷酸腺苷(ATP)损伤的大鼠小胶质细胞通透性、胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)及IL-1β释放的影响,探讨H_2S对ATP-P2X嘌呤信号通路的作用及其神经保护的分子机制。方法:取对数期形态结构及生长分化良好的大鼠小胶质细胞用于实验。Fura-2/AM荧光染料检测各组[Ca~(2+)]_i,细胞内YO-PRO-1荧光强度检测以反映膜的通透性,ELISA检测ATP-细菌脂多糖(LPS)激活的大鼠小胶质细胞IL-1β的释放水平。结果:随着ATP浓度的增加,大鼠小胶质细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加,而给予Na HS预处理后细胞膜通透性明显降低,对YO-PRO-1的摄取明显减少(P0.05),胞内荧光强度明显减弱(P0.05)。ATP处理大鼠小胶质细胞引起[Ca~(2+)]_i迅速升高后缓慢下降形成持续时间较长的平台期。Na HS预处理虽不能改变[Ca~(2+)]_i的峰值,但可抑制平台期的形成(P0.05)。ATP与LPS联合作用可促进大鼠小胶质细胞IL-1β的生成和分泌,而Na HS预处理可明显逆转这一效应(P0.05)。结论:Na HS可降低ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜通透性、Ca~(2+)内流和IL-1β释放,抑制该细胞的激活,提示嘌呤信号通路可能介导H_2S的细胞保护作用。     

孕酮减轻ATP诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的:探讨孕酮对抗腺苷三磷酸(ATP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用和机制。方法:取对数生长期的SH-SY5Y细胞按照孕酮或ATP浓度的不同进行分组,CCK-8法检测细胞存活率,YO-PRO-1染色检测细胞膜通透性,Fluo-3染色检测细胞内Ca~(2+)浓度的变化,Western blot法检测嘌呤能P2X_7受体表达的变化。结果:与对照组相比,不同浓度(1、3、5和7 mmol/L)ATP作用2 h,SH-SY5Y细胞存活率显著降低(P0.05),细胞摄入YO-PRO-1的荧光强度明显增加(P0.05),且呈剂量依赖性。浓度为3、10和30 nmol/L的孕酮预孵育30 min可减轻ATP损伤作用,细胞存活率较单纯ATP组明显升高(P0.05或P0.01)。孕酮(30nmol/L)或P2X_7受体拮抗剂KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min均可显著抑制ATP诱导的胞内YO-PRO-1的荧光增强(P0.01),而孕酮和KN-62两者之间没有明显差异。正常组细胞内钙离子含量少,ATP组细胞内钙离子荧光强度较对照组明显增高(P0.05),孕酮(30 nmol/L)或KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min可明显降低(P0.05)ATP诱导的胞内钙荧光增强,而孕酮和KN-62两者之间的作用无明显差异。ATP组SH-SY5Y细胞P2X_7受体表达较对照组明显增加(P0.05),而孕酮(30 nmol/L)预孵育30 min则可显著降低ATP诱导的P2X_7受体表达(P0.05)。结论:孕酮可抑制ATP诱导的P2X_7受体表达、膜孔形成和胞内Ca~(2+)升高,降低细胞死亡率,明显减轻高浓度ATP对SH-SY5Y细胞的损伤作用。     

