Xaf1诱导XIAP-/-成纤维细胞凋亡机制的研究

 利用XIAP-/-成纤维细胞,检测在剔除XIAP的情况下Xaf1诱导细胞凋亡的作用,探索Xaf1诱导细胞凋亡的机制?【方法】 Xaf1诱导的XIAP-/-成纤维细胞凋亡由流式细胞DNA含量来表示,免疫荧光显微镜检测XIAP-/-成纤维细胞中Xaf1的亚细胞分布,共转染并细胞周期 DNA 含量流式细胞术检测Bcl2对Xaf1诱导的细胞凋亡的影响,细胞色素C流式细胞术检测Xaf1对细胞色素C释放的调节?【结果】 Xaf1与TNFα显著协同诱导XIAP-/-成纤维细胞凋亡,凋亡峰值27%?Bcl2能抑制Xaf1诱导的XIAP-/-成纤维细胞凋亡,凋亡峰值由27%下降至6%?在剔除XIAP的情况下,Xaf1仍可诱导细胞色素C释放,峰值为21%?【结论】 Xaf1通过胱冬肽酶非依赖机制释放细胞色素C而诱导肿瘤细胞凋亡?     

Xaf1通过胱冬肽酶非依赖机制释放细胞色素C诱导凋亡

[目的]利用基因开关调节Xaf1-Saos诱导细胞株,检测Xaf1对肿瘤坏死因子受体(TNFR)(外源性)以及线粒体(内源性)凋亡信号通路的影响,研究Xaf1诱导肿瘤细胞凋亡的机制.[方法]流式细胞术DNA含量检测Xaf1诱导的细胞凋亡和Bcl2对Xaf1-Saos细胞凋亡的影响,Gel Mobility Shift Assay检测NFkB的DNA结合活性,激酶分析法检测SAPK/JNK激酶的活性,细胞色素C流式细胞术检测Xaf1对细胞色素C释放的调节.[结果]Xaf1与TNFα显著协同诱导细胞凋亡,凋亡峰值49%,Xaf1的表达抑制TNFα介导的NFkB的DNA结合活性(50%)和JNK/SAPK的活性,Xaf1可释放细胞色素C,而且不被胱冬肽酶抑制剂所抑制(Z-VAD).[结论]Xaf1通过胱冬肽酶非依赖机制释放细胞色素C而诱导肿瘤细胞凋亡.     

Xaf1与TNFα协同诱导细胞凋亡机制的初步探索

 [目的]利用Xaf1诱导细胞株,检测Xaf1与一些细胞凋亡激动剂协同诱导肿瘤细胞凋亡的能力,初步探索Xaf1诱导凋亡的机制.[方法]Xaf1与细胞凋亡激动剂协同诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示,免疫荧光显微镜检测法与细胞核浆分离法检测Xaf1诱导细胞中Xaf1与XIAP的亚细胞分布,免疫沉淀法检测Xaf1与XIAP的关联性.[结果]流式细胞术DNA含量检测发现Xaf1与TNFα显著协同诱导细胞凋亡,凋亡峰值为49%,而Xaf1与阿霉素无协同作用,凋亡峰值为27%,免疫荧光显微镜检测及细胞核浆分离法结果显示Xaf1位于细胞核内,而XIAP却位于细胞质.[结论]Xaf1与TNFα显著协同诱导细胞凋亡,其协同机制可能不是解除XIAP对胱冬肽酶活性的抑制.     

Xaf1与TNFα协同诱导细胞凋亡机制的初步探索

[目的]利用Xaf1诱导细胞株,检测Xaf1与一些细胞凋亡激动剂协同诱导肿瘤细胞凋亡的能力,初步探索Xaf1诱导凋亡的机制.[方法]Xaf1与细胞凋亡激动剂协同诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示,免疫荧光显微镜检测法与细胞核浆分离法检测Xaf1诱导细胞中Xaf1与XIAP的亚细胞分布,免疫沉淀法检测Xaf1与XIAP的关联性.[结果]流式细胞术DNA含量检测发现Xaf1与TNFα显著协同诱导细胞凋亡,凋亡峰值为49%,而Xaf1与阿霉素无协同作用,凋亡峰值为27%,免疫荧光显微镜检测及细胞核浆分离法结果显示Xaf1位于细胞核内,而XIAP却位于细胞质.[结论]Xaf1与TNFα显著协同诱导细胞凋亡,其协同机制可能不是解除XIAP对胱冬肽酶活性的抑制.     

