人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

【目的】提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。【方法】调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pn、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃．最佳抗生素浓度为50μg／mL羧苄青霉素．最适pH值为7．0,在A600为0．9～1．0时加入终浓度为1．0mmol／L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21mg／L．产量较优化前（15mg／L）提高近30％：mK5特异性地抑制HRCEC的增殖．IC50=40nmol／L。【结论】本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数．并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础.[方法]以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5mutl基因,将其克隆进表达载体pET-22b( )中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b( )/K5 mut1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2 -His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定.[结果]PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mutl基因片段,正确插入pET-22 b( )载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量M1≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L.[结论]成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白.     

纤溶酶原Kringle5缺失突变体抑制血管内皮细胞增生的研究

目的 纤溶酶原蛋白水解片段Kringle5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值，但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mutl)并检测其体外活性。方法 除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以降低其相对分子质量，但同时保留K5分子中的所有3个二硫键以保留完整的外环结构域，并在大肠杆菌中表达，亲和层析纯化，获得突变型K5Mutl(Cysl-80)；MTT法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞和周皮细胞的抑制作用。结果 K5Mutl以浓度依赖的方式抑制原代培养的视网膜内皮细胞，EC50(抑制50％细胞增生的药物浓度)约为35nmol／L，是完整K5活性的2倍。在同样浓度范围内，K5Mutl并不抑制同源的周皮细胞，表明K5Mutl特异性抑制血管内皮细胞增生。结论 K5Mutl是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子，在糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。     

人纤溶酶原K5体内抑制Lewis肺癌肿瘤生长与转移

 【目的】 通过体内实验探讨人纤溶酶原Kringle 5(K5)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长与转移的抑制作用?【方法】 采用腋下接种肿瘤细胞的方法建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤小鼠模型,分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,制备小鼠体质量-时间曲线和肿瘤体积-时间曲线;采用皮下种植瘤剔除术建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,术后分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组小鼠肺组织转移瘤数量,取肺组织进行病理学分析?【结果】 在皮下种植瘤模型中,与对照组相比,K5治疗组小鼠肿瘤体积-时间曲线变化平缓,肿块增长缓慢,肿瘤质量明显降低[分别为(4.57 ± 0.79) g和 (1.15 ± 0.31) g,P=0.006];在Lewis肺癌转移瘤模型中,K5治疗组小鼠肺表面转移瘤结节数[分别为(15.75 ± 9.79) 个和 (6.60 ± 3.39) 个,P=0.029]以及肺湿质量明显少于对照组,高倍镜下治疗组肺微转移灶数目亦较少?【结论】 人纤溶酶原K5能显著抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,并能明显抑制Lewis肺癌细胞转移?     

人纤溶酶原K5体内抑制Lewis肺癌肿瘤生长与转移

【目的】通过体内实验探讨人纤溶酶原Kringle 5（K5）对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长与转移的抑制作用。【方法】采用腋下接种肿瘤细胞的方法建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤小鼠模型,分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,制备小鼠体质量-时间曲线和肿瘤体积-时间曲线;采用皮下种植瘤剔除术建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,术后分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组小鼠肺组织转移瘤数量,取肺组织进行病理学分析。【结果】在皮下种植瘤模型中,与对照组相比,K5治疗组小鼠肿瘤体积-时间曲线变化平缓,肿块增长缓慢,肿瘤质量明显降低[分别为（4.57±0.79）g和（1.15±0.31）g,P=0.006];在Lewis肺癌转移瘤模型中,K5治疗组小鼠肺表面转移瘤结节数[分别为（15.75±9.79）个和（6.60±3.39）个,P=0.029]以及肺湿质量明显少于对照组,高倍镜下治疗组肺微转移灶数目亦较少。【结论】人纤溶酶原K5能显著抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,并能明显抑制Lewis肺癌细胞转移。     

