扇贝防御素基因改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应筛选方法的研究

目的应用改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应(RACE)筛选扇贝抗菌肽基因,寻找基于基因序列同源性的双壳类抗菌肽(AMP)的筛选方法。方法 TRIzol法提取扇贝血淋巴中总RNA。根据贻贝抗菌肽的保守序列设计基因特异性简并引物,进行改良5′RACE钓取可能防御素基因cDNA的5′端序列、AT克隆、DNA测序和同源性分析。结果采用改良5′RACE从扇贝血淋巴RNA中得到多个未知基因的cDNA 5′端序列,挑选600bp以下的基因片段进行AT克隆和DNA测序后得到3个插入片段序列,其长度分别为257、275和511bp。通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库,未发现与之高度同源的基因。结论从扇贝血淋巴中获得的3个5′端cDNA序列可能属于新的基因。应用改良5′RACE能钓取含防御素保守序列的新基因片段,由此表明此方案具有可行性。     

应用cDNA末端快速扩增法扩增PNAS-2基因5''端未知序列的实验研究

硫化砷是中药雄黄的主要成分，其在白血病的治疗中取得了令人瞩目的疗效。我们应用基因表达谱芯片对硫化砷作用前后的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4的基因表达进行检测，结果发现凋亡相关基因PNAS-2（apoptosis-related protein，GeneBank ID：AF229832）在硫化砷作用后表达显著降低。有文献报道PNAS-2是一条与NB4细胞凋亡密切相关的基因，也有学者认为与细胞增殖有关。     

庚型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增

分别在庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）基因５′端非编码区（５′－ＵＴＲ）、非结构（ＮＳ）３及区非结构（ＮＳ）５区设计套式引物，建立逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）检测血清ＨＧＶ ＲＮＡ。在２９９份不同血汪标本中ＨＧＶ ＲＮＡ阳性者４１例，基于５′－ＵＴＲ、ＮＳ３区及ＮＳ５区引物ＰＣＲ的阳性率分别为８７．８％、８０．５％和９７．６％。本研究结果表明根据中国株ＨＧＶ基因ＮＳ５区部分序列设计引     

丙型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增

目的探讨提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）病毒血症的检出率和对变异较大区域的扩增效率的方法。方法分别以ＨＣＶ基因组５＇端非编码区（５＇ＵＴＲ）、非结构基因４区（ＮＳ４）及ＮＳ５ｂ区的引物检测ＨＣＶ，并比较双退火温度与单一退火温度对ＨＣＶ基因扩增效率的影响。结果ＨＣＶ不同基因区（５′ＵＴＲ、ＮＳ４、ＮＳ５ｂ）引物的ＰＣＲ扩增阳性率分别为９２％、６２％、５９％。以双退火温度扩增ＮＳ４区与ＮＳ５ｂ区基因，扩增阳性率分别提高到７７％与７９％。将血清按原血清、１０－１～１０－１０系列稀释后检测，发现２份血清单退火温度ＰＣＲ的检出水平分别为１０－５与１０－７，双退火温度ＰＣＲ检出水平则分别提高至１０－８与１０－９稀释血清。结论５′ＵＴＲ引物对ＨＣＶＲＮＡ的检出率明显高于ＮＳ４区与ＮＳ５ｂ区引物。双退火温度ＰＣＲ可显著提高ＨＣＶＲＮＡ检出的敏感性     

丙型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增

探讨提高聚合酶链反应对丙型肝炎病毒病毒血症的检出率和对变异较大区域的扩增效率的方法。方法 分别以ＨＣＶ基因组５‘端非编码区，非结构基因４区及ＮＳ５ｂ区的引物检测ＨＣＶ，并比较双退火温度与单一退火温度对ＨＣＶ基因扩增效率的影响。     

