外周血PBMC来源的树突状细胞的快速无血清培养方法及细胞信号转导机制

目的 探讨体外无血清条件下诱导人外周血单核细胞(PBMC)迅速生成树突状细胞(DC)的方法．并初步探讨钙离子载体(CI)诱导分化的信号转导途径与肿瘤坏死因子(TNF)-α所诱导的是否相同。方法 分离健康献血者的PBMC．给予无血清培养基及50ng／ml的rhGM-CSF过夜培养后，再分别给予100ng／ml的A23187或50ng／ml的TNF-α，或预先加入0．5μg／ml的环胞菌素A(CsA)30min后，再加入A23187、TNF-α，共培养40h。于相差显微镜下观察细胞形态的变化，流式细胞仪检测细胞的表面标志，MTT比色法检测不同方法处理的PBMC刺激同种异体T细胞的增殖作用。结果 健康献血者的PBMC在无血清条件下，给予rhGM-CSF及CI或TNF-α培养40h，均可获得DC的典型形态．包括CD14表达下调、CD83及共刺激分子(CD80、CD86)表达上调，以及较强刺激同种异体T细胞增殖的作用；上述由CI诱导的细胞形态的改变、表面分子的表达以及刺激T细胞增殖的作用均可被CsA所抑制。而TNF-α所诱导的细胞形态的改变、表面分子的表达以及刺激T细胞增殖的作用均不受CsA影响。结论 健康献血者的PBMCs在体外无血清条件下．司以被rhGM-CSF及CI或TNF-α迅速诱导成DC，但CI与TNF-α诱导PBMC分化为DC的细胞信号转导途径不同。     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。     

抗原致敏树突细胞激活细胞毒性T淋巴细胞的体外抗肿瘤作用

目的 利用新型诱导剂钙离子载体(CI)A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导人外周血单核细胞(PBMC)生成树突细胞(DC),观察DC刺激细胞毒性T细胞(CTL)对人白血病细胞K562细胞产生的特异性杀伤作用.方法 采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,分2组培养:传统方法组,加人rhGM-CSF+重组人白细胞介素4+重组人肿瘤坏死因子-α;新型诱导剂组,加入rhGM-CSF+CI A23187.培养开始前,予K562细胞冻融抗原致敏,培养96 h后收集负载抗原的DC.光镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测DC细胞的表面标志;四甲基偶氮唑盐比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力、DC对K562细胞的抑制作用和DC激活的CTL细胞对K562细胞的杀伤作用.结果 与传统方法相比,A23187联合rhGM-CSF 诱导培养的DC具有更加典型的树突形态;DC 表面分子CD83、CD1a、CD86、CD40表达(45.2%±1.8%、31.5%±3.9%、40.1%±7.8%、36.4%±6.3%)较传统方法组(16.9%±1.3%、20.4%±3.4%、26.5%±2.2%、22.3%±3.0%)明显高(均P<0.05),且CD14表达(5.7%±0.8%比19.0%±1.6%)明显低(P<0.05);负载K562细胞冻融抗原后的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖作用;对K562细胞有明显抑制作用,效靶比为1:1及10:1时,抑瘤率分别为(25.3±3.8)%比(15.6±2.4)%、(35.6±5.2)%比(22.9±3.2)%(均P<0.05);刺激的CTL对K562细胞有明显的杀伤作用,效靶比为10:1及40:1时,杀瘤率分别为(44.3±6.2)%比(29.9±2.8)%、(61.0±5.2)%比(43.1±4.8)%(均P<0.05).结论 新型诱导剂CI A23187联合rhGM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟DC,K562细胞冻融抗原冲击该DC激活CTL能够获得较强的杀伤K562细胞的能力.     

钙离子载体联合GM．CSF体外诱导外周血单核细胞生成树突状细胞

目的：利用新型诱导剂钙离子载体A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）体外诱导人外周血单核细胞（PBMC）生成树突状细胞（DCs）。方法：采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,按不同培养方法分成：传统方法组,rhGM-CSF＋重组人白介素-4（rhIL-4）＋重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）;新型诱导剂组,加入rhGM—CSF4＋A23187。光镜观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DC细胞的表面标志,MTT比色法检测各组DCs刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力。结果：与传统方法相比,A23187联合rhGM—CSF诱导培养的DCs更具有典型的树突形态;DC表面分子CD83D1a、CD86、CIM0表达（45．2％、31．5％、40．1％、36．4％）较传统方法组（16．9％、20．4％、26．5％、22．3％）明显上调（P〈0．05）,而CD14表达（5．7％vs19．0％）明显下降（P〈0．05）,刺激同种异体T细胞增殖的能力更强。结论：新型诱导剂钙离子载体A23187联合GM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟的DCs。     

