核因子κB p65在肌肉萎缩中的表达与被动运动对其影响

目的 研究核因子κB(nuclearfactor kappa B,NF-κB)p65在失神经骨骼肌中的表达及被动运动对其影响作用,探讨失神经骨骼肌萎缩的分子机制及防治方法.方法 选Wistar大鼠42只,随机分成健康对照组(6只)、失神经对照组(18只)和被动运动组(18只).失神经对照组和被动运动组建立右下肢失神经腓肠肌动物模型.被动运动组大鼠采用右下肢被动运动300次/d.分别在术后2 d、14 d及28d取其双侧腓肠肌称重,计算肌湿重比,采用RT-PCR和Western Blot检测大鼠右侧失神经腓肠肌NF-κB p65的mRNA和蛋白表达水平,根据实验结果做统计处理数据得出结论.结果 大鼠腓肠肌失神经支配后肌肉湿重比持续下降,NF-κB p65的mRNA和蛋白表达在2 d、14 d、28d持续增加(P＜0.05),术后14 d、28d被动运动组腓肠肌湿重比高于同期失神经对照组(P＜0.05),被动运动组mRNA和蛋白的表达在各个时间点低于失神经对照组(P＜0.05),差异有统计学意义.结论 在失神经骨骼肌萎缩中,NF-κB p65的表达持续增高.被动运动可以通过干扰NF-κB p65的mRNA和蛋白质的表达来延缓失神经骨骼肌萎缩.     

经皮电刺激防治失神经骨骼肌萎缩机制研究

目的 研究电刺激对失神经骨骼肌萎缩中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、肌肉环状指蛋白-1(muscle ring finger-1,MuRF1)表达变化的影响,探讨电刺激防治失神经骨骼肌萎缩的机制.方法 选用Wista大鼠54只,制作成标准的右侧坐骨神经离断、腓肠肌失神经支配模型,随机分为对照组和电刺激组,应用RT-PCR和Westem Bloting检测不同时段的NF-κB、MuRF1 mRNA和蛋白质表达水平,联合肌湿重分析其相关性.结果 失神经支配后腓肠肌NF-Bκ、MuRF1 mRNA和蛋白质表达持续增加(P<0.05).电刺激组肌湿重比对照组同时间点明显增加(P<0.05),NF-κB、MuRF1 mRNA和蛋白质表达则明显降低(P<0.05).结论 电刺激可以通过抑制NF-κB/MuRF1途径有效防治失神经骨骼肌萎缩.     

川芎嗪对失神经骨骼肌萎缩大鼠FoXO3a、MAFbx以及MuRF1表达的影响

目的研究川芎嗪对失神经骨骼肌萎缩中FoXO3a、MAFbx及MuRF1表达的影响。方法 8周龄雌性SD大鼠54只,体重(200±10)g。随机分为3组,即正常对照组(A组,n=6)、失神经对照组(B组,n=24)、干预组(C组,n=24)。B、C组实验动物制备右下肢失神经腓肠肌动物模型,C组于模型制备后每日腹腔注射川芎嗪注射液80 mg/(kg.d),B组每日腹腔注射等剂量生理盐水;A组实验动物不作任何处理。取A组实验动物以及造模后2、7、14、28 d B、C组实验动物各6只,处死取其双侧腓肠肌称湿重,计算腓肠肌肌湿重比;另取右侧肌组织采用RT-PCR及Western blot检测各时间点FoXO3a、MAFbx、MuRF1 mRNA和蛋白表达水平。结果与A组比较,随着大鼠失神经时间延长,B、C组腓肠肌肌湿重比逐渐下降,差异均有统计学意义(P<0.05);造模后7、14、28 d,C组腓肠肌肌湿重比高于B组,且差异有统计学意义(P<0.05)。B、C组造模后7、14、28 d,FoXO3a、MAFbx、MuRF1 mRNA和蛋白表达水平均较A组高,C组各时间点均较B组降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论川芎嗪可能通过降低FoXO3a、MAFbx以及MuRF1 mRNA和蛋白表达水平进而延缓失神经骨骼肌萎缩。     

核转录因子-κB与肌环状指蛋白1在失神经肌萎缩中的表达及意义

失神经骨骼肌萎缩的防治是周围神经外科领域亟待解决的难题.我们通过检测不同时段大鼠失神经支配的腓肠肌中核转录因子(NF)-κB亚基p65和肌环状指蛋白1(MuRF1)表达的变化,探讨失神经骨骼肌萎缩的分子机制.     