清除聚合酶链反应扩增产物污染的方法探讨

聚合酶链反应(PCR)具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点。但也常因标本受PCR扩增产物污染而产生假阳性结果。因此，控制外源性DNA污染已成为各实验室非常关注的问题。近年来，人们采用了许多方法消毒处理不同的污染环境和污染物，但结果报导不一。为选择一种消除实验室DNA污染的最佳方法，我们选用六种传统的消毒法进行对比研究。现将结果报告如下。     

菌液直接进行聚合酶链反应快速检测葡萄球菌mecA基因的研究

耐甲氧西林葡萄球菌 (MRS)因其对 β内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等药物的多重耐药而成为危害严重的医院感染病原菌之一 ,不适当的治疗常常造成病情的延误以及病原菌在病房内的流行 ,这就需要临床微生物室快速准确地检测出MRS。应用聚合酶链反应 (PCR)直接检测mecA耐药基因 ,具有高度的特异性和灵敏度且报告时间较快[1]。以往报道的PCR方法都要求先提取细菌染色体DNA做模板 ,我们在实验中发现不进行标本的预处理 ,直接以菌液进行PCR扩增 ,亦可得到满意结果。一、材料和方法1.菌株 :2 15株葡萄球菌多数为本院 2 0 0 1～ 2 0 0 2…     

急性白血病耐药基因的聚合酶链反应研究

ＭＤＲ可能导致ＡＭＬ化疗失败，本文应用ＰＣＲ技术，从基因水平，结合细胞遗传学分析，对ＡＭＬ病人进行ＭＤＲ基因表达与化疗疗效的动态观察。发现２０例初、复诊患者有１５例ＭＤＲ表达，但后者与ＣＲ无线性关系，年龄、性别、ＦＡＨ各亚型、染色体异常与否均与ＭＤＲ表达、ＣＲ取得不相关。单凭ＭＤＲ基因表达难以估计ＡＭＬ病人的预后。     

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法

目的：agrin基因对神经肌肉接l头的形成、维持起着决定作用，也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用．其表达产物在机体内分布广泛。设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法，并检测其特异性、敏感性和可重复性。 方法：实验于2007—04／11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成。以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物，经检索Blast验证特异性，并以Primer5设计构建agrin基因标准品引物。选择清洁级Wistar大鼠交配，获取3日龄乳鼠，取脑，获取mRNA、cDNA，常规反转录一聚合酶链反应获取agrin554个碱基DNA片断。PCR填加T7启动子后，T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品，消化模板。分光光度计测定其浓度，1：5倍比稀释3次；经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品，测序验证特异性。以ACTB引物反转录cDNA，1：5倍稀释3次，构建ACTB基因标准品。常规聚合酶链反应确定、优化反应条件。标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性，融解曲线验证检测方法的特异性，作重复性检测。 结果：①agrin基因有意义链引物序列：GAA GGC CAG GTG CGA ATC A，反义链引物序列：CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G，内标：ACTB基因有意义链引物序列：GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA，反义链引物序列：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG，优化反应条件：95℃变性5S，60℃退火20S，72℃延伸20s。②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均〉0．95。③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求。 结论：绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法。     

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法

目的:agrin基因对神经肌肉接头的形成、维持起着决定作用,也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用,其表达产物在机体内分布广泛.设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法,并检测其特异性、敏感性和可重复性.方法:实验于2007-04/11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成.以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物,经检索Blast验证特异性,并以Primer 5设计构建agrin基因标准品引物.选择清洁级Wistar大鼠交配,获取3日龄乳鼠,取脑,获取mRNA、cDNA,常规反转录-聚合酶链反应获取agrin 554个碱基DNA片断.PCR填加T7启动子后,T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品,消化模板.分光光度计测定其浓度,1∶5倍比稀释3次;经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品,测序验证特异性.以ACTB引物反转录cDNA,1∶5倍稀释3次,构建ACTB基因标准品.常规聚合酶链反应确定、优化反应条件.标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性,融解曲线验证检测方法的特异性,作重复性检测.结果:①agrin基因有意义链引物序列:GAA GGC CAG GTG CGA ATC A,反义链引物序列:CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G,内标:ACTB基因有意义链引物序列:GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA,反义链引物序列:GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG,优化反应条件:95 ℃变性5 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s.②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均＞ 0.95.③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求.结论:绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法.     

