pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景:Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。目的:构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。方法:设计和合成包含5’非转录区的约2000bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coliDH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组:对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。结果与结论:重组质粒DNA测序结果采用NCBIblast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强(P<0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

克隆并应用计算机软件分析小鼠LASS1基因启动子区的特征

目的:克隆并应用计算机分析小鼠LASS1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控奠定基础。方法:实验于2006-03/07在汕头大学医学院细胞衰老实验室完成。培养EC109细胞株,预测小鼠LASS1基因启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,构建重组质粒pGEM-T-501、pGEM-T-181、pGEM-T-26,并转化JM109感受态菌,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,酶切pGEM-T-501、181、26重组质粒及pGL3-Basic、pEGFP-1载体,制备插入片段和载体,构建重组表达质粒pGL3-501、pGL3-181和pGL3-26及pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26,转化JM109感受态菌。用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①在预测启动子区构建了3种荧光素酶报告基因表达体系及3种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系,分别为pGL3-501(-501bp～ 106bp)、pGL3-181(-181bp～ 106bp)、pGL3-26( 26～ 106)、pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26。②pGL3-501表达载体与pGL3-181表达载体荧光素酶表达活性相近,pGL3-26表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近, 26bp～ 106bp无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-501和pEGFP-181有明显的绿色荧光蛋白表达,pEGFP-26和空载体pEGFP-1无表达活性。结论:-181bp～ 26bp区域含有小鼠LASS1基因转录所必需的基本启动子序列。其中2个SP1保守序列是小鼠LASS1基因启动子所必需的。     

小鼠adam10基因启动子克隆和双荧光素酶报告基因系统构建及鉴定

本研究旨在克隆小鼠adam10基因启动子,构建以adam10基因启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究adam10基因转录调控提供有效工具。以BALB/c小鼠脑组织为模板,采用PCR方法克隆小鼠adam10基因启动子序列至pCR-Blunt载体,酶切后连接至荧光素酶报告质粒pGL4.10启动子区域,构建重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,采用阳离子脂质体法与阳性对照质粒pGL4.74共转染真核细胞293FT,以离子霉素刺激为刺激组、DMSO为未加干预组,同时以不含启动子的pGL4.10与阳性对照质粒pGL4.74共转染组为阴性对照组,化学发光仪检测荧光强度及比例。结果表明,酶切及测序验证克隆的adam10启动子序列正确且无突变,构建的重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10与阳性对照质粒pGL4.74载体成功共转染293FT细胞,pGL4.10-adam10转染细胞后具有转录活性。离子霉素刺激组活性明显高于DMSO组,荧光比值约为DMSO组2倍(P<0.05),阴性对照组不具备转录活性。结论:成功克隆了adam10启动子并构建了重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,离子霉素可增强adam10基因启动子转录活性。     

kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性

为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制，构建了kir3dl1基因启动子．荧光素酶报告载体，分析其在K562细胞中的活性。采用PCR方法从含有kit3dl1基因转录起始位点5’侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列，插入经Bg1II和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic；采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞，应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性；采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响。结果表明：成功构建了含有254bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DL1-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定；荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照，且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减。转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76％-92％之间。结论：成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体，本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染，kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性。     

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测

目的:X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡,其具体转录调控机制尚不十分清楚.克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子,检测干扰素对其转录活性的影响.方法:实验于2006-05/2007-07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成.①材料:结肠癌细胞株Lovo和Sw1116来自美国 American Type Culture Col-lection.pGL3 basic载体,内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferase reporter Kit,T4 DNA连接酶,限制性内切酶Kpn I和XhoI均由Promega公司提供.②实验方法:采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段,将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3 basic载体上,获得的报告基因质粒命名为pLUC107,瞬时转染Lovo和Sw1116细胞株,经α-干扰素刺激处理,启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示.结果:①PCR扩增结果:在预期的271 bp处出现清晰DNA片段,无非特异扩增现象,证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物.②重组质粒的酶切鉴定及测序:重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271 bp的DNA片段,与理论值相一致.DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功.③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响:与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Sw1116细胞的荧光素酶相对活性值比较,经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高(P均 < 0.05),且升高幅度与α-干扰素呈剂量依赖性.结论:成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段,并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性.     

