两种免疫调节剂辅助LAK细胞杀伤喉癌细胞的体外研究

为探讨如何提高白细胞介素－２（ＩＬ－２）／ＬＡＫ细胞过继免疫治疗的抗肿瘤作用，应用免疫调节剂分枝杆菌多糖或ＣＤ３单克隆抗体协同ＩＬ－２诱导的健康人外周血淋巴细胞来源的ＬＡＫ细胞在体外扩增，测定其对喉癌ＨＥＰ－２细胞杀伤活性。实验结果：（１）不同免疫调节剂对ＬＡＫ细胞扩增的影响。实验组三且细胞于体外扩增均明显高于对照组（Ｐ〈０．０１）；ＭＰＳ组或ＣＤ３组细胞的扩增倍数比单纯应用ＩＬ－２组为高（Ｐ〈０     

分枝杆菌多糖促人LAK细胞增殖及对喉癌HEP－2细胞杀伤活性的研究

为探讨分枝杆菌多糖（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＭＰＳ）在体外对ＬＡＫ细胞（ｌｙｍ－ｐｈｏｋｉｎｅａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｌｅｒｃｅｌｋｉｎｅ）活性的影响，以提高ＬＡＫ细胞杀瘤活性、减少ＩＬ－２（白细胞介素－２）用量和毒副作用。通过ＭＴＴ法测定不同浓度ＩＬ－２、不同浓度ＭＰＳ对ＬＡＫ细胞促增殖能力的影响；以细胞计数法测定不同浓度ＩＬ－２、ＭＰＳ对ＬＡＫ细胞扩增倍数的影响；应用乳酸脱氢酶法测定不同条件刺激的ＬＡＫ细胞对喉癌ＨＥＰ－２细胞杀伤活性的作用。结果证明小剂量ＩＬ－２（２×１０５Ｕ／Ｌ）诱导ＬＡＫ细胞过程中加入ＭＰＳ０．４ｍｇ／Ｌ能显著增强ＬＡＫ细胞的增殖和杀伤喉癌ＨＥＰ－２细胞的活性。其扩增倍数及杀伤活性均显著超过单纯应用ＩＬ－２（１０６Ｕ／Ｌ）诱导的ＬＡＫ细胞。通过检测不同条件下诱导的ＬＡＫ细胞表型，显示ＭＰＳ联合ＩＬ－２诱导的ＬＡＫ细胞ＣＤ２５百分率明显增高，提示ＭＰＳ可能通过促进ＬＡＫ细胞表面ＩＬ－２膜受体表达，提高ＬＡＫ细胞增殖及杀伤活性。因此，ＭＰＳ可望作为一种新型免疫调节剂用于抗肿瘤治疗     

分枝杆菌多糖促人LAK细胞增殖及对喉癌HEP—细胞杀伤活…

为探讨分枝杆菌多糖在体外对ＬＡＫ细胞活性的影响，以提高ＬＡＫ细胞杀瘤活性，减少ＩＬ－２用量和毒副作用，通过ＭＴＴ法测定不同浓度ＩＬ－２，不同浓度ＭＰＳ对ＬＡＫ细胞促增殖能力的影响；以细胞计数法测定不同浓度ＩＬ－２，ＭＰＳ对ＬＡＫ细胞扩增倍数的影响；应用乳酸脱氢酶法测定不同条件刺激的ＬＡＫ细胞对喉癌ＨＥＰ－２细胞杀伤活性的作用。     

人LAK细胞在体外和裸鼠体内抗头颈部肿瘤细胞的研究

报道人ＬＡＫ细胞对头颈疗肿瘤细胞的影响。结果发现：①ＬＡＫ细胞，在体外对人喉鳞癌细胞系ＨＥＰ－２、人鼻鳞癌细胞系ＣＮＥ－２和人口腔鳞癌细胞系ＫＢ均表现出明显的杀伤活性，与对照组比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。②ＬＡＫ细胞在移植瘤裸鼠体内同样具有很强的抑瘤作用。本实验结果提示临床上运用ＬＡＫ细胞治疗头颈部肿瘤可能是一种较新的有效方法。     

鼻咽癌病人放射治疗前后天然杀伤细胞活性、白细胞介素-2水平改变的研究

目的：探讨鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)病人放射治疗前后天然杀伤细胞(NK细胞)活性、白细胞介素—2(IL-2)水平的变化和肿瘤复发转移的关系。方法：选择139例首诊的NPC病人为NPC组，45例健康成人为对照组，两组间性别及年龄无显著差异。NPC病人根据肿瘤有无复发转移又分为两组，均予以^60Coγ射线外照射DT68—80Gy，分别检测放疗前和放疗后(36个月内)及对照组的NK细胞活性及IL-2水平，观察肿瘤复发转移的情况。结果：鼻咽癌病人放疗前、后0-30个月内NK细胞活性及IL-2水平动态观察均明显低于正常对照组(P＜0．05)，至放疗30个月后NK细胞活性及IL-2水平恢复近正常水平。肿瘤复发转移者其NK细胞活性及IL-2水平明显低于无复发转移者(P＜0．05)。30个月内肿瘤复发转移率为85．7％(60/70)。结论：NPC病人免疫功能状况与肿瘤复发转移关系密切。动态观察和评价NK细胞活性及IL-2水平对判断NPC是否复发和转移有一定的指导意义。     