聚合酶链反应快速特异诊断肺结核病的初步研究

采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术扩增了46例肺结核患者痰中结核杆菌DNA。结果痰涂(+)/细菌培养(+)组和痰涂(-)/细菌培养(+)组扩增阳性率为100％,痰涂(-)/细菌培养(-)组扩增阳性率为94.4％,而6例肺癌和3例非典型分枝杆菌感染对照组扩增阳性率为0％。显示PCR是诊断肺结核病最特异、敏感和快速的诊断方法。     

荧光定量聚合酶链反应检测人乳腺癌C-erbB2基因扩增及过度表达的研究

目的建立荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测C-erbB 2基因表达水平,探讨其在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。方法建立FQ-PCR法,并以2β-微球蛋白为内对照测定15名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和81例乳腺癌患者外周血中C-erbB 2的表达量。结果C-erbB 2表达水平在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无显著性意义(P>0.05),乳腺癌组均高于前两组(P<0.05),2β-微球蛋白在三组间差异无显著性意义(P>0.05)。81例乳腺癌患者阳性率为50.6%,良性乳腺疾病组为0。C-erbB 2表达与患者年龄和肿瘤大小和类型无关(P>0.05),与乳腺癌临床分期、组织学分级以及腋淋巴结转移相关(P<0.05)。结论FQ-PCR技术是高度灵敏、高度特异的快速定量检测C-erbB 2方法,可有效地诊断乳腺癌并对其疗效、转移和预后进行监测。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的：探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分别检测了40株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因，随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变，并与药敏试验结果作对照分析。结果：所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。40株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H37RV标准株相同，40株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照，用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为93％，特异性为100％。结论：结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR-SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测外周血 Wilm′s瘤基因的表达

Wilm′s瘤基因(WT1)位于人类染色体11P13,与Wilm′s瘤的发生密切相关.近年发现WT1在白血病细胞中高度表达[1],可作为检测微小残留病(MRD)的指标.为此我们采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测了不同类型白血病患者外周血WT1的表达水平,现报道如下. 一、材料和方法 1.标本:69例白血病患者均符合FAB诊断标准,年龄2.2～70岁.对照组为18例非白血病患者和健康志愿者14名,年龄21～24岁. 2.总RNA的提取及cDNA合成:2 ml EDTA抗凝血,提取外周血总RNA,260～280     

巢式聚合酶链反应快速检测贝氏柯克斯体的研究

目的 建立特异敏感的快速检测贝氏柯克斯体的分子生物学方法。方法 采用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法,进行实验室模拟检测。结果 以贝氏柯克斯体ｃｏｍｌ基因（编码２７０００蛋白）为靶标设计了２对引物;该引物特异性实验表明仅贝氏柯克斯体特异性 段可以扩增出来,其余相关立克次体均扩不出;敏感性测试结果可检测出１．５ｆｇdisplay structure     

成年大鼠许旺细胞快速扩增的改良方法

目的对三种来源不同的神经组织进行许旺细胞（SCs）培养，比较其纯度、增殖能力，以找到一个快速获取大量SCs的方法。方法取成年大鼠预变性坐骨神经、成年大鼠新鲜坐骨神经、新生大鼠坐骨神经，使用低浓度胰酶快速消化法结合差速贴壁法分别进行SCs培养，进行形态学观察、S-100免疫细胞化学鉴定，检测并比较各组SCs纯度及增殖能力。结果各组细胞生长状态良好，S-100染色阳性，SCs纯度分别为：成年预变性组98％，成年新鲜组92％，新生大鼠组93％。各组SCs生长曲线表明预变性组细胞较新鲜组及新生组SCs增殖旺盛。结论成年大鼠预变性坐骨神经制作取材方便、细胞量充足，纯度高、细胞增殖旺盛，可以被用作细胞生物学研究及组织工程等研究。     