钙离子载体和Poly(I:C)诱导人外周血来源的树突状细胞成熟的研究

目的:探讨从健康人外周血中体外诱导培养出成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法:用密度梯度离心法分离人外周单个核细胞(PBMC),再用贴壁法获取单核细胞后加入GM-CSF和IL-4,培养5天后分5组:第1组为对照组,仅含有上述细胞因子;第2组,加入多聚次黄嘌呤胞嘧啶核苷酸[Poly(I:C)];第3组,加入钙离子载体(A23187);第4组,加入Poly(I:C)和CI;第5组,加入TNF-α.显微镜下观察培养细胞形态,流式细胞术检测DC表型,体外同种混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激T细胞的增殖活性.结果:第四组细胞具有典型的树突状细胞的特征,且高表达CD83、CD80、CD86和CD40分子,具有更强的刺激T细胞增殖能力.结论:经过组合细胞因子诱导能够培养出PBMC来源的DC,且经CI和Poly(I:C)进一步诱导后获得更成熟和功能更强DC.     

rhIL-10对肿瘤坏死因子-α诱导的血管外膜成纤维细胞增殖的影响

目的 观察重组人白细胞介素-10(rhIL-10)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的成纤维细胞增殖的影响。方法 体外培养NIH/3T3细胞,应用rhIL-10与TNF-α共同作用并设立对照进行比较,采用MTS/PES法确定NIH/3T3细胞的增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期。结果 TNF-α对NIH/3T3细胞增殖具有明显的刺激作用。rhIL-10单独应用对NIH/3T3细胞生长没有影响。在TNF-α刺激下,一定剂量的rhIL-10可抑制NIH/3T3细胞的增殖。rhIL-10可使TNF-α作用下的NIH/3T3细胞大部分处于G₀/G₁期。结论 rhIL-10能明显抑制由TNF-α刺激的成纤维细胞增殖。     

体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞

目的 建立在体外从健康成人外周血单核细胞(Mo)诱导培养成熟的树突状细胞(DC)的方法.方法 采用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞(PBMC),再以黏附法分离出Mo,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)体外培养12天,并于培养第6天加入重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)共同培养,于倒置显微镜下观察细胞的形态,以流式细胞仪检测培养6、9、12天DC表面CD1a、CD83、CD86和MHC-DR的表达水平,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力,进行比较分析.结果 Mo经rhGM-CSF rhIL-4诱导培养6 d后,细胞成簇,表型为CD1a 53.2%、CD83 13.6%、CD86 65.5%、MHC-DR 75.4%;TNF-α诱导后,即培养第9 d,细胞表型为CD1a 62.1%、CD83 73.5%、CD86 92.3%、MHC-DR 98.4%,激发初始T细胞增殖的能力最强.结论 rhGM-CSF rhIL-4诱导Mo 6 d,可获得大量不成熟的DC,该体系有利于DC扩增;加入TNF-α,培养第9 d,DC成熟度最高,适合于临床免疫治疗.     

小鼠骨髓耐受性树突状细胞的体外培养与鉴定

目的 建立一种简单经济的小鼠骨髓耐受性树突状细胞(DC)的培养方法,为进一步研究耐受性DC在自身免疫性疾病治疗中的运用打下基础。方法 取小鼠的骨髓细胞作为DC的前体细胞,加入细胞因子rmGM-CSF和IL-4,分成磷酸酯多糖(LPS)-DC和单纯DC两组,前者在培养结束前18h加入LPS,后者不加;培养6d后收集疏松贴壁细胞进行形态、细胞表面标记以及免疫功能的鉴定。结果 用此方法培养的细胞其表面CD11c的表达率超过76%,具有典型的DC形态。单纯组DC的细胞中度表达MHCⅡ类分子,低水平表达共刺激分子,刺激T细胞增殖的能力较弱;LPS-DC组细胞高水平表达MHCII类分子和共刺激分子,能够诱导T细胞大量增殖。结论 利用此法能在体外培养出大量的未成熟DC,具有耐受性,为其在治疗自身免疫性疾病的应用奠定了基础。     