建立doxycycline诱导表达Xaf1的肿瘤细胞株

【目的】为探索XIAP相关因子1（Xaf1）调节肿瘤细胞凋亡的机制，利用基因开关调节系统（Tet-on），拟建立由doxycycline调控表达的Xaf1诱导细胞株。【方法】将pTREHA-Xaf1和pWZL-Hyg质粒用基因转染技术转入稳定表达nTA的Saos-2细胞中。经过hygromycin的抗性筛选，挑出并扩增表达Xaf1的细胞株。在8例实验组中加入doxycycline，和不加doxycycline的8例对照组比较，重复3次实验用免疫印迹法和免疫荧光显微镜检测doxycycline对Xaf1表达的调控。Xaf1诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示。【结果】在30个抗hygromycin的细胞株中，免疫印迹法筛选出5个明显由doxycychne调控诱导表达Xaf1的细胞株，免疫荧光显微镜检测显示doxycycline诱导Xaf1表达于细胞核内。流式细胞检测Xaf1于8h开始诱导Saos细胞凋亡，凋亡率最高约20％，而且不影响细胞周期。【结论】Xaf1-Saos诱导细胞株是研究Xaf1调节肿瘤细胞凋亡机制的良好细胞模型；Xaf1是一种核蛋白，能独立诱导肿瘤细胞凋亡。     

建立doxycycline诱导表达Xaf1的肿瘤细胞株

[目的]为探索XIAP相关因子1(Xaf1)调节肿瘤细胞凋亡的机制,利用基因开关调节系统(Teton),拟建立由doxycycline调控表达的Xaf1诱导细胞株.[方法]将pTREHA-Xaf1和pWZL-Hyg质粒用基因转染技术转入稳定表达rtTA的Saos-2细胞中.经过hygromycin的抗性筛选,挑出并扩增表达Xaf1的细胞株.在8例实验组中加入doxycycline,和不加doxycycline的8例对照组比较,重复3次实验用免疫印迹法和免疫荧光显微镜检测doxycycline对Xaf1表达的调控.Xaf1诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示.[结果]在30个抗hygromycin的细胞株中,免疫印迹法筛选出5个明显由doxycycline调控诱导表达Xaf1的细胞株,免疫荧光显微镜检测显示doxycycline诱导Xaf1表达于细胞核内.流式细胞检测Xaf1于8h开始诱导Saos细胞凋亡,凋亡率最高约20%,而且不影响细胞周期.[结论]Xaf1-Saos诱导细胞株是研究Xaf1调节肿瘤细胞凋亡机制的良好细胞模型;Xaf1是一种核蛋白,能独立诱导肿瘤细胞凋亡.     

紫花牡荆素通过线粒体凋亡途径诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡

目的:研究紫花牡荆素诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用,并探讨其诱导凋亡机制.方法:体外培养人宫颈癌HeLa细胞.细胞凋亡ELISA试剂盒检测HeLa细胞组蛋白/DNA碎片;碘化丙啶染色流式细胞术定量分析Sub-G1细胞百分率;DNA琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带.caspase比色试剂盒检测caspase-3/-9活性;Rh123探针染色FCM检测线粒体膜电位;Western blot检测细胞色素c、Bax、Bcl-2、Bcl-xL和XIAP蛋白的表达.结果:不同浓度的CAS处理48h后,HeLa细胞组蛋白/DNA碎片增加、Sub-G1细胞百分率显著增高、DNA琼脂糖凝胶电泳法观察到典型的DNA梯形条带;CAS处理组caspase-3/-9活性明显升高、线粒体膜电位降低、细胞色素c、Bax显著升高,而Bcl-xL和XIAP蛋白表达水平降低.结论:CAS通过线粒体凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡.     

人巨细胞病毒vMIA蛋白抑制肿瘤坏死因子-α诱导人胚肺成纤维细胞凋亡

目的观察人巨细胞病毒(HCMV)vMIA蛋白抑制宿主细胞凋亡的作用机制。方法构建HCMV UL37xl真核表达质粒并转染人胚肺成纤维细胞(HEL)，经G418筛选，免疫荧光鉴定vMIA的表达。用流式细胞术检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 环己酰亚胺(CHO)攻击后细胞凋亡指数，Western blot方法检测Caspase 8与细胞色素C的表达变化。结果转染pcDNA3．1-UL37xl的HEL细胞可以抑制TNF-α CHO所诱导的细胞凋亡，vMIA的表达可以阻止细胞色素C的释放及Caspase 8的激活。结论vMIA参与巨细胞病毒抑制细胞凋亡的作用。vMIA作用于凋亡信号途径中Caspase 8的下游、细胞色素C的上游。它通过阻止细胞色素C的释放发挥作用。     

