登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～ 4型病毒复制的特异抑制作用     

登革2型病毒43株NS1基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的：研究含登革2型病毒43株（D2－43）NS1基因的重组质粒DNA在幼地鼠肾细胞BHK－21的表达。方法：将含信号肽的NS1基因片段插入到pcDNA3．1的KpnⅠ位点和EcolRⅠ位点之间,获得重组表达载体pcDNA-NS1。用电穿孔法将其导入BHK－21细胞,G418选择培养。挑取单细胞克隆,RT－PCR及蛋白质印迹法鉴定NS1基因的稳定表达,结果：在随机挑取的5个单细胞克隆中,有4个克隆的RT－PCR鉴定为阳性,蛋白质印迹结果表明NS1基因获表达。结论：构建的pcDNA-NS1质粒在BHK－21细胞中有稳定表达,因此含NS1基因的该重质粒DNA可作作核酸免疫。     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系

目的:利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系,为研究E蛋白的结构和功能及其抗原表位提供新手段.方法:以构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,免疫BALB/c小鼠后将其脾细胞和SP2/0瘤细胞融合,通过IFA、间接ELISA和空斑减少中和试验对杂交瘤细胞系进行筛选和鉴定.结果:获得了4株分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系(2B4,6B4,4C10和2D5),它们结合的抗原表位均位于E蛋白Ⅲ区,其中4C10对登革2型病毒具有中和活性.这些单抗与登革1、3和4型病毒有强的交叉反应,但与黄病毒其他成员反应较弱.结论:DNA免疫法可用于分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系的建立,该结果有利于登革病毒E蛋白特异抗原表位的研究及新的登革病毒诊断试剂的研制.     

我国登革2型病毒43株PrM—E基因的构建及其在哺乳动 …

目的：构建我国登革２型病毒４３株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法;采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术的构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ的信号肽序列,完整的ＰｒＭ蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％,Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

我国登革2型病毒prM-E基因与SFV病毒载体重组RNA的构建

目的：构建我国登革２型病毒４３株ｐｒＭ－Ｅ基因的甲病毒（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ,ＳＦＶ）重组ＲＮＡ,为登革新型疫苗的研究奠定基础。方法：首先将含有多种稀有限制酶位点的接头插入ｐＳＦＶ载体的多克隆位点,再把ｐｒＭ－Ｅ基因克隆至该载体中。将获得的重组质粒ＤＮＡ经体外转录后,通过电穿孔法将其转录的ＲＮＡ产物导入宿主细胞,并采用间接免疫荧光法检测ｐｒＭ－Ｅ基因的表达。结果：已获得含多种酶位点的ｐＳＦＶ病毒载体,并且所构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ,在宿主细胞中的表达产物可与登革２型病毒特异抗体起反应。结论：构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ可表达我国登革２型病毒株的特异蛋白。     

包装西尼罗假病毒稳定细胞株的建立

目的 为方便制备西尼罗假病毒,建立可包装西尼罗假病毒的稳定细胞系。方法 构建表达西尼罗病毒（WNV）结构蛋白C、prM和E蛋白的重组质粒pcDNA3.1-CME,转染BHK21细胞后,G418(1 mg/ml)加压筛选;利用流式细胞术、间接免疫荧光染色（IFA）以及Western印迹确证稳定细胞株中3种结构蛋白C、prM以及E蛋白的表达;利用103稀释的含海肾荧光素酶报告基因的WNV假病毒上清感染稳定细胞株,检测荧光素酶活性。结果与结论 所构建的稳定细胞株表达结构蛋白C、prM以及E蛋白;其被WNV假病毒感染后分泌的上清进一步感染BHK21细胞后,BHK21细胞产生荧光,证实该稳定细胞株能够包装出WNV假病毒。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建我国登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ 的信号肽序列、完整的ＰｒＭ 蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％ Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。采用蛋白印迹和间接免疫荧光法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：构建的ＰｒＭ－Ｅ基因全长２ ０１９个核苷酸,序列分析证明其核苷酸序列是正确的。ＰｒＭ－Ｅ基因在ＢＨＫ－２１ 细胞中获得高效表达,表达蛋白可与Ｄ２－４３ 多克隆抗体起特异反应,且表达蛋白主要位于细胞浆中。     

登革2型病毒中国分离株感染性全长cDNA克隆的构建与鉴定

目的：构建登革2型病毒中国分离株（DEN2-43）的感染性全长cDNA克隆.方法：根据我室测定的DEN2-43株病毒全基因组序列,利用长链RT-PCR及融合PCR技术扩增此病毒基因组全长cDNA分子,并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆.将此克隆体外转录后,通过电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒.结果与结论：构建的DEN2-43基因组全长cDNA克隆具有感染性,所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及小鼠乳鼠神经毒力,且可稳定传代.该感染性克隆的构建为深入探讨登革病毒的致病机制及研制新型登革疫苗奠定了基础.     