硫化氢保护被ATP损伤的PC12细胞

目的:观察硫化氢的供体硫氢化钠(Na HS)对三磷酸腺苷(ATP)诱导的PC12细胞活力、胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)及膜通透性的变化,探讨硫化氢神经保护作用的嘌呤信号机制。方法:将对数生长期高分化的PC12细胞,随机分为4组,分别为(1)正常对照组:常规培养,不进行ATP处理;(2)ATP组:接种细胞24 h后ATP处理;(3)Na HS+ATP组:Na HS预先孵育30 min后再用ATP处理,并且Na HS始终存在于反应体系中;(4)KN-62(P2X7受体阻断剂)+ATP组:KN-62预先孵育30 min,其余同Na HS+ATP组。MTT检测各组细胞活力,Fura-2/AM荧光染料检测各组[Ca2+]i,检测荧光染料YO-PRO-1的相对荧光单位以反映膜的通透性。结果:(1)0.3mmol/L ATP对细胞活力无影响,但1、3、5、10 mmol/L ATP则呈浓度依赖式明显降低细胞活力,200μmol/L Na HS干预可明显逆转ATP引起的细胞活力下降(P0.05),而800μmol/L Na HS预处理则加剧ATP对PC12细胞的损伤(P0.05)。(2)ATP处理PC12细胞会引起[Ca2+]i迅速升高并且呈浓度依赖性,Na HS预处理能对抗ATP引起的[Ca2+]i升高(P0.05)。(3)随着ATP浓度的增加及作用时间的延长,PC12细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加,Na HS预处理可明显减少细胞对YO-PRO-1的摄取(P0.05)。结论:硫化氢可保护ATP损伤的PC12细胞,可能与其抑制[Ca2+]i升高和YO-PRO-1荧光增强有关。     

外源性ATP诱导PC12细胞的膜孔形成

 目的：探讨外源性三磷酸腺苷(ATP)诱导PC12细胞的膜孔形成及关键分子靶标。方法：用不同浓度的ATP处理培养的PC12细胞,采用倒置相差显微镜观察形态,CCK-8法检测细胞存活率,YO-PRO-1染色检测细胞膜通透性,Western blotting和real-time PCR检测P2X7 受体和pannexin 1（Panx1）表达的变化。结果：（1）ATP（1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L）作用3 h,可见随着ATP浓度升高,PC12细胞变圆,脱壁细胞增多;当ATP浓度为3 mmol/L或5 mmol/L时,PC12细胞活力较对照组显著下降（P<0.05）。（2）不同浓度的ATP（0、1、3、5 mmol/L）作用1 h,PC12细胞摄入YO-PRO-1的荧光强度随着浓度增加而增加;同一浓度的ATP作用不同时间（15、30、60 min）,随着时间的增加,胞内的荧光强度也增加。（3）亮蓝G（P2X7受体的抑制剂）预处理可明显拮抗ATP引起的细胞活力下降和胞内荧光强度增强（P<0.05）,而生胃酮（Panx1的抑制剂）预处理不改变细胞活力和胞内的荧光强度（P>0.05）。（4）ATP作用3 h使PC12细胞 P2X7受体的mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）,而Panx1 mRNA和蛋白表达变化不大（P>0.05）。结论：胞外高浓度ATP引起PC12细胞的膜孔形成可能主要与P2X7受体的表达和激活有关。     

疼痛研究的新靶点-P2受体

嘌呤与嘧啶受体(P受体)分为P1和P2受体两大类,P2受体包括P2X和P2Y受体.P2X进一步可分为P2X1,P2X2,P2X3,P2X4,P2X5,P2X6和P2X7亚型.P2X3受体在感觉神经元中高度表达,在痛觉中发挥重要作用,异聚体P2X2/3受体也涉及疼痛;P2Y受体的某些亚型在感觉神经元中高度表达,与痛觉有关.P2受体通过与其内源性配体核苷酸结合,参与机体组织器官多种功能的调节,在疼痛病理状态下(如神经病理性痛、急性疼痛、炎性痛及内脏痛等)发挥着重要的作用.P2受体有可能成为疼痛研究的新靶点.     

