慢性髓系白血病bcr—abl融合基因的克隆及其在COS …

目的 克隆慢性髓系白血病（ＣＭＬ）融合基因ｂｃｒ－ａｂｌ的ｃＤＮＡ序列,并在真核细胞中表达。方法 以设计的两条引物扩增ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点两侧的ｃＤＮＡ,测序后克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１,转染ＣＯＳ－７细胞。取常规培养的细胞进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定。结果 ①ＰＣＲ扩增出４９０ｂｐ大小的ｃＤＮＡ,其序列测定除第４５２位的碱基Ｃ突变为Ｔ外,其余序列均正确。②ＲＴ－ＰＣＲ法检测到转染细胞系中,有ｂ     

慢性髓系白血病bcr-abl融合基因的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆慢性髓系白血病(CML)融合基因bcr abl的cDNA序列 ,并在真核细胞中表达。方法以设计的两条引物扩增bcr abl融合位点两侧的cDNA ,测序后克隆至真核表达载体 pcDNA3.1 ,转染COS 7细胞。取常规培养的细胞进行RT PCR鉴定。结果①PCR扩增出490bp大小的cDNA ,其序列测定除第452位的碱基C突变为T外 ,其余序列均正确。②RT PCR法检测到转染细胞系中 ,有bcr ablmRNA的表达。结论成功地克隆了CML融合基因bcr abl融合位点两侧的490bp 序列并表达 ,为研制bcr abl基因疫苗治疗CML奠定了基础。     

53例慢性髓系白血病细胞遗传学和bcr/abl融合基因检测

目的了解我院慢性粒细胞白血病(慢粒)染色体变异及融合基因表达与临床诊断和分期间的关系。方法染色体制备采用骨髓或外周血短期培养法,G显带,分析核型;融合基因检测则用逆转录-聚合酶链反应法(PCR法)。结果发现慢粒急变期的染色体,除具典型的Ph染色体外,还有 8、 9、i(16)q、i(17)q、-18等其它染色体改变。bcr/ab l融合基因显示慢粒急变期的患者,同时具有165bp和90bp扩增带。结论我们宜将细胞遗传学和PCR法结合,对慢粒白血病进行检测,即有助于对其诊断、预测急变、判断疗效及预后情况的深入了解。     

小鼠抗人前B细胞白血病同源盒基因3多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)多克隆抗体。方法采用反转录PCR扩增PBX3基因区序列,并重组入原核表达载体pGEX-4T-1,重组载体转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-PBX3融合蛋白的表达。SDS-PAGE纯化融合蛋白,并用GST-PBX3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,收集经过免疫的小鼠血清即抗PBX3的多克隆抗血清,采用间接ELISA检测其效价,通过免疫细胞化学技术及Western blot法鉴定其特异性。结果成功构建pGEX-4T-1/PBX3原核表达载体,转化BL21菌株后可高效表达GST-PBX3融合蛋白,且以不可溶包涵体形式存在。SDS-PAGE纯化蛋白并免疫小鼠产生的抗PBX3血清可特异识别细胞外源过表达的PBX3蛋白,同时可检测到细胞外源性PBX3蛋白的细胞内定位情况。结论获得效价和特异性良好的PBX3多克隆抗体。     

蛋白转导域介导BCR/ABL抗原对CML患者T细胞的活化作用

目的：研究蛋白转导域(PTD)介导的BCR／ABL抗原对慢性髓细胞白血病(CML)患者T细胞的特异性活化作用。方法：利用基因工程技术，将PTD基因与CML b3a2 bcr／abl基因融合并原核表达。将纯化的PTD—BCR／ABL融合蛋白与CML患者外周血单个核细胞(PBMC)体外共孵育，用流式细胞仪分别检测CD4^ 、CD8^ T细胞上活化抗原CD25的表达。结果：终浓度为100mg／L的PTD—BCR／ABL抗原体外刺激4d后，10例CML患者中，5例表现为CD8^ T细胞活化，2例表现为CD4^ T细胞活化，其中有1例CD8^ 和CD4^ T细胞同时活化；而作为对照的BCR／ABL抗原刺激组无一例表现为CD8^ 或CD4^ T细胞活化。结论：PTD能将外源性BCR／ABL抗原转导入抗原呈递细胞内，加工呈递后激活抗原特异性CD8^ 及CD4^ T细胞，为CML特异性CD8^ 、CD4^ T细胞的体外活化及细胞免疫治疗开辟一条新的途径。     

P53融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的 为研制出能特异与Ｐ＾５３结合的单克隆抗体,使对Ｐ＾５３的检测得到更为广泛的应用。方法 用ＰＣＲ技术扩增编码人Ｐ＾５３Ｎ－端１８０个氨基酸的ＤＮＡ片段并将其克隆在谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）表达质粒Ｐ＾ＧＥＸ－２Ｔ中。用该重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９,并经异丙基β－Ｄ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导产生Ｐ＾５３－ＧＳＴ融合蛋白。用Ｐ＾５３－ＧＳＴ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。常规细胞融合,间接酶联免疫吸附试     