我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA体外RNA转录物感染性的研究

目的：研究我国登革２型病毒４３株（Ｄ２－４３）基因组全长ｃＤＮＡ体外ＲＮＡ转录物的感染性,为进一步阐明登革２型病毒的致病机制及探索其新型疫苗奠定基础。方法：用ＳＰ６ＲＮＡ聚合酶系统制备Ｄ２－４３基因组全长ｃＤＮＡ的体外ＲＮＡ转录物,纯化后经电穿孔法转染Ｃ６／３６细胞,观察致细胞病变作用以判断其感染性。从病变的细胞和培养上清中提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增及克隆测序的方法证实细胞病变确为ＲＮＡ转录物感染所致;同时收集可产生细胞病变的培养上清,再感染Ｃ６／３６细胞以进一步证实该体外ＲＮＡ转录物感染的稳定性。结果：以我国Ｄ２－４３病毒株基因组全长ｃＤＮＡ为模板制备的体外ＲＮＡ转录物可使Ｃ６／３６细胞产生病变,从病变细胞和培养上清中可扩增获得病毒特异的基因片段。在培养细胞中进行连续传代仍可产生细胞病变作用。结论：构     

扩增我国登革2型病毒全长cDNA分子的融合PCR方法

目的：建立扩增登革2型病型基因组全长cDNA的融合PCR法，为深入探讨病毒基因的结构与功能提供有效的技术途径，方法：根据我国登革2型病毒D2－43株列设计引物，首先采用长链RT－PCR技术扩增病毒基因组5‘及3‘半分子，然而以阗分子采用融合PCR法将两个半分子建成全长cDNA分子，为进一步证实所构建全长cDNA分子的特异性，再以融合PCR产物为模板扩增5‘非编码区序列，与pGEM-T载体连接，在377A型自动测序仪进行序列分析，结果：通过对逆转录反应及PCR扩增条件的优化，建立了制备大片段cDAN及构建全长cDNA分子的融合PCR方法，扩增的我国登革2型病毒的5‘及3‘半分子的半度均为5kb左右，采用融合PCR方法制备的全长cDNA长约11kb，与预期大小一致，非编码区测序结果表明扩增产物为D2－43所特有，结论：所建立的融合PCR方法是构建登革闰因组全成cDNA的有效技术。     

登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的高效表达

目的：在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白B区进行表达，为观察其抗原性和免疫原性奠定基础。方法：将通过PCR扩增的登革2型病毒包膜蛋白B区插入高效原核表达栽体pBAD／Topo ThioFusion，然后在大肠杆菌中利用阿拉伯糖进行诱导表达。时表达产物以免疲印迹和ELISA法进行检测。结果和结论：登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在，表达量约占细菌可溶性总蛋白的62％。表达产物可与登革2型病毒的特异多抗反应，但与登革1、3和4型病毒的特异多抗无交叉反应。登革2型病毒包膜蛋白B区可在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。     

抗登革病毒的天然免疫应答

登革热/登革出血热(DF/DHF)是热带地区最重要的蚊传播病毒性疾病,造成了非常严重的世界公共卫生问题.理解机体天然免疫应答对登革病毒感染的影响有重要意义.病毒入侵宿主细胞是感染过程的第一阶段,也是关键性的阶段,其过程所涉及的细胞蛋白鉴定与机制大部分仍然未知.间质性树突细胞(DCs)是登革病毒感染的靶细胞,也是机体天然免疫防御抗登革病毒入侵的第一道防线.在病毒感染早期.NK细胞分泌的Ⅰ型干扰素(IFN)非常重要.机体内有两个应答登革病毒感染的天然免疫通道,其中一个信号通道利用Toll样受体(TLR)家族成员,探测经细胞内吞作用进入的内涵体病毒,通过信号蛋白诱导IFN产生,并最终活化NF-κB,IRF7、IRF5等转录因子,另一个抗病毒通道则以维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)作为细胞内识别病毒dsRNA的受体.但RNAi天然免疫通道在人类是否存在还有待进一步研究.     

登革病毒C基因突变对病毒RNA复制的影响

目的：分析C基因及其编码蛋白突变对登革病毒RNA复制的影响。方法：利用融合PCR方法在登革病毒复制子中引入C基因相应部位的缺失突变,将复制子RNA转染细胞后,利用报告基因活性分析、间接免疫荧光及实时定量PCR等方法分析其复制水平。结果：获得了含有不同α螺旋缺失突变的C基因的复制子质粒,并发现△α1复制子复制水平明显下降。结论：登革病毒C蛋白α1螺旋或其编码序列对病毒RNA复制具有重要作用。