IL－13：一种B细胞刺激因子

ＩＬ－１３：一种Ｂ细胞刺激因子〔英〕／ＴｈｉｅｒｒｙＤｅｆｒａｎｃｅ···／／ＪＥｘｐＭｅｄ．－１９９４，１７９（１）．－１３５～１４３ＩＬ－１的克隆和表达已获成功。ＩＬ－１３ｃＤＮＡ编码一分子量为１２．４ＫＤａ的多肽，有４个糖基化位点，氨基酸组成与...     

人IL—4选择性剪接变异体（IL—4δ2）cDNA的克隆和序列测定

在对多种细胞因子的激活条件进行对比实验的基础上，我们成功地构建了人外周血激活淋巴细胞ｃＤＮＡ单链库。并采用ＩＬ－４特异引物和ＲＴ－ＰＣＲ技术，在从此库中克隆出了ＩＬ－４ｃＤＮＡ的同时，也获得了其选择性剪接变异体（ＩＬ－４δ２）ｃＤＮＡ。测序结果表明，所克隆的ＩＬ－４δ２ｃＤＮＡ含有成熟ＩＬ－４蛋白的外显子１，３，４编码区和前导肽编码序列，唯编码１６个氨基酸的外显子２在转录后被剪接掉。这一研究为今后进一步探究细胞因子选择性剪接变异体的工作奠定了基础。     

大肠杆菌菌株(λ衍生噬菌体)/PBR322衍生质粒作为人IL-6表达系统的研究

为探索人白细胞介素－６（ＩＬ－６）在原核细胞中高效表达的途径，选用ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＰＥＴ－２８作为表达系统，以聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增了ｈＩＬ－６的互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）的编码区，引入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ位点。用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切后，克隆于ＰＥＴ－２８载体的相应位点，转化ＤＨ５α。选出阳性克隆，经ＤＮＡ序列分析，表明其编码区内无非特异突变。将重组质粒转入ＤＨ５α，筛选阳性克隆，用异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）进行诱导表达。全细菌裂解液进行十二烷基黄酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），结合固化蛋白质的免疫学测定（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）杂交进行分析。结果表明：Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交发现有与抗ＩＬ－６特异结合的蛋白带，以４ｈ的产量最多，激光扫描显示ＩＬ－６的吸收峰占总吸收面积的３７％（４ｈ诱导）。分子量约为２７ｋＤ。实验显示，人ＩＬ－６在原核细胞中实现了高效表达，表达产物具有ＩＬ－６的免疫活性     

小鼠白细胞介素6的cDNA克隆及其在昆虫细胞中的表达

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＬＰＳ刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，扩增小鼠ＩＬ－６ｃＤＮＡ，并克隆构建ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）ＩＬ－６质粒，继将小鼠所得ｃＤＮＡ克隆到ｐＶＬ１３９２载体上，利用杆状病毒ＡｃＮＰＶ表达系统在Ｓｆ９中进行瞬间表达，用ＩＬ－６依赖细胞株ＭＨ６０·ＢＳＦ２检测其表达活性，结果表明，感染后４８ｈ后就具有明显ＩＬ－６表达，由此可见，利用该系统可成功地表达小鼠ＩＬ－６基因。     

构建的人白细胞介素ⅡcDNA表达载体在肝癌细胞中的表达

为进一步开展人白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２）基因修饰的肿瘤疫苗的研究,在已构建的人白细胞介素ⅡｃＤＮＡ表达载体（ｐｃＤＮＡ１／ＩＬ）的基础上,利用脂 本,将其引入人肝癌细胞檄７７２１,通过Ｇ４１８抗性筛选获得阳性克隆,用活细胞计数法检测阳性克隆的细胞培养上清中的Ｌ１－２活性,结果表明ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－２转染的７７２１细胞氛发泌的ＩＬ－２水平明显高于阳性对照ｐＢｃ１２／ＨＩＶ／ＩＬ－２转染的７７２１细胞     