细胞外三磷腺苷对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoxO3a通路的影响

目的 探讨细胞外三磷腺苷(ATP)对失神经大鼠腓肠肌细胞中FoxO3a/MAFbx通路的影响.方法 雌性成年Wistar大鼠54只随机分为3组:失神经对照组,ATP治疗组,健康对照组.其中失神经对照组和ATP治疗组在右侧梨状肌下缘切断坐骨神经,制作失神经动物模型.术后ATP治疗组于右侧腓肠肌内注射ATP0.1mg/d,左侧腓肠肌内注射等量生理盐水;失神经对照组双下肢注射等量的生理盐水;健康对照组不做任何处理.在术后0、2、7、14、28d分别处死一组大鼠,取其两侧腓肠肌,称肌湿重,计算肌失重比(右侧/左侧),采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测大鼠腓肠肌FoxO3a和MAFbx的mRNA和蛋白表达水平以及253位磷酸化的FoxO3a(p-FoxO3a)蛋白表达.结果 ATP治疗组肌湿重比高于失神经对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);ATP治疗组FoxO3a的mRNA和蛋白表达略低于失神经对照组,差异无统计学意义(P＞0.05);MAFbx的mRNA和蛋白表达低于失神经对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);p-FoxO3a的蛋白表达量较对照组明显增加,不同时段差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 细胞外ATP可能通过磷酸化FoxO3a进而抑制MAFbx蛋白的表达来延缓大鼠骨骼肌失神经萎缩.     

经皮电刺激对失神经骨骼肌中NF-κB表达变化的影响

目的 研究电刺激对失神经骨骼肌萎缩中NF-κB表达变化的影响,探讨电刺激防治失神经骨骼肌萎缩的作用机理.方法 选用wista大鼠54只,制作成标准的右侧坐骨神经离断、腓肠肌失神经支配模型,随机分为对照组和电刺激组,检测肌湿重,RT-PCR和Westem Bloting,检测不同时段的NF-κB,mRNA和蛋白质表达水平变化.结果 失神经支配后,腓肠肌湿重持续降低,NF-κB,mRNA和蛋白质表达持续增加（P＜0.05）.电刺激组肌湿重比对照组同时间点明显增加（P＜0.05）,NF-κB,mRNA和蛋白质表达则明显降低（P＜0.05）.结论 电刺激可以通过干预NF-κB表达而有效防治失神经骨骼肌萎缩.     

失神经萎缩肌组织中卫星细胞池的耗竭与Pax7的相关性研究

目的 探讨长期失神经骨骼肌在反复增殖分化过程中,肌卫星细胞池耗竭可能的信号通路.方法 选用2月龄SD雄性大鼠9只,体重180～200 g.以大鼠右侧为实验侧,制备腓肠肌失神经支配模型;左侧为对照侧,分离显示坐骨神经后缝合肌肉皮肤.观察大鼠一般情况,于术后3、7、21 d各取3只大鼠,切取两侧腓肠肌进行大体观察后,行Pax7和MyoD免疫荧光染色观察及mRNA表达检测.结果 9只大鼠术后均存活.实验侧后肢僵直,活动受限;对照侧肢体活动自如.术后各时间点实验侧腓肠肌均出现不同程度萎缩;对照侧腓肠肌较饱满有光泽.荧光染色观察显示,随失神经时间延长,实验侧MyoD阳性细胞数逐渐增多,21 d达高峰,与对照侧比较,差异均有统计学意义(P<0.05).实验侧Pax7阳性细胞逐渐降低,3、7 d与对照侧比较,差异均有统计学意义(P<0.05).实验侧MyoDmRNA表达逐渐升高,21 d达高峰,各时间点实验侧均显著高于对照侧(P<0.05);实验侧Pax7 mRNA表达逐渐降低,仅出现于3、7 d,与对照侧比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 长期失神经肌萎缩引发的Pax7短暂上调提示卫星细胞池耗竭的原因之一在于细胞难以返回静止状态.     