人组织型纤溶酶原激活剂cDNA糖基化位点突变体的构建

目的 构建人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ糖基化位点突变体，为ｔ－ＰＡｃＤＮＡ在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统中的表达提供条件。方法 运用ＤＮＡ重组技术，构建ｐＡＨＲ，ｐＡＲＨ质粒，然后应用改良的寡核苷酸诱导定位突变技术，构建ｐＭＡＨＲｐＭＡＲＨ质粒，并用 限制性核酸内刀酶鉴定，核酸序列分析证实。结果 琼脂糖凝胶电     

人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定

目的研究人纤溶酶原kringle区缺失突变体（PLGAK）的毕赤酵母（Pichia pastoris）表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法采用7．5L发酵罐对工程菌PLG△K／GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达,培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测PLG△K等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S-2403分别测定PLG△K激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。结果7．5L高密度发酵可获得约为400mg／L培液的表达量,经三步纯化后制备的PLG△K纯度大于96％。理化分析显示PLG△K的等电点为7．5～7．8,分子量：27．787kD,比活性：23．6U／mg。结论初步建立了PLG△K的酵母高密度发酵及纯化工艺,所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近,具备放大生产和应用的潜力。     

重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用

目的 比较重组葡激酶（ＳＡＫ）及其Ｎ端缺失突变体地纤溶酶原（ＰＬＧ）激活作用的酶动力学常数,探讨ＳＡＫＮ端结构与功能的关系,以进一步改造ＳＡＫ分子。方法 采用酶反应动力学方法结合生物传感器测定ＳＡＫ、△ＮＳＡＫ与ＰＬＧ、纤溶酶（ＰＬＭ）作用的动力学常数。结果 两者与ＰＬＭ形成的复合物催化ＰＬＧ的Ｋｍ值分别为６．２９、４．６μｍｏｌ／Ｌｍ,Ｋｃａｔ值分别为０．７２５ｓ＾－１、０．３１２ｓ＾－１;两者     

人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.     

重组人纤溶酶原Kringle5的标记及其肿瘤显像

目的探讨放射性碘标记纤溶酶原Kringle5(K5)用于肿瘤显像的可行性。方法采用基因工程方法制备的重组人纤溶酶原Kringle5(rhK5),以Iodogen法制备~(125)I-rhK5和~(131)I-rhK5,进行荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像研究。结果~(125)I-rhK5和~(131)I-rhK5的标记率为86%和84%,放化纯度为96%和95%。竞争结合实验表明,rhK5标记后其生物活性没有改变;荷瘤裸鼠体内分布显示,12h肿瘤肌肉组织比可达4.94±0.89;~(131)I-rhK5肿瘤显像示肿瘤部位放射性浓聚随时间逐渐增加,3h可见肿瘤清晰显影。结论Iodogen法制备~(125)I-rhK5和~(131)I-rhK5纯度高、稳定性好。~(131)I-rhK5可进行肿瘤的显像,为肿瘤的显像和治疗奠定了基础。     

具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化

目的构建可溶性的人纤溶酶原Kringle 5(K5)突变体GST-K5M5基因,并在单位体积的原核系统中获得高表达、高纯度、可水溶的融合GST-K5M5蛋白粉针剂。方法 K5M5突变体基因(模板已经对K5N端5个带负电的酸性氨基酸进行中性氨基酸丝氨酸的中性突变),通过PCR从本实验室保存的pET22b(+)/K5mut5 cDNA模板中扩增得到,再克隆到pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统中。用自动诱导培养系统诱导其表达,提高产量。通过GST树脂亲和层析柱分离,双蒸水透析纯化,再制成冻干粉剂保存。结果该重组GST-K5M5蛋白的分子量为37000Mr,通过SDS-PAGE和Western-blot可以检测到其存在。冻干粉复溶的GST-K5M5呈剂量依赖抑制内皮细胞的增殖。结论在以前的研究基础上设计并用自动诱导培养的方法在大肠杆菌中表达纯化出了GST-K5M5融合蛋白,得到的GST-K5M5蛋白产量高、纯度高、可溶性好、生物学效应强,且方法简便、经济,为工业大规模发酵提供了基本参数。     

人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化

目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.     