小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体.方法 以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamHⅠ和NheⅠ双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔, 制备Klotho多克隆抗体.结果 表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15 %左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1∶ 10 000,Western印迹分析验证了抗体特异性.结论 GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础.     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

小檗胺诱导K562细胞凋亡及其与bcr/ablgene及P210表达的关系

目的:探讨小檗胺(BER)诱导K562细胞凋亡及其可能的机制。方法:以流式细胞仪(FCM)分析、电镜观察细胞微结构变化及基因组DNA电泳等方法检测细胞凋亡。以RT-PCR及Westernblot方法检测K562细胞BCR/ABLmRNA和蛋白质水平表达。结果:FCM检测见到典型的凋亡峰,8.0mg/LBER作用24-72h,随药物作用时间延长,细胞凋亡率由(29.20±3.82)%上升至(61.77±4.35)%(P＜0.01);以2.0-8.0mg/LBER作用24h,随药物浓度增加,K562细胞的凋亡率也增加。电镜下可见明确的细胞凋亡的形态学改变。DNA电泳呈现典型的梯形条带。16.0mg/LBER处理24h,K562细胞bcr/ablmRNA相对表达量及BCR/ABL融合蛋白质P210水平均明显低于对照组,分别为0.73±0.02vs1.19±0.02(P＜0.01)和0.63±0.01vs1.04±0.02(P＜0.01),呈时间-浓度依赖效应。经BER作用后,K562细胞bcr/ablmRNA表达强度与P210水平呈正相关(r=0.928,P＜0.05),且细胞凋亡率与bcr/ablmRNA表达呈负相关(r=-0.997,P＜0.01)。结论:在体外BER对K562细胞有明显的促凋亡作用,抑制bcr/ablmRNA表达及其蛋白质水平可能是其作用的重要机制之一。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

碱性MAGE家族新成员restin在大肠杆菌中的表达和抗体制备

目的:从维甲酸诱导的白血病细胞系HL60中,克隆编码219个氨基酸的新基因restin,构建原核表达载体、制备抗血清并进行初步应用。方法:采用PCR技术,以维甲酸诱导的白血病细胞的cDNA为模板,扩增出restin的编码区。将其克隆入大肠杆菌表达载体中。经过温度诱导获得restin表达蛋白。利用SDS-PAGE纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备该蛋白的抗血清。以该抗体做间接免疫荧光,初步观察restin在COS-7细胞内的表达分布。结果:大肠杆菌中表达的restin蛋白的Mr为26000。将其初步纯化后免疫新西兰白兔制备的抗血清,用Westernblot检测其效价为1∶800。间接免疫荧光显示,restin蛋白主要分布在细胞核内。结论:成功地制备抗restin的抗体,为进一步研究restin蛋白在组织中的表达、细胞内亚定位以及信号转导通路提供了前提条件。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子与HBsAg融合蛋白基因的 …

目的 研究粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）的免疫活性。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）３８４ｂｐ的基因片段及ＨＢｓＡｇ８４６ｂｐ基因片段，扩增产物经柱纯化后，由Ｔ４ＤＮＡ酶连结因子１２３０ｂｐ的片段，将此片段命名为ＬＧＨ，克隆到ｐＵＣ１９质粒中，利用菌落ＰＣＲ法快速筛选阳性克隆及限制酶切鉴定片段的大小。结果 该基因全长１２３０ｂｐ，经     

重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的: 构建重组载体pcDNA-λ并在COS7细胞分泌表达鸡Igλ轻链, 制备抗鸡Igλ轻链的单克隆抗体(mAb).方法: PCR扩增带有信号肽的鸡Igλ轻链基因, 限制性酶切消化后, 定向克隆于真核表达载体pcDNA3, 构建具有6×His标签、分泌表达的重组载体pcDNA-λ.重组载体转染COS7细胞后, SDS-PAGE分析真核表达载体pcDNA-λ在COS7细胞的分泌表达.用2×106个雏鸡B淋巴细胞免疫BALB/c小鼠, 取脾细胞与骨髓瘤细胞融合, 分别采用细胞免疫荧光和间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆.结果: 成功构建分泌表达鸡Igλ轻链的重组载体, SDS-PAGE分析表明在COS7细胞上清有目的蛋白的分泌表达.杂交瘤细胞经筛选与鉴定, 获得2株分泌抗鸡Igλ轻链mAb的杂交瘤细胞株, Western blot检测到该mAb对重组鸡Igλ轻链的反应性.结论: 构建了重组表达载体pcDNA-λ并在COS7细胞上清分泌表达了重组鸡Igλ轻链.并用淋巴细胞杂交瘤技术成功筛选出抗鸡Igλ轻链mAb.为深入研究鸡Igλ轻链的结构与功能奠定了基础.     