LAK细胞体外及裸鼠体内抗喉癌Hep-2细胞作用的研究

采用乳酸脱氢酶法测定不同浓度rIL-2诱导的LAK细胞在体外抗喉癌Hep-2细胞的杀瘤活性,证实rIL-2对LAK细胞抗喉癌Hep-2细胞杀伤力的激活呈剂量依赖性,1×10~6U/L rIL-2为诱导LAK细胞抗喉癌活性的最适浓度;在该条件下诱导的LAK细胞于培养的第4～7天抗喉癌活性达到高峰,约为40％～50％,至培养第11天仍可保持30％的杀瘤率。裸鼠体内实验也证实,培养4天和9天的LAK细胞在裸鼠体内抑瘤率分别为65％和70％。可见,LAK细胞对喉癌Hep-2细胞具有较强烈且持久的杀伤力。本研究可为临床开展喉癌的局部过继免疫治疗提供实验室依据。     

微小RNA-106a-5p/E2F3/β-catenin轴增加NK细胞对喉癌细胞的杀伤作用

目的　分析微小RNA-106a-5p（miR-106a-5p）/E2F3/β-catenin轴对喉癌细胞恶性发展的影响及其可能的作用机制。方法　通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测喉癌组织和癌旁组织中miR-106a-5p和E2F3的基因表达量。生物信息学软件及其双荧光素酶实验检测miR-106a-5p和E2F3之间的关系。下调miR-106a-5p和E2F3表达,CCK-8试剂盒检测喉癌Hep-2细胞的增殖能力,Western blot实验检测Hep-2细胞上皮间质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）能力,检测NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）的分泌。estern blot分析miR-106a-5p通过E2F3对β-catenin通路的影响。进一步检测抑制β-catenin通路对Hep-2细胞恶性发展及NK细胞杀伤作用的影响。结果　喉癌组织中miR-106a-5p表达（0.62±0.08）低于癌旁组织（1.53±0.24）,E2F3表达（2.65±0.86）高于癌旁组织（1.48±0.74）。miR-106a-5p与E2F3特异性结合。下调miR-106a-5p促进Hep-2细胞增殖和EMT,抑制NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性,而下调E2F3表达抑制Hep-2细胞增殖和EMT,上调NK细胞对Hep-2细胞的杀伤活性。下调miR-106a-5p通过E2F3激活β-catenin通路。XAV939干扰β-catenin通路后显著逆转了下调miR-106a-5p通对Hep-2细胞恶性发展以及NK细胞杀伤作用的影响。结论 miR-106a-5p靶向E2F3激活β-catenin通路调控喉癌细胞的恶性发展。     

内皮抑素体外抑制喉鳞状细胞癌细胞的效果观察

目的探讨内皮抑素对喉鳞状细胞癌(简称喉癌)细胞(Hep-2)和人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)的作用及其可能的机制。方法①MTT法检测,10μg/ml～50μg/ml的内皮抑素作用72小时和30μg/ml的内皮抑素作用24～72小时对Hep-2和HUVEC的影响;②电镜观察,加药前后Hep-2和HUVEC的超微结构;③RT-PCR法检测,加药前后Hep-2中survivin基因的表达;④光镜观察,内皮抑素(30μg/ml)对体外人造血管模型的影响。结果①内皮抑素(20μg/ml～50μg/ml)能抑制Hep-2和HUVEC的增殖(P<0.05,P<0.01),呈剂量-时间依赖性;②Hep-2与HUVEC药物作用组均呈凋亡改变;③RT-PCR结果,药物作用组中survivin基因表达受到部分抑制(P<0.01);④内皮抑素能抑制新生血管的形成,并能破坏新生的血管网。结论内皮抑素可能通过诱导Hep-2和HUVEC的凋亡抑制其增殖,并能破坏新生的血管。内皮抑素可能以此抑制喉癌的生长与转移。     