不相容双质粒共表达人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5

目的构建人内皮抑素（human endostatin,hES）原核表达质粒pET28a／hES并与简化人纤溶酶原饼环区5（predigested human plasminogen kringle 5,predhPK-5）在大肠杆菌中实现共表达。方法RT-PCR法从人肝癌组织中扩增人内皮抑素基因,利用基因克隆技术构建原核表达质粒pET28a／hES。在卡那霉素与氨苄青霉素的选择压力下,将其与pGEX-1λT／predhPK-5共同转化E．coEBL21（DE3）,并诱导表达重组蛋白。同时从连续培养时间与传代次数两方面检测了共转化子的稳定性。结果成功构建了重组质粒pET28a／hES,其与pGEX-1λT／predhPK-5的共转化子在双抗生紊压力下可以共存,并在E．coli BL21（DE3）中成功共表达了人内皮抑素及简化的人纤溶酶原饼环区5,其表达量分别占蛋白总量的20％和21％。在双抗性培养基中培养16h及传代120代,共转化子存活率均大于75％,具有较好的稳定性。结论不相容质粒pET28a／hES与pGEX-1λT／predhPK-5在大肠杆菌中的成功共表达,对基因共表达方法作了有益探索,验证了不相容质粒共表达方法的可行性。     

Kringle5基因的克隆、原核表达载体构建和蛋白表达

目的寻求一条高效且快速获得kingle5蛋白的途径．方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出kringle5基因,构建出原核表达载体pGEX-5X-1／kringle5,运用工程菌表达蛋白．结果测序表明kringle5基因与GenBank上报道的基因序列相同,并成功表达出kringle5融合蛋白．结论成功构建了人原核表达载体（pGEX-5X-1／kringle5）,为获得抗肿瘤药物kringle5提供了一种切实可行的途径,为实体瘤的抗血管生成治疗研究奠定了初步基础．     

人膀胱癌组织Kringle 5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定

目的 构建能够表达分泌性人纤溶酶原krinle 5(K5)的大肠杆菌工程菌,优化表达并鉴定其抗人血管内皮细胞(ECV)304的生物活性. 方法 从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5,运用工程菌表达蛋白.带谷胱甘肽(GST)标签琼脂糖4B亲和柱层析、纯化蛋白,CellTiter 96 AQueous细胞增殖检测法(MTS)检测K5对ECV304增殖影响.结果 PCR扩增得到282 bp片段,并成功插入pGEX-5X-1质粒,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下工程菌表达了特异性融合蛋白,经凝血酶酶切后得到分子量约为12 kD的K5蛋白;K5蛋白能特异性抑制ECV304增殖,抑制率最高蛋白浓度为5 ng/L. 结论 含重组质粒pGEX-5X-1/K5大肠杆菌表达产物量多且易纯化,为包括肿瘤在内的病理性血管增生疾病抗血管生成药物开发做了积极的尝试.     

人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)抑制小鼠肝癌的血管生成和肿瘤生长

[目的]体内、体外实验观察人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)对肝癌血管生成和肿瘤生长的影响.[方法]大肠杆菌中表达,组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5蛋白,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定K5蛋白的表达;MTT法分析K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞(BRCEC)和肝癌细胞株Bel-7402、HepG2增殖的影响;建立皮下种植肝癌鼠模型,瘤内注射K5,检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度(MVD).[结果]SDS-PAGE及Western blot鉴定获得K5纯化蛋白;K5特异性地抑制BRCEC的增殖,IC50=160 nmol/L,而对肝癌细胞株Bel-7402、HepG2的增殖无抑制作用;K5显著抑制小鼠肝癌生长,治疗组肝癌组织MVD明显低于对照组.[结论]K5抑制移植性小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长,特异性抑制血管内皮细胞的增殖可能是K5抑制肝癌血管生成的主要机制.K5具有治疗肝癌的潜在临床价值.