H_2S对ATP诱导小胶质细胞活化的影响

目的:研究硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)对三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)诱导大鼠小胶质细胞炎性因子释放的调节,并探讨小胶质细胞条件培养基对神经元样细胞凋亡的影响。方法:选定的大鼠小胶质细胞随机分4组:(1)正常对照组:常规培养;(2)ATP组:细胞接种24 h后用ATP处理;(3)Na HS(sodium hydrosulfide,H_2S供体)+ATP组:ATP处理前用Na HS预孵育30 min,且Na HS始终存在于反应体系中;(4)KN-62(异喹啉衍生物,嘌呤受体拮抗剂)+ATP组:ATP处理前用KN-62预孵育30 min。用ELISA检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-6的变化,用Western Blot检测各组丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)P38和JNK表达水平。用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)研究条件培养基对神经元的影响,其方法与上述大鼠小胶质细胞处理相同。用倒置显微镜观察SH-SY5Y细胞形态变化及凋亡情况,用MTT法检测各组细胞活力。结果:当ATP浓度3 mmol/L时,大鼠小胶质细胞释放TNF-α和IL-6水平增加(P0.05),同时上调大鼠小胶质细胞p-P38、p-JNK蛋白表达水平(P0.05)。当ATP浓度5 mmol/L时,小胶质细胞活化后的条件培养基可以使SH-SY5Y细胞形态发生改变,其细胞活力降低(P0.05)。ATP引起的上述变化可以通过Na HS预处理而逆转(P0.05),其作用与P2X7R阻断剂KN-62相类似。结论:H_2S可下调被ATP诱导的p-P38和pJNK MAPK蛋白表达,减少TNF-α和IL-6等炎性因子的释放,从而对神经元产生保护作用。     

ATP对人不死化成纤维细胞DNA的合成、膜蛋白表达及离子通道的影响

目的：探讨ATP抑制不死化人成纤维细胞增殖过程中对其DNA合成，细胞膜蛋白的表达以及离子通道的影响，方法：将正常人TIG－7和OUMS－36细胞株，不死化人KMST－6和SUSM－1细胞株在不同浓度的ATP，ADP，AMP条件下分别进行24和96h的常规细胞培养，观察存活细胞数目，DNA的合成，[32P]ATP标记膜蛋白的表达以及不死化KMST－6的细胞分别在无钙离子培养基和应用Ca^2 和K^ 通道拮抗剂时，细胞增殖率的改变，结果：培养96h后，0．4mmol/L ATP对不死化细胞KMST－6的抑制率为77％，且DNA合成明显地被抑制，而正常OUMS－36细胞抑制率为41％，且DNA合成无明显改变，在1mmol/L ATP时，多数KMST－6细胞发生死亡，而正常OUMS－36细胞的增殖无明显影响，当ADP，AMP和腺苷或磷酸处理的细胞，仅有ADP处理的不死化细胞存活数目减少（P＜0．01），与正常细胞比较，不死化细胞30，31，33和40kD的[^32P]-ATP标记膜蛋白呈高表达，0．4mmol/L ATP与KMST－6细胞共培养时分别加入Ca^2 以及K^ 通道拮抗剂，这些药物在某种程度上可以降低ATP的增殖抑制作用，当ATP处理的细胞液中无钙离子时，它们的增殖不受影响。结论：ATP对不死化人成纤维细胞的DNA合成有明显的抑制作用。并且使磷酸化细胞膜蛋白的表达增高，其过程中有钙通道和钾通道的参与。     

不同转移能力的人前列腺癌细胞亚系中p38和c-Jun氨基末端激酶激活机制

目的：研究P2嘌呤受体激动剂ATP对不同转移性的人前列腺癌细胞亚系1E8和2B4的p38和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号传导途径的影响。方法：以常规的蛋白免疫印迹法,用特异识别双磷酸化p38和JNK的特异性抗体,检测活化的（磷酸化的）p38和JNK。结果：外源性ATP以时间和量依赖性的方式激活细胞内的P38,并且在高转多性的1E8细胞中ATP诱导的p38活化水平明显高于不转移的2B4细胞,但是在ATP的作用下JNK未见明显激活,P2嘌呤受体拮抗剂苏拉明显高于不转移的2B4细胞,但是在ATP的作用下ＮＪＫ未见明显激活,P2嘌呤受体拮抗剂苏拉明显高于不转移的2B4细胞,但是在ATP的作用下JNK未见明显激活,P2嘌呤受体拮抗剂苏拉明（suramin)和P38抑制剂SB 203580均可有效抑制ATP对P38的激活,抑制率分别为,1E8 83％和79％,2B4 81％和69％,两细胞亚系中,G蛋白调节剂百日咳毒素均未明显影响ATP对P38的激活,结论：细胞外ATP在恶性肿瘤细胞中能够诱导激活P38信号通路,且P38激活水平在转移性不同的前列腺癌细胞亚系间存在差异,我们的研究为恶性肿瘤细胞生长及转移机制研究提供了有效线索。     