心脏营养素-1对失神经骨骼肌的营养和保护作用

目的探讨心脏营养素-1（Cardiotrophin-1，CT-1）及其受体在失神经骨骼肌中的表达规律，观察外源性CT-1对失神经骨骼肌的营养和保护作用。方法选用11组Swiss小鼠，每组10只，切断其右侧胫神经，分别于术后不同时间点完整切取失神经腓肠肌，用Northern blot法测定肌肉中CT-1及其受体亚基LIFR-β，gp130的mRNA含量，探讨三者的表达规律。另取Swiss小鼠30只，同样方法切断其胫神经后，连续腹腔注射CT-1（100μg／kg／d），于7、14和28d后检测失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和肌肉总蛋白含量，观察超微结构的变化，分别与对照组比较。结果CT-1及其受体在正常骨骼肌中均有表达。胫神经切断后，腓肠肌中CT-1的表达进行性下降；而LIFR-β和gp130在早期均有一个表达增高的过程，前者的表达高峰出现在失神经支配后24h，后者在神经切断后1周表达最高。连续应用外源性CT-12周，有效地维持了失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和总蛋白含量，减轻了肌浆网的扩张程度。用药4周后，这种效果更加明显。结论内源性CT-1表达不足，是失神经骨骼肌早期萎缩的一个重要因素。受体gp130／LIFR-β的表达上调，提高了肌肉对其配体CT-1的敏感性，及时应用外源性CT-1，可对失神经骨骼肌产生营养和保护作用，能有效地延缓失神经骨骼肌的萎缩。     

失神经骨骼肌NF-kappa B的表达变化与线粒体通透性转换孔开放及细胞凋亡的关系

目的 通过研究去神经骨骼肌细胞核转录因子kappa B(nuclear factor of kappa B,NF-kappa B)p65与线粒体通透性转换孔(mitochondrion permeability transition pore,MPTP)及细胞凋亡的关系,探讨失神经肌萎缩的相关机制.方法 Wistar大鼠30只,随机分为健康对照组、去神经2 d组、去神经7 d组、去神经14 d组、去神经28 d组.建立右下肢腓肠肌失神经支配模型,对照组仅做假手术.采用Western Bloting检测大鼠腓肠肌NF-kappa B p65蛋白表达水平,共聚焦荧光显微镜观察MPTP的开放情况,脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(Tunnel)技术检测细胞凋亡情况,并结合肌湿重进行相关性分析.结果 大鼠失神经支配后随着肌湿重比的下降,NF-kappa B p65蛋白、MPTP的开放以及骨骼肌细胞的凋亡率在各个时间点持续增加,且明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),NF-kappa B与MPTP的开放(r=-0.896,P＜0.01)以及凋亡率(r=0.890,P＜0.01)密切相关,并且NF-kappa B和凋亡率的升高与肌湿重比呈负相关关系(r分别为-0.919、-0.924,P均＜0.01).结论 NF-kappa B在失神经肌萎缩中起重要作用,其作用机制与MPTP的开放及细胞凋亡有关.

