PCR快速筛选质粒cDNA文库方法的建立

目的　建立一种快速、有效地筛选质粒ｃＤＮＡ 文库的方法—ＰＣＲ 法。方法　将质粒ｃＤＮＡ文库重组子进行矩阵排列,然后用特异引物进行ＰＣＲ 逐级筛选以获得目的克隆。结果　经两轮筛选（约１ 周的时间）获得４ 株阳性克隆。结论　ＰＣＲ 矩阵筛库法不仅适用于常规ｃＤＮＡ 克隆的筛选,还适用于筛选较短的ｃＤＮＡ片段,比常规的筛库方法更为灵敏、特异、高效。     

抗结肠癌抗体重链可变区和k轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和ｋ轻链基因，方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整ｋ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析，结果：用重链引物扩增获得长的３６０ｂｐ的片段，用轻链引物扩增获约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列，结论：克隆的重链可     

改进的锚定反转录PCR法克隆中国人庚型肝炎病毒3′末端基因

应用改进的锚定反转录ＰＣＲ（ａｎｃｈｏｒｅｄＲＴ－ＰＣＲ）法，在总ＲＮＡ的３′端“加尾”，Ｏｌｉｇｏｔｅｘ提纯ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ，Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）－ａｎｃｈｏｒ引物合成第１链ｃＤＮＡ，ａｎｃｈｏｒ引物及特异引物进行“半巢式”ＰＣＲ，从献血员血清中扩增出ＨＧＶ３′末端基因片段。序列分析结果表明：此中国株ＨＧＶ３′末端基因序列与美国株存在较大差异，但阅读框架相似。用此方法克隆单链ＲＮＡ病毒基因组的３′末端。由于许多动物病毒和９０％以上的植物病毒均为单链ＲＮＡ基因组，故该技术也可应用于其它病毒基因组未知末端的基因克隆。     

PCR介导的大鼠再生肝cDNA文库构建

简介了ＰＣＲ技术介导的ｃＤＮＡ文库构建方法，其基本原理是在第一链ｃＤＮＡ３’端连接多聚Ｇ，进而以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）和ｏｌｉｇｏ（ｄＣ）为引物，对第一链ｃＤＮＡ进行扩增，这一技术可能在分离亚细胞群特异基因中有重要作用。     

半套式PCR扩增人抗体基因以增加抗体库的多样性

用重链５’－末端８条引物和３’末端１条引物以及轻链５’末端９条引物和３’末端２条引物ｃＤＮＡ为模板对免疫球蛋白基因进行了ＰＣＲ扩增。结果表明，重链的扩增率为５０％，轻链的扩增率为４４％。而先用信号肽序列为经物和以上３’末端引物以ｃＤＮＡ为模板先进行第一次ＰＣＲ，然后以该产物为模板再用以上方法进行第二次ＰＣＲ时，不仅所有的引物都佑欣?     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白 产生

获得得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析，方法用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，     

抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和κ轻链基因。方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整κ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析。结果：用重链引物扩增获得长约３６０ｂｐ的片段；用轻链引物扩增获得约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列。结论：克隆的重链可变区基因长度为３６０ｂｐ，属于小鼠重链可变区Ｉ（Ｂ）亚族；κ轻链长度为６４２ｂｐ，其中可变区为３２１ｂｐ，属于小鼠κ轻链Ⅴ亚族。     

ATM参与辐射损伤细胞学反应的研究

目的 克隆ＡＴＭ全长ｃＤＮＡ及含特异功能域的ｃＤＮＡ片段,寻找与ＡＴＭ相互作用的蛋白,分析ＡＴＭ在ＤＮＡ损伤名的分子机理。方法 利用长片段ＰＣ白话 增法,从人外周血来源的ｃＤＮＡ库中扩增ＡＴＭｃＤＮＡ;利用酵母双杂交系统筛选人外周血来源的ｃＤＮＡ库中与ＡＴＭ相互作用的蛋白。结果 经重叠ＰＣＲ扩增到ＡＴＭ全长ｃＤＮＡ,并筛选到数条与ＡＴＭＰ１３Ｋ激酶区相互作用的ｃＤＮＡ,并对其序列进行分析。结果 Ａ     

人肝再生增强因子的cDNA克隆与序列分析

利用大鼠肝再生增强因子核苷酸序列，从人胎肝ｃＤＮＡ文库中筛选到人肝再生增强因子ｃＤＮＡ克隆，该克隆含有１．５ｋｂ的外源插入片段，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核到序列同源性达８７％，氨基酸序列同源性达８４．８％。     

利用T─载体克隆法对人脑源性神经营养因子全长基因PCR产物的克隆

利用Ｔ－载体克隆法完成了含信号肽及前导肽的人脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）全长基因ＰＣＲ产物的克隆。序列测定结果表明，所克隆的人ＢＤＮＦ基因从起始密码子ＡＴＧ到终止密码子ＴＡＧ的７７４ｂｐ中，除下游端ＰＣＲ引物因为采用猪的ＰＣＲ引物而有一个碱基改变外，其它序列与国外文献报道序列完全一致。该碱基改变不影响氨基酸序列     

多药抗药基因mdr1探针的基因克隆

多药抗药基因的表达水平与细胞的耐药性直接相关，检测ＭＤＲ１的表达水平可预测化疗的效果以及预后，用分子原位杂交的方法可检测单个细胞中ＭＤＲ１的表达水平。采用ＰＣＲ扩增方法获得了一段特异的ＤＮＡ片段，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列分析证明与文献一致。此探针可用于临床标本的分子杂交检测。     