5-AZA-CdR联合EGCG对HL-60和K562的影响

目的 探讨细胞因子INFα和甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA-CdR)能否诱导HL-60和K562 Xaf1表达,以及Xafl表达诱导剂联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是否具有协同抗癌作用.方法 (1)1000U/mlINFα和不同剂量的5-AZA-CdR作用于HL-60和K562 48 h.通过RT-PCR检测Xaf1和XIAP mRNA的表达并比较差异.(2)最佳Xaf1表达诱导剂联合EGCG作用于白血病细胞,流式细胞技术检测Bcl-2家族成员、线粒体膜电位和细胞凋亡的情况.结果 (1)随5-AZA-CdR剂量增加,HL-60和K562 Xaf1 mRNA表达增加,INFα也能诱导Xaf1表达,以5-AZA-CdR(5 μmol/L)的作用最强;ISFα和5-AZA-CdR均不影响XIAP mRNA的表达.(2)5-AZA-CdR和EGCG可改变HL-60和K562细胞Bcl-2(Bcl-x1)和Bax的表达,降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡,二者联合作用被加强.结论 (1)INFα和5-AZA-CdR能诱导HL-60和K562 Xaf1 mRNA的表达,且5-AZA-CdR的作用具有剂量依赖性.(2)5-AZA-CdR和EGCG在体外能诱导白血病细胞凋亡,并具有协同效应.     

芸香诱导K562细胞凋亡时细胞色素C表达变化

【目的】研究芸香诱导白血病K562细胞凋亡过程中细胞色素C的表达。【方法】体外培养K562细胞,Hoechst33342/PI双荧光染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态,分离细胞线粒体和胞浆,经SDS-PAGE电泳分离蛋白,Western Bloting检测线粒体、细胞浆细胞色素C表达。【结果】芸香浓度为2×10-5、4×10-5、8×10-5mol/L时,细胞生长受到显著抑制,并呈剂量依赖性;Hoechest33342/PI双荧光染色可观察到明显核固缩、凝集等细胞凋亡表现,Western Bloting检测4×10-5mol/L药物处理细胞后线粒体细胞色素C表达水平下调,细胞浆出现明显细胞色素C蛋白条带。【结论】芸香诱导白血病细胞发生凋亡,可能与线粒体途径有关。     

维生素C对紫外线诱导HLF细胞凋亡的保护作用

目的 探讨紫外线诱导人HLF细胞凋亡对DNA降解特点，以维生素C对紫外线诱导细胞凋亡的保护作用。方法 紫外线（UVB）分别照射体外培养的人肺成纤维细胞3min和5min，同时添加维生素C（50μmol/L）。设立对照组。利用吖啶荧光染料染色鉴定凋亡细胞，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。结果 紫外线可以诱导人肺成纤维细胞凋亡，作用存在时间效应关系。紫外线诱导人肺成纤维细胞凋亡时，未出现典型的DNA ladder现象。维生素C对于紫外线诱导的细胞凋亡有显著的抑制作用。结论 DNAladder不能作为细胞凋亡的唯一的标志，紫外线诱导的细胞凋亡与DNA ladder的出现并不总是一致的。维生素C具有拮抗紫外线诱导的细胞凋亡作用。     

白藜芦醇诱导大鼠原代脂肪细胞凋亡及机制

【目的】 探讨白藜芦醇(Res)对大鼠原代脂肪细胞凋亡的影响及其机制?【方法】 培养大鼠原代脂肪细胞,添加不同剂量的Res干预,用Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察细胞核形态;用DNA Ladder实验观察DNA断裂的条带;检测各组培养基和细胞内的乳酸脱氢酶(LDH)含量,计算LDH漏出率;用流式细胞仪测定细胞凋亡率;Western blot检测相关位点,包括沉默信息调节因子1(Sirt1)?细胞色素C(Cytochrome C)?半胱天冬氨酸酶家族(Caspase 9和Caspase 3)的蛋白质表达?【结果】 经过Res干预后,细胞核染色质高度凝集,电泳后出现180 ~ 200 bp整数倍的寡核苷酸片段?细胞LDH漏出率升高,呈剂量-反应关系(P < 0.05或P < 0.01)?Res作用后细胞凋亡率明显上升,呈剂量-反应关系(P < 0.01)?Sirt1?Cytochrome C?活化的Caspase 9及Caspase 3表达水平上升,胞浆Cytochrome C释放也增加?【结论】 Res促进原代脂肪细胞凋亡,其机制可能是通过增加Sirt1表达,经由线粒体凋亡途径,作用于Caspase 9和Caspase 3     