Abstract：

Objective To analyze the relationship of nuclear factor of kappaB (NF-κB) p65 to mitochondrion permeability transition pore (MPTP) and apoptosis during denervation atrophy of the gastrocnemius muscle, and delineate their potential roles in skeletal muscle atrophy. Methods Thirty Wistar rats were randomly divided into 5 groups: control group, 2 day denervation group, 7 day denervation group, 14 day denervation group, and 28 day denervation group. The gastrocnemius muscle was denervated by transection of the sciatic nerve. Sham operation was done in the control group. Levels of NF-κB p65 protein and the opening of the mitochondrial permeability transition pore in the gastrocnemius muscle were detected respectively by Westem Bloting and confocal fluorescence microscopy. The apoptotic cells in atrophic muscles were quantitated with Tunel. Muscle wet weight was also measure for comparison. Results At different time points after denervation, the levels of NF-κB p65, the opening of MPTP and apoptosis of gastrocnemius were significantly higher than those in the normal group ( P ＜ 0.05). Furthermore NF-κB p65 had a positive correlation with the opening of MPTP (r= - 0.896, P ＜ 0.01) and with the ratio of apoptosis (r = 0.890,P ＜0.01 ), while the increase of NF-κB p65 and apoptosis was negatively correlated with the ratio of muscle wet weight ( r = - 0. 919,-0.924, P ＜ 0.01 ). Conclusion NF-κ3 plays an important role in denervation skeletal muscle atrophy.This effect is related to the opening of MPTP and apoptosis.     

被动运动干预对大鼠失神经萎缩骨骼肌中miRNA-1表达和成肌细胞分化的影响

目的探讨mi RNA-1在大鼠早期失神经支配后骨骼肌中不同时段的表达,以及被动运动对失神经骨骼肌mi RNA-1表达及成肌细胞分化的影响。方法取SD大鼠27只,体质量(200±10)g,随机分为假手术组(A组,n=3)、失神经组(B组,n=12)和失神经被动运动组(C组,n=12)。各组大鼠显露右侧坐骨神经并游离,B、C组切除坐骨神经长约1 cm,A组仅显露游离神经不切除;术后1 d起,对C组大鼠右后肢行被动屈伸运动。A组于术后6 h,B、C组分别于术后3、7、14、28 d,采用颈椎脱臼法各处死3只大鼠,测量腓肠肌湿重比以及行HE染色观察腓肠肌细胞直径,对肌萎缩情况进行综合评价;采用RT-PCR法检测mi RNA-1、肌分化因子(myocyte differentiation factor,Myo D)基因表达,免疫组织化学染色观察Myo D蛋白表达。结果 B、C组腓肠肌失神经后均有不同程度萎缩,随失神经时间延长,肌纤维排列逐渐紊乱,肌细胞直径逐渐减小,失去正常的结构形态。B、C组术后各时间点腓肠肌湿重及肌细胞直径均小于A组(P0.05);B、C组间除术后3 d腓肠肌湿重比以及术后3、28 d肌细胞直径比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各时间点C组均大于B组(P0.05)。术后随时间延长,B、C组mi RNA-1和Myo D基因相对表达量呈逐渐升高趋势,但各时间点均显著低于A组(P0.05);B、C组间除术后3 d比较差异无统计学意义外(P0.05),术后7、14、28 d C组mi RNA-1和Myo D基因相对表达量均高于B组(P0.05)。免疫组织化学染色示A、B、C组各时间点Myo D均呈阳性表达,A组阳性表达少于B、C组;B、C组随失神经时间延长,阳性表达逐渐增多,且C组各时间点阳性表达均多于B组。相关性分析结果示mi RNA-1、Myo D分别与腓肠肌湿重比在3、7 d时无相关性(P0.05),14、28 d时成正相关(P0.05);各时间点Myo D与mi RNA-1基因相对表达量成正相关(P0.05)。结论被动运动可能通过促进mi RNA-1的表达,以促进肌细胞分化发挥防止失神经骨骼肌萎缩的作用。     