登革病毒NS1基因的平端PCR产物的快速克隆

用ＰＣＲ产物进行克隆已广泛用于分子生物学的各个领域。ＰＣＲ产物的克隆主要通过两个途径：其一，在引物的３’末端加上限制性内切酶的识别序列，使扩增片段产生粘性末端，再连接到有相应末端的载体中去。但是，由于许多限制酶对处在ＤＮＡ片段末端的识别序列的作用效率远较处于内部的序列为低。因此，该方法在实际应用中常常不能获得满意的结果。其二，用ＰＣＲ产物进行平端连接，这种方法无需酶切，可适用于任何扩增产物，故应用较广。但由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有不依赖模板的末端转移酶活性而导致扩增片段３’端带有腺苷酸残基，而使…     

自建非克隆cDNA文库从 EST片段快速克隆全长cDNA

随着国内基因组计划的开展和差异显示技术的广泛应用，产生了大量的ＥＳＴ片段，如何简便、有效地获得其全长ｃＤＮＡ，进行下一步的基因功能研究，已成为新基因研究的瓶颈问题。从已知ＥＳＴ片段获取其全长ｃＤＮＡ，目前国内外常见的方法有ｃＤＮＡ文库筛选，ＲＡＣＥＰＣＲ，电子克隆等等。ｃＤＮＡ文库筛选是比较经典的方法，但它要求有质量较好的ｃＤＮＡ文库，而多数来源于差异显示技术的ＥＳＴ片段，只在经特殊处理（如辐射）诱导后的细胞中表达，因此不能使用常规的ｃＤＮＡ文库进行筛选，而自建ｃＤＮＡ文库不仅费时，且质量难以保…     

多药抗药基因mdrl探针的基因克隆

多药抗药基因（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ，ｍｄｒｌ）的表达水平与细胞的耐药性直接相关，检测ＭＤＲ１的表达水平可预测化疗的效果以及预后。用分子原位杂交的方法可检测单个细胞中ＭＤＲ１的表达水平。采用ＰＣＫ扩增方法获得了一段特异的ＤＮＡ片段，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列分析证明与文献一致。此探针可用于临床标本的分子杂交检测。     

中国大陆庚型肝炎病毒结构区与非结构区部分cDNA基因的序列分析

作者在建立检测庚型肝炎病毒酶免疫和ＰＣＲ技术的基础上，将抗－ＨＣＶ上阳性病人血清经逆转录－巢式ＰＣＲ分离部分ＨＧＶｃＤＮＡ片段，用与ＨＧＶ基因互补的特异寡核苷酸引物进行双脱氧核苷酸链末端终止法－ＰＣＲ直接测序。结果表明，中国大陆ＨＧ－３０２Ⅰ株部分ｃＤＮＡ序列与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的ＨＧＢ美国株ｃＤＮＡ序列有极高的同源性。     

登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２ ４３） 感染的Ｃ６／３６ 细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ 为模板,进行Ｄ２ ４３ 株ＮＳ３ 基因ｃＤＮＡ 片段的反转录 ＰＣＲ 扩增,片段长度为１１７６ ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ 片段克隆到Ｔ 载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｓⅡ（ ＋ ） 中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

利用T—载体克隆法对人脑源性神经营养因子全长基因PCR产物…

利用Ｔ－载体克隆法完成了含信号肽及前导肽的人脑源性神经营养因子，全长基因ＰＣＲ产物的克隆。序列测定结果表明，所克隆的人ＢＤＮＦ基因从起始密友子ＡＴＧ致 止密友子ＴＡＧ的７４４ｂｐ中，除下游端ＰＣＲ引物因为采用猪的ＰＣＲ引物而有一个碱基改变外，其它序列与国外文献报道序列完全一致。     

人肝癌细胞中端粒酶RNA的克隆及序列分析

目的：比较不同组织细胞中端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）的序列，建立以ｈＴＲ为基础的肿瘤诊断与治疗新技术。方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人肝癌细胞株（ＨｅｐＧ２）中扩增出了ｈＴＲ部分ｃＤＮＡ序列，并通过电泳的方法鉴定了其特异性。通过分子克隆技术将上述产物插入Ｔ－质粒后转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中，经聚合酶链反应（ＰＣＲ）鉴定了插入片段的特异性及方向，最后采用自动ＤＮＡ序列分析仪分析了上述插     

用多重及套式PCR同时检测血清中的HBV和HCV方法的建立

首次应用多重及套式ＰＣＲ技术同时检测人血清中的ＨＢＶ和ＨＣＶ。将抽提的ＨＢＶＤＮＡ和（或）ＨＣＶＲＮＡ在含ＡＭＶ逆转录酶、ＴａｑＤＮＡ多聚酶以及ＨＢＶ和ＨＣＶ外套引物的ＰＣＲ缓冲引物的ＰＣＲ缓冲液中进行逆转录后连续进行ＰＣＲ扩增，以第一轮扩增产物为模板，在含ＨＢＶ和ＨＣＶ内套引物的ＰＣＲ反应体系中进行第二轮扩增，产物经电泳后，以ＤＮＡ分子量标志物或已知片段做参考，出现５２３ｂｐ和（或）２６０ｂｐ产     

人CD40分子基因的克隆及其在COS—7细胞中的表达

目的：克隆编码人ＣＤ４０分子基因的全长ｃＤＮＡ,在ＣＯＳ－７细胞中获得高表达。方法：提取人Ｂ淋巴细胞看Ｄａｕｄｉ总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了编码人ＣＤ４０基因全长ｃＤＮＡ,序列测定证实其正确性。将测序正确的ＣＤ４０基因克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）杂ＣＯＳ－７细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测ＣＤ４０基