α-干扰素联合GM-CSF体外诱导培养脐血树突状细胞及其功能的测定

目的 探讨重组人α-干扰素(rhIFN-α)联合重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导培养脐血树突状细胞(DCs)的实验方法。方法 人脐血贴壁单个核细胞加入rhIFN-α及rhGM-CSF诱导培养,镜下观察培养细胞形态;流式细胞术检测培养细胞CD83、CD86的表达;MTT法检测诱导培养的DCs体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性。结果 人脐血贴壁单个核细胞经rhIFN-α联合rhGM-CSF共同培养后,第7d镜下可见有表面呈树状突起的DCs;细胞免疫表型检测结果示培养细胞有成熟DCs特异性标记CD83及共刺激分子CD86表达;rhIFN-α为600U／ml、rhGM-CSF为2000U／ml时为脐血DCs诱导培养的合适浓度(培养细胞CD83^ CD86^ 细胞比率最高);以诱导培养7d的脐血细胞(含DCs)作为刺激细胞与同种异体T淋巴细胞(反应细胞)以不同比例混合培养时,DCs均可刺激其增殖,其中以反应细胞：刺激细胞为20：1时最明显。结论 rhIFN-α联合rhGM-CSF细胞因子体外诱导人脐血贴壁单个核细胞,可生成具有典型形态及功能的成熟DCs。     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的 探讨体外经角蛋白19(K19)致敏的树突状细胞(DC)诱导的细胞毒T细胞(CTL)对MCF-7细胞株的抑瘤作用。方法 经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,³H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,⁵¹Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性。结果 外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高(P<0.01)。在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性(P<0.01),且随着效靶比增加,杀伤作用增强(P<0.01)。结论 DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强。     

慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞功能的研究

目的：体外培养慢性乙型肝炎病人的树突状细胞,并从细胞表型和功能方面与正常人树突状细胞进行比较。方法：从慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分离单个核细胞,加入含1000U／ml GM-CSF和500U/ml IL-4的无血清培养基AIM－V体外培养,获得树突状细胞。利用流式细胞仪检测细胞因子TNF－α对树突状细胞培养的影响,IL－12ELISA试剂盒检测树突状细胞分泌IL－12的水平,并采用MLR方法检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果：1．慢性乙型肝炎病人的外周血单个核细胞用AIM－V培养及细胞因子诱导后,可获得成熟的具有典型形态的树突状细胞,加入TNF－α后,IL－12分泌增高,CD83表达增加;2．病人树突状细胞与正常人比较,CD80表达较正常人的低（P＜0．05）,刺激同种异体T细胞增殖能力低于正常人。结论：1．慢性乙型肝炎病人的树突状细胞与正常人一样可用AIM－V无血清培养基及特定的细胞因子诱导在体外大量获得;2．慢性乙型肝炎病人的树突状细胞与正常人相比较在功能上降低,在形态数量上差异无显著意义。     

多西环素对树突状细胞功能的影响

目的探讨多西环素对树突状细胞的免疫表型和功能的影响。方法采集健康人的外周血,密度梯度离心法获得外周血单个核细胞,用rhIL-4和rhGM—CSF诱导分化为树突状细胞,通过LPS诱导树突状细胞成熟。树突状细胞诱导成熟过程中向培养基中分别加入0μg／mL、100μg／mL和300μg／mL的多西环素,通过流式细胞术检测树突状细胞表面HLA—DR、CD83和CD80的表达,用ELISA检测树突状细胞分泌TNF—α、IL-6、IL-12和IL-10,与T细胞共培养检测刺激同种异型T细胞的增值能力。结果与对照组相比,100ng／mL和300ng／mL多西环素处理组诱导树突状细胞表达HLA—DR表达下调。多西环素可下调树突状细胞分泌IL-1B、IL-12、TNF-α和IL-6,也可抑制树突状细胞刺激同种异型T细胞增殖,并呈剂量依赖性。结论多西环素作用于树突状细胞成熟过程,导致树突状细胞下调HLA-DR的表达,抑制树突状细胞分泌IL-1B、IL-6、IL-12和TNF—α,下调其刺激同种异型T细胞的增值能力。     