西妥昔单抗联合放化疗对喉鳞状细胞癌的协同杀伤效应

目的：观察西妥昔单抗诱导人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2凋亡的敏感性,并探讨西妥昔单抗与顺铂、放射线联合应用对Hep-2细胞的杀伤效应及机制。方法：采用CCK-8试剂盒分别检测西妥昔单抗、顺铂、放射线对Hep-2生长抑制率,流式细胞仪检测不同干预方案对Hep-2凋亡率及细胞周期分布情况。结果：不同浓度西妥昔单抗对Hep-2细胞均有抑制作用,并在一定浓度范围内呈时间一剂量依赖性,24h半数抑制浓度为1036．84μg／ml;顺铂,放射线分别与西妥昔单抗联合应用时,Hep-2凋亡率显著高于顺铂、放射线单独或联合应用（P〈0．01）,并产生Go／G1期阻滞。结论：Hep-2细胞对西妥昔单抗诱导的细胞凋亡敏感,顺铂和（或）放射线与西妥昔单抗联用对Hep-2细胞的增殖具有协同抑制效应;显著的凋亡诱导作用和对Hep-2细胞周期的影响为其机制之一,为临床喉鳞状细胞癌靶向EGFR并联合放化疗方案提供了理论依据。     

槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用

目的:探讨槲皮素对体外培养的人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2生长的影响及作用机制,研究槲皮素治疗喉癌的可行性.方法:采用MTT法、倒置相差显微镜及流式细胞仪观察槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用情况.结果:槲皮素呈时间和浓度依赖性抑制Hep-2细胞的增殖,使Hep-2细胞贴壁能力减弱,形态变小变圆,悬浮细胞和颗粒增加,引起Hep-2凋亡,细胞周期阻滞于S期.结论:槲皮索能够抑制喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的生长和增殖,其抑制作用与细胞凋亡有关.     

内皮素1对喉癌细胞HEP 2的促增殖作用

目的探讨内皮素1对HEP 2细胞有丝分裂的影响。方法采用RT PCR及免疫组化Dako EnVision法检测HEP 2细胞内皮素受体表达情况;3H 胸腺嘧啶核苷渗入法检测不同浓度和作用时间内皮素1对HEP 2细胞有丝分裂的影响。结果HEP 2细胞存在内皮素受体基因及蛋白表达;内皮素1具有明显促HEP2细胞增殖作用,且其促增殖作用呈浓度依赖性。结论内皮素1能有效促进HEP 2细胞有丝分裂,对喉癌的演进可能有重要调控作用。     

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制人喉癌细胞系增殖的研究

目的探讨ｂｃｌ－２反义寡聚脱氧核苷酸在喉癌基因治疗中的可能作用及机理。方法采用人工合成与ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ起始码及其后４个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，处理培养的人喉癌细胞系Ｈｅｐ－２细胞，观察其对细胞增殖的影响。同时采用原位分子杂交及免疫组化技术，检测细胞内ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ及Ｂｃｌ－２蛋白水平，分析其变化规律。结果ｂｃｌ－２反义核酸片段对细胞内ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ无明显影响，但可以显著抑制Ｂｃｌ－２蛋白合成，抑制率与反义核酸浓度及作用时间呈正相关。２０．０μｍｏｌ／Ｌｂｃｌ－２反义核酸可以有效地抑制细胞增殖。结论提示ｂｃｌ－２反义核酸可以在翻译水平特异性地抑制Ｈｅｐ－２细胞中Ｂｃｌ－２蛋白的合成与细胞增殖。进一步证明ｂｃｌ－２基因在喉癌的发生发展中具有十分重要的作用。     

喉癌CD133+侧群细胞的分离及体外生物学特性分析

目的 探索喉癌肿瘤干细胞的分选方法。方法 联合应用藻红蛋白标记的CD133单抗、侧群细胞（side population,SP）分选及流式细胞仪荧光活化细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)检测及分选喉癌Hep-2细胞系中的CD133+ SP及CD133 - SP细胞,在体外对2个亚群细胞进行肿瘤干细胞特性相关的增殖、分化、球体形成及药物敏感性试验并进行比较。结果 CD133+ SP细胞在喉癌Hep-2细胞系中占(0.30±0.12)％,远低于CD133+亚群(3.15±0.83)％及SP亚群(17.1±2.0)％。在体外增殖实验中CD133+SP较CD133- SP细胞表现出更强的增殖能力;纯化的CD133+ SP细胞体外培养后可以分化出CD133-SP细胞及非SP细胞,而CD133 - SP却不能分化成CD133+SP;CD133+SP在含生长因子的无血清培养基中可以形成悬浮生长的球体;CD133+ SP较CD133-SP有更强的化疗抵抗力。结论 CD133+SP较CD133-SP具备更明显的肿瘤干细胞特性,较CD133+亚群及SP亚群更有效地富集了喉癌肿瘤干细胞,可作为喉癌肿瘤干细胞研究的理想候选亚群。     