利用巢式聚合酶链反应方法快速鉴定脓毒症细菌的革兰分型

脓毒症是由各种病原体(主要为细菌)侵入血液循环引起的严重疾病,常见细菌有革兰阳性(G+)球菌和革兰阴性(G-)杆菌.但由于血培养结果往往滞后于临床的要求,所以医师通常应用广谱抗菌药物,或针对G+球菌和G-杆菌联合用药,导致耐药菌增加与扩散、费用增加,并且使厌氧菌、真菌及一些条件致病菌的感染率升高,加重患者病情.所以临床上需要尽早检测出脓毒症致病菌并对细菌分型.本研究中利用16S rRNA基因可变区序列随菌种不同有较大变化这一特点分别设计G+菌和G-菌特异性引物,同时用于扩增脓毒症患者的血液标本,以期对脓毒症感染的G+菌和G-菌进行快速鉴定与分析,为临床用药提供帮助.     

志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测方法的应用研究

目的建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术,为从患者、食品和环境中快速分离和鉴定志贺菌提供技术支撑。方法根据志贺菌ipaH基因序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针;通过对PCR扩增体系和反应条件的优化,建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法;用添加已知志贺菌浓度的样本验证方法敏感性;用志贺菌标准菌株、分离株以及大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性。结果用本研究建立的志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法检测志贺菌,其Ct值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系（Y=-3.93×log（X）＋37.34,R=0.999）,最低检测浓度为30cfu/ml,3株志贺菌标准株,30株志贺菌分离株检测结果均为阳性;而沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等91株其他细菌的Ct值均〉35或扩增曲线成一平滑直线。与常规分离鉴定方法比较差异无统计学意义（P〉0.05,χ^2=0.27）。对于纯菌和食品样品整个检测过程仅需2h和10h。结论志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值。     

一种简便的重组克隆筛选方法——克隆聚合酶链反应法

分子克隆常用 4种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落 :限制性内切酶分析、互补、插入失活、杂交筛选 ,这几种方法均较为费时费力。我们介绍一种克隆聚合酶链反应 (ＰＣＲ)法 ,只需数小时即可筛选数百个细菌菌落 ,费时少 ,且灵敏度高、准确性好。一、材料和方法日本血吸虫磷酸丙糖异构酶 (ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈｓｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ,ＴＰＩ)引物由上海生工生物工程公司合成 ,ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｔ4ＤＮＡ连接酶等购自上海生工生物工程公司 ,小量质粒ＤＮＡ纯化试剂盒、ＰＣＲ产物纯化试剂盒购自上海华美生物工程公司 ,重组质粒ＴＰＩ…     

利用巢式聚合酶链反应方法快速鉴定脓毒症细菌的革兰分型

脓毒症是由各种病原体(主要为细菌)侵入血液循环引起的严重疾病,常见细菌有革兰阳性(G+)球菌和革兰阴性(G-)杆菌.但由于血培养结果往往滞后于临床的要求,所以医师通常应用广谱抗菌药物,或针对G+球菌和G-杆菌联合用药,导致耐药菌增加与扩散、费用增加,并且使厌氧菌、真菌及一些条件致病菌的感染率升高,加重患者病情.所以临床上需要尽早检测出脓毒症致病菌并对细菌分型.本研究中利用16S rRNA基因可变区序列随菌种不同有较大变化这一特点分别设计G+菌和G-菌特异性引物,同时用于扩增脓毒症患者的血液标本,以期对脓毒症感染的G+菌和G-菌进行快速鉴定与分析,为临床用药提供帮助.