MTS1基因β启动子转录活性研究

目的 研究IMTSl基因β启动子在急性T淋巴细胞白血病细胞株中的转录激活情况，鉴定β启动子转录活性的功能片段区。方法 用DNA重组方法，构建MTS1基因口启动子3′端转录起始点相同，而5′端序列不同的7种pGL3重组质粒。用脂质体介导的基因瞬时转染法，将构建的重组质粒分别转染MTSl基因双等位缺失的Jurkat细胞株，检测pGL3重组质粒中荧光素酶报告基因的表达，观察β启动子在Jurkat细胞中的激活情况及其基础转录活性片段区。结果 成功构建了MTSI基因β启动子7种不同片段的重组质粒，它们在Jurkat细胞中均有转录活性，其中0．38kb Sac Ⅱ-Sac Ⅰ酶切片段是MTSl基因β启动子转录活性的基础片段。结论 IMTSlβ启动子可在Jurkat细胞中被激活。     

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测

目的：X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡，其具体转录调控机制尚不十分清楚。克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子，检测干扰素对其转录活性的影响。 方法：实验于2006—05／2007—07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成。①材料：结肠癌细胞株Lovo和Swl116来自美国American Type Culture Col-lection。pGL3 basic载体，内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferase reporter Kit，T4DNA连接酶，限制性内切酶KpnI和XhoI均由Promega公司提供。②实验方法：采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段，将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3 basic载体上，获得的报告基因质粒命名为pLUC107，瞬时转染Lovo和Swl116细胞株，经α-干扰素刺激处理，启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示。 结果：①PCR扩增结果：在预期的271bp处出现清晰DNA片段，无非特异扩增现象，证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物。②重组质粒的酶切鉴定及测序：重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271bp的DNA片段，与理论值相一致。DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响：与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Swl116细胞的荧光素酶相对活性值比较，经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高（P均〈0．05），且升高幅度与α-干扰紊呈剂量依赖性。 结论：成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段，并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性。     

人骨碱性磷酸酶基因启动子的克隆及高水平尿酸对其活性影响的实验研究

目的克隆人骨碱性磷酸酶(BALP)基因的启动子序列并构建荧光素酶报告基因重组质粒,初步探索高水平尿酸(UA)对BALP基因启动子活性是否产生影响。方法首先用聚合酶链反应扩增目的基因5′端侧翼上游627bp(距转录起始位点-473bp至154bp)的片段,纯化扩增产物后行双酶切,后亚克隆至pGL3-basic质粒,构建BALP基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过质粒转染到HEK293细胞内,最后借助双荧光素酶报告基因活性检测的方法,比较3种UA水平条件下(0.0、0.2和0.4mmol/L)对基因启动子活性的影响。结果通过双酶切电泳、基因组测序比对分析,成功构建了BALP启动子荧光素酶报告基因重组质粒。随着UA水平的升高,HEK293细胞中启动子重组质粒的相对荧光素酶活性明显降低,差异有统计学差异(P0.05)。结论高水平UA能够抑制BALP基因启动子的活性。     

急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34启动子的克隆及其核心区鉴定

目的:克隆急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34上游启动子序列并检测其活性、鉴定核心区域。方法:PCR扩增MLAA-34基因启动子区全长片段,将其连接至p GL3-Basic载体,克隆重组质粒;构建一系列MLAA-34基因启动子5'侧翼区截短质粒;将含MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒转染至U937、HEK293细胞,应用双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果:构建了含有MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒;与空载体相比,其启动子活性明显增加(P 0. 001)。MLAA-34最小活性区域位于转录起始位点-402 bp至-200 bp之间,其中包含E2F1,MZF-1,SP1,USF2和STAT3等多个转录因子结合位点。结论:成功构建急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒,鉴定出核心启动子区,其中含有多个潜在的转录因子结合序列。     