Growth inhibitory effects of ATP and its derivatives on human fibroblasts immortalized with 60Co-gamma rays

In our previous study (Katayama B et al, Int J Mol Med 2: 603-606, 1998), cell growth inhibition caused by ATP added to cultures was found to be greater in immortalized human fibroblasts than in the normal human fibroblasts. Since it has been reported that ATP affects cells via P2-purinergic receptors, growth inhibitory effects of ATP and its derivatives on immortalized human fibroblasts were investigated in the present study in order to learn what type of receptors are involved in ATP cytotoxicity. The ATP derivatives used in this study were: ATP, ADP, beta, gamma-methyleneadenosine 5'-triphosphate (MeATP), 2' & 3'-o-(4-benzoylbenzoyl) adenosine, triethylammonium salt (BzATP), adenosine 5'-o-(3-thiotriphosphate) (ATPgammaS), 2-methylthioadenosine 5'-triphosphate (2-MeSATP) and UTP. The extent of cytotoxicity induced by these drugs was found to be in the order of: ATP=ADP>ATPgammaS>MeATP=BzATP. On the other hand, neither 2-MeSATP nor UTP showed any cytotoxicity. These findings indicate that ATP may exert the cell growth inhibition by certain kinds of signal transduction via P2x or P2y purinergic receptors which affect intrinsic channels/pores of cell membrane and/or G protein activation. As a result, intracellular elevation in the concentrations of ions such as calcium and potassium, membrane depolarization, loss of endogenous ions/metabolites, and activation of inositol phospholipid-specific phospholipase C may occur. Actually, a dihydropyridine calcium channel blocker, nifedipine, and an ATP-sensitive K+-channel blocker, glybenclamide, reduced the growth inhibitory effects of ATP on the cells to some extent. The growth inhibition caused by ATP was not due to apoptosis or induction of a cyclin/CDK kinase inhibitor, P21.     

三磷酸腺苷对N9小胶质细胞的损伤作用及其机制

目的:研究三磷酸腺苷(ATP)对N9小胶质细胞的损伤作用及其机制。方法:取对数生长期N9小胶质细胞,随机分为3组:(1)正常对照组:常规培养,不进行ATP处理;(2)ATP组:接种24 h后行ATP处理;(3)KN-62(P2X₇受体阻断剂)干预组:KN-62孵育30 min后行ATP处理,且KN-62存在于ATP作用整个过程。XTT法测各组N9小胶质细胞的活力;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞周期及凋亡;细胞免疫荧光检测P2X₇受体表达;Western blotting检测细胞P2X₇受体蛋白水平;ELISA检测细胞上清液中白细胞介素1β(IL-1β)含量。结果:500 μmol/L ATP和1 mmol/L ATP对细胞活力损伤程度较小,作用24 h后,细胞活力仍可达88.5%±5.5%和88.2%±8.4%。当ATP浓度达到或高于2 mmol/L时,细胞活力迅速降低,细胞发生皱缩,且随ATP作用时间延长,细胞活力逐渐降低,细胞密度逐渐减少,细胞皱缩程度加重,而KN-62干预后细胞活力较ATP组明显增多,细胞密度及形态明显好于ATP组。细胞周期及凋亡检测结果显示,ATP可使细胞周期阻滞于S期,细胞凋亡比例明显较对照组增多(P<0.01),KN-62干预可显著减轻ATP引起的细胞周期阻滞,细胞凋亡比例显著减少(P<0.01)。免疫荧光显示,ATP及KN-62干预对N9小胶质细胞上P2X₇受体的表达分布没有影响。Western blotting显示,正常对照组、ATP组及KN-62干预组间P2X₇受体蛋白水平没有明显差异(P＞0.05)。ELISA结果显示,ATP及KN-62干预对IL-1β的释放没有作用。结论:高剂量ATP可诱发N9小胶质细胞损伤,其机制可能与P2X₇受体介导的细胞周期阻滞和细胞凋亡有关,而与小胶质细胞的炎症反应无关。     