大鼠失神经支配骨骼肌萎缩后肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的变化

目的 研究失神经支配骨骼肌萎缩后肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的变化规律.方法 实验以失神经支配腓肠肌为动物模型.选用体质量为200～250 g的雌性SD大鼠42只,随机分成2组,实验组36只,健康对照组6只.按术后取材时间的不同再将实验组分为6组,每组6只大鼠.分别运用Tunel法及免疫组织化学方法检测失神经后不同时间萎缩腓肠肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax的表达变化,同时测量肌湿重比和肌纤维横截面积,透射电镜观察肌细胞的超微结构变化.结果 萎缩的腓肠肌湿重比在失神经4周内和第10周到第12周下降最快,而在第4周到10周和第12周到16周下降较慢,且变化差异无统计学意义(P＞0.05).Bcl-2仅在失神经早期表达增高,于第4周达高峰;而Bax分别于失神经第2周与第12周达高峰,增高幅度大于Bcl-2.Bcl-2/Bax的比值除对照组(1.522±0.215)和失神经第8周时(1.065±0.165)大于1外,其余各时间点均小于1.肌细胞凋亡率分别于失神经第4周和第12周达到高峰,其变化趋势与Bax相仿.结论 失神经腓肠肌萎缩过程呈现4个阶段;凋亡和凋亡相关基因Bax过量表达在失神经不可逆肌萎缩过程中发挥着重要的作用;靶向作用Bax基因,抑制Bax表达可能延缓失神经骨骼肌萎缩.     

活性氧、线粒体通透性转化孔介导肌细胞凋亡在失神经骨骼肌萎缩中的相关性

目的 观察活性氧(ROS)、线粒体通透性转化孔(MPTP)在失神经骨骼肌萎缩后的表达变化且与肌细胞凋亡的相关性,探讨ROS、MPTP参与失神经骨骼肌萎缩的具体分子机制.方法 将30只Vistar大鼠随机分为对照组、失神经2d组、失神经7d组、失神经14d组、失神经28d组,每组6只.制作坐骨神经切断后失神经支配的腓肠肌Vistar大鼠模型.应用流式细胞术(FCM)检测失神经支配后腓肠肌细胞ROS的含量,激光共聚焦显微镜检测MPTP的开放,脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测肌细胞凋亡.结果 大鼠失神经支配后,肌细胞中的ROS、MPTP及凋亡率与正常对照组比较,表达随失神经支配时间的延长(<28d)而持续增加,且各组的表达均显著高于对照组(P<0.05),ROS的表达与MPTP的开放呈正相关(r=0.884,P<0.01),与肌细胞的凋亡率呈正相关(r=0.893,P<0.01),MPTP的开放与肌细胞凋亡率呈正相关(r=0.927,P<0.01)与肌细胞萎缩指标肌湿重比呈负相关(r=-0.907,P<0.01).结论 ROS、MPTP为调控失神经支配后骨骼肌萎缩的重要分子,其具体机制是通过线粒体介导的凋亡通路促进骨骼肌萎缩.

Abstract：

Objective To study the expression of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial permeability transition pore (MPTP) in denervated skeletal muscle atrophy and its correlation with cell apoptosis, and explore specific molecular mechanism in denervated skeletal muscle atrophy. MethodsThirty Vista rats were randomly divided into five group: control group, 2-days group, 7-days group, 14-days group, 28-days group. Standard model of denervated gastrocnemius muscle was established. The content of ROS and the opening of MPTP in the gastrocnemius were detected by flow cytometry (FCM) and fluorescence microscope respectively. The apoptotic cells in atrophic muscle were examined by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). Results As compared with the control group, the content of ROS, the opening of MPTP and the apoptosis of gastrocnemius were increased continuously (<28 days) in 2-days group, 7-days group, 14-days group, 28-days group (P<0.05). The content of ROS had a positive correlation with the opening of MPTP (r=0.884,P<0.01) and the apoptosis rate (r=0.893,P<0.01), and the opening of MPTP had a positive correlation with the apoptosis rate (r=0.927,P<0.01), but a negtive correlation with the ratio of muscle wet weight (r=-0.907,P<0.01). Conclusion ROS and MPTP are important elements in regulating skeletal muscle atrophy after denervation by the mitochondrial apoptosis pathway.     