Fra-1在乳腺癌细胞中高表达原因及其启动子高转录活性的分子机制研究

目的探讨Fra-1在乳腺癌细胞中高表达原因,以及Fra-1启动子高转录活性的分子机制。方法选取2株人乳腺癌细胞株MDA231和MCF-7、1株人脐静脉内皮细胞株ECV304进行研究。采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应法和蛋白质印迹法分别检测Fra-1mRNA和蛋白的表达情况;构建Fra-1双荧光报告载体,检测Fra-1启动子转录活性;构建Fra-1启动子短截报告载体及相关位点的突变型报告载体,检测短截报告载体及突变型载体转录活性;通过凝胶迁移阻滞试验观察生物素标记的特异性探针与活化因子蛋白-1(AP1)结合情况。结果乳腺癌细胞株MDA231和MCF-7中,Fra-1的mRNA和蛋白的相对表达量及其启动子全长报告载体转录活性均高于人脐静脉内皮细胞株ECV304,差异有统计学意义(P0.05);在构建的一系列Fra-1启动子短截报告载体中,只有pGL3B-256活性明显下降,差异有统计学意义(P0.05);AP1突变型报告载体pGL3B-M2、特异性蛋白1及AP1双突变报告载体pGL3B-M3活性明显低于野生型报告载体pGL3B-M1,差异有统计学意义(P0.05);凝胶迁移阻滞试验观察到生物素标记的特异性探针与AP1结合发生了明显的阻滞效应。结论在体外培养的乳腺癌细胞株MDA231和MCF-7中,反式作用因子AP1通过激活Fra-1基因启动子上调其表达。     

高迁移率族蛋白B1在脂多糖诱导的Caco-2细胞上皮屏障损伤中的作用

目的探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的Caco-2细胞肠上皮屏障损伤中的作用及机制。方法用Transwell小室培养Caco-2细胞,检测跨上皮电阻值(TEER值),当TEER值达到500Ω?cm²时,单层上皮屏障模型建立成功,将其分为对照组,LPS组,LPS+丙酮酸乙酯(ethylpyruvate,EP)组,LPS和EP的处理浓度分别为100μg/mL、50μg/mL,分别于处理后12、24、48、72h用电阻仪测量各组TEER值;24h时用酶标仪检测FITC-右旋糖酐通透率。将细胞接种于6孔板,融合达到80%时给予以上分组及处理,24h后用蛋白印迹法(WesternBlot)检测各组细胞Occludin蛋白、HMGB1、核转录因子(NF-κB)蛋白表达水平;实时聚合酶链式反应技术检测各组细胞Occludin、HMGB1、NF-κB mRNA表达情况。应用SPSS21.0软件进行统计分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果与对照组相比,LPS组12、24、48、72h TEER值(Ω?cm²)明显减少[(514.22±12.59)vs(304.96±9.69),(521.65±13.35)vs(276.21±7.82),(523.99±8.18)vs(206.64±15.85),(491.21±6.72)vs(156.33±10.83),均P<0.05],24h时FITC-右旋糖酐通透率明显增加[(2.58±0.07)vs(1.04±0.06),P<0.05],Occludin蛋白及mRNA表达减少(均P<0.05),HMGB1、NF-κB蛋白及mRNA表达明显增加(均P<0.05);与LPS组比较,LPS+EP组12、24、48、72hTEER值(Ω?cm²)增加[(519.00±5.66)vs(304.96±9.69),(504.69±8.57)vs(276.21±7.82),(453.65±10.74)vs(206.64±15.85),(385.28±7.57)vs(156.33±10.83),均P<0.05],24h时FITC-右旋糖酐通透率明显减少[(1.23±0.11)vs(2.58±0.07),P<0.05],Occludin蛋白及mRNA表达明显增加(均P<0.05),HMGB1、NF-κB蛋白及mRNA表达减少(均P<0.05)。结论LPS引起肠上皮通透性升高,减少细胞间紧密连接蛋白的表达,其机制可能与HMGB1及下游NF-κB蛋白表达增加有关。     