氧化苏木素诱导人乳癌MCF-7细胞凋亡及其作用机制

【目的】 探讨氧化苏木素对人乳癌MCF-7细胞的凋亡作用及其相关作用机制。 【方法】 MTT实验检测氧化苏木素对MCF-7细胞和正常乳腺上皮细胞MCF 10A的细胞毒作用;Annexin V/PI双染,流式细胞仪检测细胞凋亡的发生;荧光染料DiOC6染色,流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位的变化;Western blot实验检测细胞浆细胞色素C及细胞内caspase-9和survivin蛋白的变化。 【结果】 氧化苏木素对人乳癌MCF-7细胞具有高效的细胞毒作用,而对正常乳腺上皮MCF 10A细胞毒性较弱,IC50值分别为(7.15 ± 0.43)μmol/L 和(33.56 ± 2.87) μmol/L;0、7.5、15、30 μmol/L的氧化苏木素处理MCF-7细胞48 h后,细胞的凋亡率从(3.37 ± 0.66)%依次升高到(16.8 ± 1.27)%、(31.31 ± 4.22)%、(51.23 ± 5.55)%;DiOC6染色流式细胞仪检测结果显示氧化苏木素可以剂量依赖性地降低线粒体膜电位;Western blot结果显示氧化苏木素诱发了线粒体内细胞色素C的释放和细胞内caspase-9蛋白的剪切激活,同时氧化苏木素也可剂量依赖性地降低survivin蛋白的表达。 【结论】 氧化苏木素可通过线粒体通路诱导MCF-7细胞凋亡,下调survivin蛋白可能是其诱导细胞凋亡的主要机制。     

京尼平苷对大鼠前列腺成纤维细胞增殖的影响

【目的】研究京尼平苷对大鼠前列腺成纤维细胞增殖的影响,并探讨其机制。【方法】培养SD大鼠前列腺成纤维细胞,取对数生长期的细胞随机分成4组：对照组、京尼平苷10mg/L、20mg/L和40mg/L组。不同浓度的京尼平苷孵育大鼠前列腺成纤维细胞48h后,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,ELISA法测定Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原与转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白的含量。【结果】与对照组比较,京尼平苷20mg/L和40mg/L可显著抑制大鼠前列腺成纤维细胞的增殖（P〈0.01）,促进其凋亡（P〈0.01）,同时减少TGF-β1的分泌和胶原的合成（P〈0.05或P〈0.01）。【结论】京尼平苷可抑制大鼠前列腺成纤维细胞的增殖,可能与其减少TGF-β1的分泌和胶原的合成、促进前列腺成纤维细胞的凋亡有关。     

C2-神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡

目的 观察无血清条件下神经酰胺对人肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用。方法 采用AO-EB荧光染色、流式细胞术DNA倍体分析和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果 终浓度10μmol/L的C2-神经酰胺作用24h，可诱导无血清培养的SMMC-7721细胞发生凋亡，AO-EB染色可见典型的细胞凋亡表现，细胞核固缩、浓染、裂解，细胞质芽突脱落成为凋亡小体。经流式细胞仪检测可见典型的亚二倍体峰。DNA凝胶电泳呈现典型的180-200bp的DNA梯状条带。结论 C2-神经酰胺可诱导SMMC-7721细胞凋亡。     

硒对紫外线诱导HLF细胞凋亡的保护作用

目的：探讨紫外线诱导人HLF细胞凋亡时DNA降解特点，以及硒对紫外线诱导细胞凋亡的保护作用。方法：紫外线分别照射体外培养的人肺成纤维细胞3min和5min，同时添加亚硒酸钠（8ng/ml），设立对照组。利用吖啶橙荧光染料染色鉴定凋亡细胞，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。结果：紫外线可以诱导人肺成纤维细胞（28代）凋亡，作用存在时间效应关系。紫外线诱导人肺成纤维细胞凋亡时，未出现典型的DNA ladder现象。硒对于紫外线诱导的细胞凋亡有显著的抑制作用。结论：DNA ladder不能作为细胞凋亡的唯一的标志，紫外线诱导的细胞凋亡与DNA ladder的出现并不总是一致的。硒具有拮抗紫外线诱导的细胞凋亡作用。     