白细胞介素2基因转移的肿瘤细胞克隆的建立及其体内外生长特性的研究

为了开展ＩＬ－２基因转移后免疫原性增强的新型瘤苗抗肿瘤作用的研究，须首先获得ＩＬ－２基因转移后、能够高分泌ＩＬ－２的肿瘤细胞并确定其生长特性。本室构建了含５６３ｂｐ的小鼠ＩＬ－２全长ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２，采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法将ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２转移入Ｂ１６黑色素瘤细胞中，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及活性检测，获得一株高分泌ＩＬ－２（５０６Ｕ／ｍｌ）克隆，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法证实ＩＬ－２基因已转入该克隆中。结果表明ＩＬ－２基因转移的肿瘤细胞体外生长能力没有明显变化，但体内致瘤原性显著下降，从而为制备新型瘤苗打下了基础。     

人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定

目的：克隆中国人ＩＬ－２ｐ４０基因,构建ＩＬ－１２的真核基因表达载体。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ从北京地区人脐血树突状细胞（ＤＣ）中克隆ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因,并进行序列分析。利用ｐｃＤＮＡ３．１和ｐＬＸＰＸＳＮ构建ＩＬ－１２表达载体,转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果：北京地区人ＤＣ中ＩＬ－１２ｐ４０ｃＤＮＡ基因２１０位密码子有独特的结构,为ＧＣＣ（Ａｌａ）。并且２３９和２９１位     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

人白细胞介素13cDNA克隆及序列分析

人白细胞介素１３ｃＤＮＡ克隆及序列分析范灵芝，杨新科，段淑敏，刘彦仿，侯云德白细胞介素１３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３，ＩＬ－１３）是近年来发现的一种新的免疫调节介质［１］，它主要由激活的Ｔ淋巴细胞产生，具有调节单核细胞及Ｂ淋巴细胞的功能，在病毒免...     

小鼠IL—3cDNA逆转录病毒载体的榴建有在NIH3TE细胞中的表达

为了探讨放射损伤小鼠ＩＬ－３基因治疗可能性，本文作者将小鼠ＩＬ－３ｃＤＮＡ亚克隆到逆转录病毒载ｐＬＸＳＮ上。将重组的逆转录病毒载体用电穿孔法和磷酸钙共沉淀法转染双向包装细胞系ＰＡ３１７，经新霉素类抗菌Ｇ４１８选择，得到了多个产病毒细胞克隆。用含有复缺陷病毒的产病毒细胞培养上清转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，得到了数个自发分泌ＩＬ－３的克隆。在去掉Ｇ４１８，传代１５代，约２个月后，这些克隆分泌ＩＬ－３的能力没     

人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)cDNA的克隆

为了研究人碱性成纤维细胞生长因子在治疗神经系统疾病中的作用 ,克隆其 c DN A序列 ,并添加 K ozak序列 ,以用于真核细胞表达。本实验提取我国自建的脑胶质瘤细胞系 BT32 5总 RN A,设计上、下游引物用逆转录 PCR法扩增 c DNA片段 ,然后重组于 p GEM- 3zf( + )载体 ,酶切鉴定插入片段正确后测序。结果 :RT- PCR扩增到 4 73bp的带有 K ozak序列的 c DN A片段。显示 :克隆到碱性成纤维细胞生长因子 c DN A片段 ,可用于真核细胞表达     

大鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆

为获取碱性成纤维细胞生长因子基因将之用于对帕金森病的实验治疗,本研究克隆了大鼠的碱性成纤维细胞生长因子的ｃＤＮＡ。实验用６ 周龄ＳＤ 大鼠卵巢提取的总ＲＮＡ,采用特异引物逆转录ＰＣＲ 获取目的ｃＤＮＡ 片段并将其连入克隆载体ｐＧＥＭ ３ｚｆ（＋ ）中,经ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３７７ 测序仪双链测序后显示,目的片段长４５８ ｂｐ,与文献报道的碱性成纤维细胞生长因子序列相比存在一处碱基序列差异,无内含子。所克隆目的片段应为大鼠碱性成纤维细胞生长因子基因。     