高迁移率族蛋白B1对人T淋巴细胞白细胞介素-2及其受体表达的影响

目的 观察高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对健康人T淋巴细胞白细胞介素-2(IL-2),IL-2受体(IL-2R)蛋白与基因表达的影响,并对其作用机制进行初步探讨.方法志愿参加医学实验的健康成人10人,近期未服用任何药物,无急慢性疾病及脏器功能障碍,分离其外周血T淋巴细胞(2×10~6mL),以植物血凝素(PHA)诱导细胞体外增殖反应.给予不同剂量重组人HMGB1(rhHMGB1,0～1000 ng/mL)刺激12,48 h后收集细胞与培养液上清,采用逆转录聚合酶链反应测定IL-2,IL-2Ra mRNA 表达水平,并应用酶联免疫吸附试验检测上清IL-2、可溶性IL-2R(sIL-2R)蛋白含量.结果 与T淋巴细胞共培养12 h,10、100、1000 ng/mL rhHMGB1刺激后IL-2蛋白分泌水平分别为(0.064±0.017)μL,(0.076±0.033)μL,(0.061±0.02)μg/L,均显著高于对照组[(0.045±0.011)μg/L,P<0.05或P<0.01],IL-2 mRNA表达亦明显增强(P<0.01).但rhHMGB1刺激48 h后随着其作用剂量增加IL-2释放和IL-2 mRNA表达呈下降趋势,1000 ng/mL rhHMGBI刺激组IL-2/sIL-2R比值较10 w/mL组显著降低[(0.036±0.015)vs,.(0.055±0.017),P<0.05],同时IL-2Rα mRNA表达亦明显下调(P<0.01).结论HMGB1能显著影响T淋巴细胞IL-2及其受体的表达水平,HNGB1浓度蓄积和作用时间持续可导致T淋巴细胞免疫应答反应由高至低的转化.     

异丙酚对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型Toll样受体4及高迁移率族蛋白1表达的影响

目的 探讨异丙酚对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠模型的保护机制.方法 将60只大鼠随机分为假手术组(A组)、假手术联合异丙酚组(B组)、心肌缺血再灌注组(C组)、心肌缺血再灌注联合异丙酚组(D组).A组于左心耳根部2 mm处穿线后,不夹闭左冠状动脉前降支及心大静脉,60 min后缝合;B组手术开始静脉泵入异丙酚6 ...     

p38信号通路参与呼吸机所致肺损伤大鼠高迁移率族蛋白B1的表达

目的 研究p38信号通路在呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)大鼠肺组织表达高迁移率族蛋白BI(high mobility group box 1 protein,HMGB1)中的作用.方法健康sD大鼠24只随机分为3组:对照组(A组)不行机械通气,保留自主呼吸;常规通气组(B组)潮气量(Vt)为8mL/kg;大潮气量通气组(C组)Vt为40 mL/kg.机械通气4 h后处死动物,测定支气管肺泡灌洗液中总蛋白水平、白细胞计数以及肺湿干重比值(W/D)和中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)活性.采用Western blot方法检测肺组织HMGB1蛋白和p38激酶活性变化,采用RT-PCR方法检测HMGB1 mRNA的表达.应用单因素方差分析进行不同组别间的比较.结果 通气4 h后,与A组相比,C组总蛋白水平(1.77±0.68)g/L、白细胞计数(106.55±28.17)×10~7 L~(-1)、肺W/D比值(7.16±1.02)、MPO活性(3.94±1.21)U/g、HMGB1蛋白(0.64±0.17)和mRNA(1.17±0.45)表达以及p38激酶活性(0.51±0.12)均明显增加(P<0.05),而B组上述各项指标的变化均无统计学意义(P>0.05).结论大潮气量机械通气可引起大鼠急性肺损伤,p38参与了机械牵张诱导肺组织HMGB1的表达.     

高迁移率族蛋白B1对人脐血造血干细胞增殖分化的影响

目的 观察辐射后骨髓基质细胞(MSC)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的释放,研究HMGB1对人脐血造血干细胞(HSC)增殖分化的影响.方法 体外培养人骨髓MSC,利用ELISA方法 检测经12 Gy γ射线照射后培养上清中HMGB1含量的变化.HMGB1与CD34~+的人脐血HSC体外液体共培养6 d,通过流式细胞术检测CD34~+细胞分化指标(CD13、CD14、CD11c、CD41、CD71)的变化.集落形成实验观察HMGB1对HSC增殖分化的影响.结果辐射后,骨髓MSC培养上清中HMGBl含量为(4.3±0.9)ng/ml,较对照组HMGB1含量[(0.4±0.2)ng/ml]明显升高(P＜0.01).脐血CD34~+细胞表面表达HMGB1受体RAGE、TLR2和TLR4.HSC与HMGB1共培养6d后,与对照组比较,红系(CD71)和粒单系(CD13、CD14、CD11c)标记的表达明显增强,分别为CD13(18.4±3.8)%和(32.6±5.9)%、CD14(12.6±2.7)%和(25.4±4.4)%、CD11c(9.8±2.1)%和(20.3±3.9)%、CD71(26.6±4.6)%和(47.1±7.4)%,而巨核系标记CD41的表达[(1.1±0.4)%和(1.3±0.5)%]无明显变化.集落形成实验示共培养14 d后,红系集落、粒-巨噬细胞集落和总集落的生成较对照组明显增多(P＜0.05),联用抗-TLR2和抗-TLR4抗体可部分抑制这一作用.结论 辐射促进骨髓MSC释放HMGB1,胞外HMGB1可以促进HSC的增殖分化.辐射后,骨髓MSC释放的HMGB1与造血恢复或造血重建的关系值得进一步研究.     