阳和汤小鼠血清促进淋巴细胞增殖和阿霉素诱导的HL-60细胞凋亡

目的:观察阳和汤小鼠血清对淋巴细胞增殖和阿霉素致肿瘤细胞死亡的影响。方法:MTT法检测细胞增殖,Western blotting检测bax/bcl-2表达,Histone/DNA ELISA检测细胞凋亡,ELISA与分光光度法分别检测细胞色素C释放和caspase-3激活,流式细胞检测线粒体膜电位。结果:阳和汤小鼠血清能增强小鼠淋巴细胞增殖和对阿霉素的抵抗,但促进阿霉素引起的HL-60细胞生长抑制、DNA断裂、细胞色素C释放和caspase-3激活,上调其bax/bcl-2表达比率,增加细胞凋亡。结论:阳和汤有增强阿霉素抗肿瘤作用,激活肿瘤细胞凋亡通路可能是其化疗增敏的主要机制。     

眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d诱导NB4细胞凋亡及其机制研究

目的探讨眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d诱导NB细胞凋亡的机制。方法MTT法测定CTX-d体外细胞毒作用,电镜、流式细胞仪观察CTX-d对NB4细胞的诱导凋亡作用,流式细胞仪检测NB4细胞线粒体膜电位的变化,Western-blotting测定胞浆细胞色素C及caspase-9、caspase-3的变化。结果CTX-d作用NB4细胞6、12h的IC50分别为1.8、1.35μg/mL;CTX-d引起NB4细胞线粒体肿胀、核固缩等形态学改变;诱导NB4细胞出现亚G1期的凋亡峰,且有时效及量效关系;CTX-d(1.0μg/mL)作用0.5h,NB4细胞线粒体膜电位已开始下降,同时在胞浆中检测到细胞色素C,显示细胞色素C已由线粒体释放入胞浆;caspase-9酶原的量在CTX-d(1.0μg/mL)作用1h时开始下降,而活化的caspase-3片断在0.5h即检测到,表明除了通过caspase-9,CTX-d还可能通过其他途径激活caspase-3。结论CTX-d可通过降低线粒体膜电位、细胞色素C释放,激活caspase-9和caspase-3,从而诱导NB4细胞凋亡,还可能通过其他途径激活caspase-3,参与凋亡作用。     

幽门螺杆菌Tipα蛋白对巨噬细胞凋亡的影响

目的研究幽门螺杆菌(Hp)肿瘤坏死因子α诱导相关蛋白(Tipα)对巨噬细胞细胞凋亡的影响。方法体外培养巨噬细胞,采用不同浓度的Tipα蛋白与之孵育后,流式细胞术检测检测细胞凋亡情况,比色法检测细胞caspase-9和caspase-3的活化程度。ELISA法检测细胞色素C的释放量。结果巨噬细胞细胞经不同浓度Tipα蛋白刺激后,可显著诱导其凋亡。Caspase-3和Caspase-9的活性也随着Tipα蛋白浓度的增高而增加。此外,细胞色素C的释放水平也与Tipα浓度成正相关。结论 Tipα蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,有可能通过线粒体途径诱导巨噬细胞细胞的凋亡。     

槲皮素诱导耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300凋亡

 【目的】 研究槲皮素对耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞株U2-OS/MTX300的增殖抑制和诱导凋亡作用及相关机制。【方法】 以不同浓度槲皮素及甲氨蝶呤处理U2-OS及U2-OS/MTX300。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及平板克隆检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Hochest 33258 染色及流式细胞仪检测凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-PARP,Bax,Bak,Bcl-2及Bcl-XL表达。【结果】 槲皮素可明显抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞U2-OS/MTX300的增殖,72 h IC50值为(22 ± 4)μmol/L、10、25、50μmol/L可显著抑制U2-OS/MTX300克隆形成数量,且随剂量增加抑制作用明显增强。槲皮素与甲氨蝶呤之间不存在交叉耐药性。槲皮素能诱导U2-OS/MTX300细胞S期阻滞,并可诱导胞内产生典型凋亡小体,流式细胞仪可检测到明显凋亡。其作用机制是通过上调Bax,Bak及下调Bcl-2表达,促进cytochrome C释放及诱发PARP等重要胞内蛋白断裂来实现。【结论】 槲皮素可显著抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300细胞增殖并诱导其凋亡,线粒体途径可能是其诱导凋亡的重要机制。