喉癌患者血清可溶性白细胞介素-2受体和肿瘤坏死因子水平的研究

应用单克隆、多克隆双抗体夹心ELISA检测了35例喉鳞癌患者的血清可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)和肿瘤坏死因子(7NF-α)水平。结果显示:喉癌患者sIL-2R水平较良性组或正常人显著升高(P<0.001),与喉癌临床分期、临床分型及淋巴结转移密切相关;喉癌患者7NF-α水平只有Ⅳ期显著高于良性组或正常人(P<0.05).提示:血清sIL-2R水平检测可作为喉癌诊断的一项辅助指标,并有助于了解喉癌的临床进程及生物学行为(如淋巴结转移等);TNF-α在介导喉癌的恶病质方面起重要作用。本文还探讨了血清sIL-2R水平在喉癌中升高的机理。     

TPA处理增强喉鳞状细胞癌细胞株 Hep-2细胞的增殖

目的：探讨TPA对体外培养的人喉鳞状细胞癌细胞株HEp-2细胞的作用。方法：应用不同浓度TPA处理体外培养的HEp-2细胞,MTT法检测HEp-2细胞的存活比率。结果：HEp-2细胞经TPA处理后其细胞增殖能力呈现峰型,高峰出现在10μg／L水平上,此时处理细胞的增殖能力是对照组的1．3～1．4倍。随着TPA浓度的增高,HEp-2细胞的增殖能力逐渐下降。结论：TPA处理可以增强HEp-2细胞的增殖能力。     

XIAP反义寡核苷酸对hep-2细胞放射治疗的增效作用

目的:通过XIAP反义寡核苷酸转染hep-2细胞株,观察细胞增殖、凋亡及放疗反应。方法:体外培养人喉鳞状细胞癌hep-2细胞株,脂质体介导反义寡核苷酸转染,6h后4Gyγ射线照射。24h后RT-PCR检测XIAPmRNA表达,流式细胞仪检测蛋白水平及凋亡率,MTT检测细胞存活情况。结果:各浓度的反义寡核苷酸转染组hep-2细胞形态改变,MTT结果为细胞凋亡率随剂量增加而增高。800nmol/LXIAP反义寡核苷酸转染,使XIAPmRNA表达下调,蛋白表达下降,细胞凋亡率增加(P<0.05);4Gy照射后反义寡核苷酸转染组蛋白表达下降明显,较对照组细胞凋亡率增加,细胞存活率明显下降(P<0.05)。结论:XIAP反义寡核苷酸转染hep-2细胞株能够降低蛋白表达,促进细胞的凋亡并能提高对放疗的敏感性。     

喉癌CD133+侧群细胞的分离及体内致瘤性分析

目的 探索能够有效富集喉癌肿瘤干细胞的分选方法.方法 流式细胞仪辅助下联合应用CD133标记及侧群(side population,SP)细胞分选技术检测及分选喉癌Hep-2细胞系中的CD133+ SP及CD133 - SP细胞,将分选所得两亚群细胞以相同的数量级注入非肥胖糖尿病型/重症联合免疫缺陷( NOD/SCID)小鼠右侧腋窝皮下,比较两亚群细胞致瘤性差异,并对两亚群细胞进行细胞周期检测分析.结果 CD133+ SP及CD133 - SP细胞在喉癌Hep-2细胞系中各占(0.30±0.12)％及(17.52±1.59)％.CD133+SP在16只NOD/SCID小鼠中的15只腋窝皮下成瘤,CD133- SP细胞仅在16只NOD/SCID小鼠中的7只腋窝皮下成瘤,差异有统计学意义(Fisher精切概率法,P＜0.05).CD133+ SP细胞所成瘤体的重量平均((-x)±s,下同)为(0.36±0.15)g,而CD133 - SP细胞所成瘤体重量平均为(0.08 ±0.04)g,差异有统计学意义(t=4.64,P＜0.01).细胞周期检测发现,CD133+ SP及CD133 - SP细胞具有相似的细胞周期分布.结论 CD133+ SP比CD133 - SP具备更强的免疫缺陷小鼠体内致瘤能力;SP细胞分选法与CD133标记相结合是一种更有效的富集喉癌肿瘤干细胞的分选方法.     

大鼠神经干细胞生长及增殖规律的体外研究

目的:体外无血清条件下培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况.方法:取孕16～18 d SD系大鼠的胚胎海马组织,在含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基中培养,电子显微镜下观察其增殖分化过程,并通过免疫荧光方法鉴定分化后的细胞类型.结果:神经干细胞在无血清培养基中生长旺盛,8 d左右就可以形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,分化后的细胞显示NSE、GFAP免疫阳性.结论:无血清培养条件下神经干细胞生长良好,而在含血清的培养基中可以分化为神经元和星形胶质细胞.