亚低温对脓毒症小鼠肺组织高迁移率族蛋白B1表达的影响

目的探讨自发性亚低温和干预性亚低温对脓毒症小鼠肺组织高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)表达的影响。方法120只BALB/C小鼠(SPF级),随机编号,将号码为10的整数倍的小鼠共12只作为对照(normal control,NC)组,其余108只小鼠作为脓毒症组,以腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)10 mg/kg的方法建立脓毒症小鼠模型,NC组给予同等剂量的生理盐水。脓毒症组造模成功1 h后测量肛温,按T≤36℃和>36℃脓毒症小鼠分为自发性亚低温组和非亚低温组;在自发性亚低温组中,T<34℃的小鼠予以剔除,将剩余的脓毒症小鼠随机分成自发性亚低温观察(naturally occurring mild hypothermia,NOMH)组和保持正常体温(keep normothermia,KN)组,其中NOMH组不给予预热干预,而KN组放在保温箱保持肛门温度在36.0~37.5℃之间;非亚低温组脓毒症小鼠随机分成非亚低温观察(nonhypothermia,NH)组和人工获得性亚低温(artificial mild hypothermia,ATMH)组,NH组不给予降温治疗,而ATMH组给予物理降温法降温,使小鼠肛温维持在34~36℃。各组中分别在建模后6、12 h随机选取4只小鼠,采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、HMGB1浓度。在12 h时,观察各组小鼠的生存率;选取4只小鼠处死后取肺组织,常规苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肺组织病理变化,免疫组化染色观察HMGB1在肺组织中的表达;实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法法分别从mRNA和蛋白水平检测HMGB1的相对表达变化。结果(1)建模后12 h,NOMH组、ATMH组、KN组及NH组生存只数分别为36(40)、6(11)、27(40)、4(11),4组间比较,差异有统计学意义(χ^2=32.286,P=0.002),与另外3组脓毒症小鼠相比,NOMH组的生存率最高(与ATMH组:χ^2=5.222,P=0.022;与KN组:χ^2=6.050,P=0.013;与NH组:χ^2=11.672,P=0.001),但其余各两组之间比较,差异均无统计学意义(P均>0.05);(2)与NC组相比,各组脓毒症小鼠在6 h、12 h的血清TNF-α、IL-6及HMGB1浓度均明显升高(P均<0.05);与NOMH组相比,ATMH组、KN组、NH组小鼠在6 h、12 h的TNF-α、IL-6及HMGB1浓度均明显升高(P均<0.05);NH组在各时间点的TNF-α、IL-6、HMGB1浓度均为最高(P均<0.05);各组脓毒症小鼠组内不同时间点比较,12 h TNF-α浓度较6 h时下降(P均<0.05),而IL-6、HMGB1浓度在12 h时较6 h时上升(P均<0.05);(3)HE染色显示NOMH组肺组织损伤程度最轻,其次为ATMH组;(4)免疫组化染色显示HMGB1蛋白表达由少至多依次为NOMH、ATMH组、KN组和NH组;(5)NOMH组、ATMH组、KN组、NH组脓毒症小鼠肺组织HMGB1蛋白含量分别为0.280±0.013、0.320±0.016、0.340±0.018、0.380±0.014,HMGB1 mRNA相对表达量分别为4.86±0.22、6.02±0.18、6.26±0.20、7.98±0.28,分别较NC组(HMGB1蛋白含量:0.240±0.013,HMGB1 mRNA相对表达量:2.21±0.12)明显升高(P均<0.05);与NOMH组相比较,ATMH组、KN组、NH组肺组织中HMGB1蛋白、HMGB1 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),而NH组表达水平为最高(P均<0.05)。结论亚低温可能通过下调脓毒症小鼠肺组织HMGB1的表达,减轻肺组织损伤,自发性亚低温的改善更为显著。