舒芬太尼对人脐血树突状细胞免疫功能的影响

目的探讨舒芬太尼对人脐血树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法无菌条件下采集脐带血70 ml,经密度梯度离心法获得脐血单个核细胞,然后分3组进行培养。阴性对照组(N组):只加rhGM-CSF 50 ng/ml和rhIL-4 10 ng/ml培养10 d;阳性对照组(P组):在加入rhGM-CSF、rhIL-4培养的同时加入rhTNF-α50 ng/ml培养10 d诱导成熟树突状细胞;药物组(S组):加入rhGM-CSF、rhIL-4的同时加入舒芬太尼其浓度分别为(0.2、0.5、1.0)ng/ml(S_(0.2)、S_(0.5)、S_(1.0)培养10 d。培养过程中在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态学变化;以流式细胞仪分析各组细胞免疫表型CD80、CD86、CD83、HLA-DR分子的表达;ELISA法测定其分泌IL-12的水平;MTT法检测DCs刺激混合淋巴细胞的增殖能力。结果与N组比较,S组和P组细胞具有典型的树突状细胞形态学特征,CD80、CD86、CD83和HLA-DR分子的表达增加(P<0.05),促进同种异体混合淋巴细胞增殖的能力较强(P<0.05),IL-12表达增加(P<0.05);与P组比较,S组细胞随舒芬太尼药物浓度增加树突状伪足逐渐不明显,CD80、CD86、CD83和HLA-DR分子表达以及促进混合淋巴细胞增殖能力呈不典型的剂量依赖性下降趋势(P<0.05),IL-12表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论脐血来源的单个核细胞可在舒芬太尼的刺激下诱导为成熟的树突状细胞,但舒芬太尼对树突状细胞成熟和免疫功能的影响具有剂量依赖性下降趋势。     

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

慢性髓系白血病来源的树突状细胞生物学特性的研究

目的:体外诱导慢性髓系白血病(CML)原代细胞分化生成树突状细胞(Dendritic cells DCs),并研究其生物学特性和功能.方法: 分离初诊13例CML患者的骨髓单个核细胞和5例正常人外周血的单个核细胞,用rhGM -CSF 1 000 U/ml、rhIL-4 500 U/ml和TNF-α50 U/ml联合培养10 d;形态学(Wright染色、倒置显微镜、透射电镜),免疫学(CD80、CD86、CD83、CD 1a、HLA-DR)鉴定,荧光原位杂交(FISH)进行细胞遗传学分析,ELISA检测分泌IL- 12的能力和混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能.结果:慢性白血病细胞体外诱导后,大部分细胞呈现树突状细胞的典型形态,而且有免疫标记的明显上调(CD 86 24.49±25.87 vs 61.73±28.54;CD1a 10.41±9.52 vs 47.26±3 5.60,P<0.05);FISH证实这类DC还携带有白血病克隆,并且具有分泌IL-12和刺激T淋巴细胞增殖的能力.结论:在体外可成功地将CML细胞诱导分化成树突状细胞 ,这类DC与正常DC无论在形态学和免疫学表达方面均相似,但是功能较弱.     

二十二碳六烯酸对人外周血树突状细胞成熟的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)在体外对人外周血来源树突状细胞(DCs)成熟状态及免疫学功能的影响。方法经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法分离出单个核细胞,用含rhGM-CSF和rhIL-4培养液诱导5d,获得未成熟DCs,并分为4组:未成熟组、成熟组、DHA组和饱和脂肪酸(SA)组。经DHA孵育24h,内毒素脂多糖(LPS)作用48h,于第8天,Wright-Giemsa染色观察各组DCs形态;流式细胞仪检测表型,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测DCs共刺激分子CD80、CD86及HLA-DR mRNA的表达;ELISA检测各组细胞上清液中IL-12及TNF-α的含量。结果 DHA组细胞上清液IL-12和TNF-α的含量比成熟组低(P<0.01),而SA组与成熟组比较差异无统计学意义(P>0.05)。DHA干预下平均荧光强度呈明显下调。成熟组CD80、CD86及HLA-DR mRNA相对表达量比未成熟组高(P<0.01);DHA组比成熟组低(P<0.01);而SA组与成熟组相比无差异(P>0.05)。结论 DHA可下调DCs共刺激分子CD80、CD86及HLA-DR的表达,降低IL-12及TNF-α的释放,减弱DCs的抗原提呈能力,且可抑制DCs体外成熟。