半套式PCR扩增人抗HFRS病毒抗体基因及Fd段基因的克隆和序列分析

从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞（ＰＢＬ） 中提取细胞总ＲＮＡ, 反转录成ｃＤＮＡ 。以之为模板,用半套式聚合酶链反应（ＰＣＲ） 扩增人Ｉｇ Ｇ 抗体Ｆｄ 段及轻链基因,并将Ｆｄ 段基因克隆入噬菌体载体ｐｃｏ ｍ ｂ３ ;经酶切鉴定后,再亚克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ ,筛选阳性克隆测序。经计算机分析,Ｆｄ 段基因的全长为６３９ｂｐ ,编码２１３ 个氨基酸,属于人Ｉｇ Ｇ２ 亚类。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

人白细胞介素15（hIL—15）的基因克隆和序列测定

ＩＬ１５是一种促进Ｔ细胞、Ｂ细胞和ＮＫ细胞生长和分化的细胞因子。本文用ＲＴＰＣＲ方法，自行设计并合成两对引物，成功地从成人脾脏中扩增出ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ，并定向克隆入ｐＵＣ１９载体中。经序列测定证实，为ｈＩＬ１５成熟肽ｃＤＮＡ基因。ｈＩＬ１５基因的获得，为进一步在大肠杆菌中高效表达有活性的重组ＩＬ１５，更深入地研究其作用机理，以及临床应用奠定了基础。     

人IL-18结合蛋白A在CHO细胞中表达的研究

目的 克隆人IL－18结合蛋白A（hIL-18BPa)的cDNA，构建真核表达载体及其在CHO细胞中的表达。方法 采用RT－PCR，自人白血病血细胞株Jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA。将其克隆至T-vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3．1中。以脂质体介导法，将其转染CHO细胞，用G418筛选抗性克隆，ELISA法测定其生物学活性。结果 获得的IL-18BPa的cDNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hIL-18BPa插入载体pcDNA3．1后，成功地构建稳定表达的载体。转染CHO细胞2后，获得可稳定表达hIL-18BPa的基因工程细胞株。经纯化后，证明具有良好的生物学活性。结论 成功地克隆hIL-18BPa基因，并实现了在CHO细胞中的稳定表达，为研究其生物学活性奠定了基础。     

HIV—1gp41基因的分段克隆和表达

目的 在大肠杆菌中表达HIV－1gp41N肽和C肽基因。方法 用PCR方法从含HIV－1gp160基因的质粒中扩增HIV－1gp41N肽和C肽基因,重组人pGEX-4T-1载体,并亚克隆人pGEM7zf( )中测定核苷酸序列,限制性酶切鉴定后进行原核表达。结果 成功地扩增到HIV－1gp41N肽和C肽基因,酶切鉴定及测序结果与已知HIV－1亚型的gp41N肽区和C肽区基因序列一致,SDS－PAGE结果显示,表达出与预期分子量大小相同的蛋白。结论 N肽和C肽基因的成功表达,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

人扁桃体B淋巴细胞mRNA的差异显示分析及活化B细胞表达的新EST的分离

目的分离新的Ｂ细胞活化基因。方法采用差异显示反转录ＰＣＲ技术（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）对人扁桃体活化和静止Ｂ细胞ｍＲＮＡ的差异显示情况进行分析，对显示片段进行克隆并行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析，对Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交阳性的ｃＤＮＡ片段进行测序并比较同源性。结果差异显示分析共获得明显差异表达的ｃＤＮＡ片段６２条，选择主要表达于活化Ｂ细胞上的２０条ｃＤＮＡ片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，并逐一对静止和活化Ｂ细胞ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析，其中６条ｃＤＮＡ片段在活化Ｂ细胞中呈Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交阳性且与差异显示情况相符，对它们进行测序，然后通过国际互联网与ＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬ和ＤＤＢＪ的ＤＮＡ数据库比较序列同源性，发现其中４个克隆与已发现的基因具明显同源性，一个克隆是新的，另一个克隆虽然与人Ｔ细胞分泌的趋化因子Ｉ－３０９同源性达９５％，但二者转录本不同。结论通过ＤＤＲＴ－ＰＣＲ分离到两个可能为新的Ｂ细胞活化基因的ｃＤＮＡ片段，这为进一步克隆新的Ｂ细胞活化基因奠定了基础。