细胞因子Midkine融合蛋白的表达及其单克隆抗体的制备与应用

目的:克隆细胞因子midkine(MK)基因,表达其融合蛋白,制备抗MK单克隆抗体(mAb)并检测MK在肿瘤细胞中的表达。方法:利用MK基因的特异性引物,通过RT-PCR从人肾癌组织mRNA中扩增人MKcDNA分子。将其定向克隆于原核表达载体中,在大肠杆菌中表达MS2-MK融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用传统的杂交瘤技术,进行细胞融合、筛选、克隆化并制备mAb腹水。用ELISA法分析其Ig亚类,用免疫细胞化学染色法检测MK在肿瘤细胞中的表达。结果:成功地克隆出MK基因并表达了MS2-MK融合蛋白。通过免疫和筛选,获得2株分泌小鼠抗人MKmAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb的Ig亚类分别为IgG1和IgG2a。免疫细胞化学染色显示,2株mAb与人胃癌细胞株MGC803和胃癌组织呈强阳性反应。结论:在原核细胞中获得MS2-MK融合蛋白的表达,并制备出抗MK的mAb,为研究MK的生物学活性提供了条件。     

抗人大肠癌单链抗体与绿色荧光蛋白融合基因的构建和表达

目的构建并表达绿色荧光蛋白(GFP)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,产生具有荧光的抗体。方法将鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的基因克隆到pET28a(+)-GFP的表达载体,转化到大肠杆菌BL21中进行融合基因ND-1-scFv/GFP诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化,免疫印迹和荧光显微镜方法验证融合蛋白的表达。结果 ND-1scFv被克隆到表达载体pET28a(+)-GFP中,诱导表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量为58kDa。SDS-PAGE灰度扫描结果显示纯化后的蛋白纯度为90%,荧光显微镜检测显示,表达有目的蛋白的大肠杆菌BL21具有明显的绿色荧光。结论成功构建并表达融合基因ND-1-scFv/GFP,为该单抗的肿瘤特异成像研究奠定了基础。E.coli     

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。     

重组融合蛋白GX1-rmhTNFα的克隆、表达及鉴定

目的构建胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子(GX1-rmhTNF)基因的原核表达载体,表达GX1-rmhTNF蛋白。方法利用基因工程方法将胃癌血管特异性结合肽融合在新型人肿瘤坏死因子α的氨基末端,构建GX1-rmhTNF原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析。结果成功构建了GX1-rmhTNF重组融合表达质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量(Mr)约18000处出现了1条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TNFα单克隆抗体特异性的结合能力。结论成功构建了GX1-rmhT-NF基因的原核表达载体并在原核细胞中表达了该产物,为下一步GX1-rmhTNF的纯化奠定了基础。     

Characterisation of a panel of monoclonal antibodies raised against recombinant HCV core protein

Hepatitis C virus (HCV) has as yet no practical culture system so any antigen or antibody studies must be carried out using recombinant antigens. In this study, HCV core sequence was amplified by PCR, inserted into pRSET, and expressed in E. coli. The resultant core protein was purified using nickel affinity chromatography which bound the six histidine tag attached to the N-terminus of the protein. After elution in imidazole buffer, the core protein was used to immunise Balb/c mice and monoclonal antibodies against HCV core were raised. Six monoclonals were examined in a variety of assays. All of them recognised the p27 kDa protein which they were raised against and 2D2 and 3D7 recognised the core component of an HCV Recombinant Immunoblot Assay (RIBA). None of the antibodies recognised the linear peptides in an Innolia HCV assay. 2D2 showed cytoplasmic granular staining in 1–5% of cells in frozen sections of HCV infected livers. Cross-competition assays between themselves and human anti-HCV core positive sera divided the antibodies into two main groups (I and II), with a sub-division of group I into a and b. Group I antibodies were unable to be inhibited by human anti-HCV sera whereas group II antibodies were inhibited by these sera (up to 62%). Epitopes recognised by all the monoclonals were probably conformational with the group I epitope being located within the first 105 amino acids of the core sequence and the group II epitope between amino acids 105 and 160. © 1996 Wiley-Liss, Inc.     

小鼠肝炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备并鉴定小鼠肝炎病毒(MHV)N蛋白的单克隆抗体(mAb).[方法]以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的重组N蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术将免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤进行融合,用间接ELISA方法筛选分泌N蛋白mAb的杂交瘤细胞系.并用Western blot和IFA方法对所获得的mAb进行鉴定.[结果]共获得4株稳定分泌抗N蛋白mAb的杂交瘤细胞系,其亚类鉴定2株为IgG2a,1株为IgG2b,1株为IgG1,轻链均为k型.经鉴定4株mAb均能与重组N蛋白发生特异性反应.[结论]成功获得了特异性抗MHV N蛋白的mAb,为进一步研究N蛋白的结构功能及建立诊断学方法奠定了基础.