钙离子浓度变化对大鼠缺血心室致颤阈值的影响及其与cAMP、cGMP及ATP的关系

本文目的是观察不同钙离子浓度([Ca~(2 )])对急性局部缺血大鼠心脏室颤阈(VFT)的影响及其与心肌cAMP、cGMP和ATP含量变化的关系。结果表明,[Ca~(2 )]与缺血心脏VFT下降幅度呈正相关(r=0.7998,p<0.05);而[Ca~(2 )]与缺血心肌cAMP/cGMP比值、ATP含量则呈负相关(分别r=-0.887、r=-0.864,均p<0.05);缺血心脏VFT下降幅度与cAMP/cGMP比值亦呈显著负相关(r=-0.992,p<0.01),提示心肌细胞内游离Ca~(2 )水平可能是缺血心室易颤性(VV)的决定因素;cAMP水平或cAMP/cGMP比值则可能是通过影响Ca~(2 )内流而起作用的间接因素;而ATP贮量对缺血心脏VFT下降可能有一定保护作用。     

丁酸钠对食管永生化上皮细胞增殖、分化和凋亡的作用

目的 研究丁酸钠对永生化食管上皮的增殖、分化和凋亡的作用。方法 用HPV18E6E7诱发的人胚食管上皮永生化细胞株SHEE,培养在50ml培养瓶和24孔培养板,实验组分别加入1mmol/L和5mmol/L丁酸钠,对照组未加药,作用4d。统计细胞克隆数,细胞超微结构用电镜检查;细胞周期和凋亡细胞数用流式细胞仪检查;Ki-67、细胞角蛋白用免疫组织化学SP法检查;激光共聚焦扫描显微镜检查用鬼臼毒素标记的F-肌动蛋白。结果 加入1mmol/L和5mmol/L丁酸钠4d克隆形成率分别为65.5%和25.5%,比对照组73.5%减少。细胞周期检查1mmol/L组S期细胞明显减少（4.6%),多停留在G0/G1期（83.8%)。与对照组比较,1mmol/L组细胞Ki-67表达降低,F-肌动蛋白和角蛋白表达增加,5mmol/L组细胞凋亡明显增多。结论 丁酸钠可以诱导SHEE细胞增殖停滞和细胞凋亡,并有促细胞分化作用。其与用药剂量和时间有关。     

pH变化对非洲爪蟾卵母细胞ATP受体激活电流的影响

目的：观察pH变化对非洲爪蟾卵母细胞ATP受体激活电流（I_ATP）的影响。方法：采用双极电压钳技术记录卵母细胞膜ATP受体介导的电流。结果：检测的绝大多数细胞对ATP敏感，pH为7.4的ATP引起细胞特征性膜电流，并呈浓度依赖性。该电流包括3个部分：快内向电流（D1），慢内向电流（D2）和慢外向电流（H）。当细胞外pH降低到6.0、5.5时，10-3 mol/L 的ATP引起的IATP幅值明显被抑制，并以对D1电流抑制最明显。胞内应用G蛋白抑制剂阻断P2Y受体，对D1电流影响不大，D2电流明显减小。胞外应用P2X受体拮抗剂，对D1电流有明显的阻断作用。结论：pH值降低对爪蟾卵母细胞IATP的抑制主要通过对P2X受体的影响而实现。