班布特罗与当归补血汤对失神经肌肉萎缩防治作用的实验研究

目的：研究班布特罗及当归补血汤对防治失神经骨骼肌萎缩的作用效果及有无协同作用。方法 SD大鼠40只，随机分组，每组10只，建立失神经骨骼肌萎缩的实验模型。术后4周处死大鼠，双侧腓肠肌及心脏称重，测定肌肉SOD含量，测肌纤维直径，检测细胞凋亡情况。结果 各用药组与对照组肌总蛋白含量、SOD含量、肌纤维直径均无显著性差异（P〉0．05）。在排除个体体重差异后肌肉湿重亦无显著性差异。两种药物之间无协同作用。各组均可见凋亡细胞，荧光显微镜下肉眼观测凋亡细胞的数量无显著性差异。结论 班布特罗与当归补血汤在4周时无明显预防肌萎缩作用及协同作用；细胞凋亡在失神经肌萎缩中发挥一定的作用；本实验为探索药物长期应用防治失神经骨骼肌萎缩的研究提供借鉴。     

Time-dependent expression of myostatin RNA transcript and protein in gastrocnemius muscle of mice after sciatic nerve resection

Myostatin, a member of the transforming growth factor-beta (TGF-beta) superfamily, has been identified as a negative regulator of skeletal muscle mass. To provide more data on the role of myostatin in denervation-induced muscle atrophy, we examined the time-dependent changes in myostatin mRNA and protein as well as Smad2 and phospho-Smad2 protein levels in the denervated gastrocnemius muscle of mice after sciatic neurectomy, using quantitative real-time RT-PCR and Western blotting, respectively. We conducted morphometric analyses to measure the wet weight ratio of the denervated muscle (the operated side/contralateral nonoperated side) and the cross-sectional area of muscle fibers, and observed the morphology of denervated muscle. The experimental results showed that in the early stage of denervation, the levels of myostatin mRNA and protein in the denervated gastrocnemius muscle increased instantly, reaching a peak at day 3 and day 7 after sciatic neurectomy, respectively, when compared with the normal values. In addition, the phospho-Smad2 protein was observed to have a similar expression profile to that of the myostatin mRNA. The present study perhaps opens a new window into myostatin modulation in muscle atrophy due to denervation.     

重组慢病毒介导心脏营养素-1基因转染延缓小鼠失神经骨骼肌萎缩

目的 探讨重组慢病毒介导的心脏营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)基因转染延缓小鼠失神经骨骼肌萎缩的疗效.方法 将36只Swiss小鼠,随机分为实验组和对照组,每组18只,切断胫神经,建立右下失神经支配肌萎缩模型.于实验组和对照组失神经腓肠肌分别转染重组慢病毒载体Lenti-GFP-CT-1和Lenti-GFP溶液20μl(108TU/ml),转染后2、4周,每个时间点分别取3只小鼠,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达、Western blot检测CT-1的表达;取6只小鼠行单次收缩力、强直收缩力的检测,测定肌湿重、肌纤维横截面积,并观察肌纤维超微结构的变化.结果 慢病毒转染2,4周,两组腓肠肌中均可见大量GFP表达.Western blot检测显示实验组失神经腓肠肌中有明显的CT-1表达(P均<0.01).转染2周,实验组肌肉单次收缩力恢复率、强直收缩力恢复率、肌湿重维持率和肌纤维横截面积分别为[(47.61±6.25)%,x-±s,下同]、(56.08±5.47)%、(63.02±5.23)%、(1372.42±149.73)μm2,均明显高于对照组,后者分别为(27.23±5.06)%、(30.78±4.67)%、(52.41±4.98)%、(1147.28±128.67)μm2(P均<0.01);4周时,实验组上述各项指标分别为(33.13±4.76)%、(36.59±5.67)%、(51.46±5.36)%、(1209.12±142.57)μm2,仍明显高于对照组,后者分别为(16.40±5.48)%、(15.35±4.08)%、(39.15±6.12)%、(989.45±136.12)μm2(P均<0.01).此外,实验组肌浆网的扩张程度明显减轻.结论 慢病毒介导的基因治疗有较高的转染效率,其介导的CT-1基因转染能有效延缓小鼠失神经骨骼肌的萎缩,其疗效至少可以维持4周.