比例法检测1875株结核分枝杆菌的药物敏感性

1997～ 1999年 ,我们采用ＷＨＯ/ＩＵＡＴＬＤ全球结核病耐药监测项目[1] 推荐的比例法对 1875株临床分离结核菌株的耐药性进行测定 ,结果报告如下。一、材料和方法1 标本来源 :1997～ 1999年 3 0个县级结核病防治所的痰涂片阳性门诊病人 ,详细询问并记录病史、性别、年龄及用药情况 ,留痰做结核菌培养。培养用酸性Ｌｏｗｅｎｓｔｉｎ Ｊｅｎｓｅｎ(罗氏 )培养基 ,由我实验室统一提供 ,有效期内使用。2 耐药定义 :初治病例为从未接受过治疗或曾接受过少于 1个月治疗的病人 ,其感染的结核菌对 1种或多种抗结核药物的耐药为原发性耐药 ;复治…     

结核分枝杆菌药物依赖性的研究进展

我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核病患者数量居世界第二位。更为严重的是：我国肺结核耐药情况十分突出，耐药率高达46％，在WHO公布的世界38个国家和地区结核病耐药检测资料中，我国在引起警示的国家和地区中名列第一。耐药导致结核病患者化疗失败，造成排菌病例和难治病例增加，并导致更多的人被耐药菌感染，更多的新病例难以治愈。而作为耐药的特殊形式一结核菌药物依赖现象的发现，为结核病的防治又提出新的挑战。     

微孔板法检测结核分枝杆菌对利福平的药物敏感性分析

目的分析微孔板法检测结核分枝杆菌(MTB)对利福平(RIF)的药物敏感性。方法选取2017年6月～2019年6月本院收治的40例肺结核患者,分别对其痰标本中的MTB进行微孔板法检测与罗氏比例法检测,分离培养后行药敏试验。并且以罗氏比例法检测为"金标准",分析微孔板法检测在MTB对RIF的药物敏感性分析中的检测价值,并统计该检测法中RIF的最低抑茵浓度(MIC),判断其界值。结果微孔板法检测MTB临床分离出来的菌株最佳耐药阈值在0.5ug/ml;微孔板检测法MTB对RIF的药物敏感性的准确性为97.50%(39/40)、灵敏度为97.05%(33/34)、特异度为100%(6/6)。结论微孔板检测法检测的准确性、灵敏度、特异度均高,检测价值较好。     

痰标本中结核分枝杆菌培养及药敏检测结果分析

目的 探讨结核分枝杆菌在变色液体培养基中快速培养及药敏试验可靠性.方法 分别采用新型变色液体培养基和改良罗氏培养基对198例痰标本进行分枝杆菌培养及药敏试验,对比分析试验结果.结果 变色液体培养基及改良罗氏培养基检出阳性率分别是37.9%和37.4%.变色液体培养基试验结果平均时间为28 d,耐药率分别为链霉素8.00%、异烟肿5.33%、利福平4.00%和乙胺丁醇4.00%;改良罗氏培养基试验结果平均时间为62天,耐药率分别为链霉素8.11%、异烟肿5.41%、利福平4.05%和乙胺丁醇4.05%;两者结果差异无统计学意义(P＞0.05).多重耐药结果分别为5.33%和5.41%.结论 变色液体培养基是一种适合在基层实验室推广应用的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有快速、简单、灵敏度高的优点.     

2种方法检测结核分枝杆菌对10种药物耐药性的比较

目的　探讨应用比例法检测结核分枝杆菌耐药性的可行性及可比性。方法　用比例法和绝对浓度法分别检测 2 4 0株结核分枝杆菌对异烟肼 (INH)、链霉素 (SM)、乙胺丁醇 (EMB)、利福平 (RFP)、乙硫异烟胺 (TH132 1)、对氨基水杨酸 (PAS)、丁胺卡那 (AN)、卡那霉素 (KM)、氧氟沙星 (OFLX)、卷曲霉素 (CPM)的耐药性。结果　SM、RFP、CPM、PAS、AN、KM绝对浓度法和比例法检出的耐药率无显著性差异 ,而INH、EMB、TH132 1、OFLX用比例法测试耐药率均明显高于绝对浓度法 (P <0 .0 1) ,两法药敏结果INH、SM、EMB、RFP、TH132 1、CPM、AN、KM、OFLX和PAS的符合率分别为 :81.7%、90 .8%、83.8%、97.9%、83.3%、94 .2 %、97.5 %、95 .4 %、83.3%、92 .5 %。结论　比例法和绝对浓度法耐药率的差别主要与选定的药物临界浓度有关。     

微量液体培养基最低抑菌浓度法与罗氏比例法在结核分枝杆菌药敏试验中的价值比较

目的比较微量液体培养基最低抑菌浓度(MIC)法与罗氏比例法在结核分枝杆菌药敏试验中的临床价值。方法以100株结核分枝杆菌菌株(由辽宁省结核实验室提供)为研究样本,分别采用罗氏比例法与微量液体培养基MIC法检测结核分枝杆菌的药物敏感性。结果微量液体培养基MIC法与罗氏比例法检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇、二卡那霉素、利福平、异烟肼、氧氟沙星、卷曲霉素药物的敏感性比较,差异无统计学意义(P 0.05)。结论微量液体培养基MIC法应用于结核分枝杆菌药敏试验中与罗氏比例法有着良好的一致性,且检测速度快,经济适用性好,能够为临床指导结核病用药提供帮助。     

噬菌体法与比例法在结核分枝杆菌药敏检测的比较研究

目的 探讨噬菌体检测技术(PhaB)同时快速检测4种一线抗结核药物耐药性的可能性,分析其临床应用价值.方法 应用PhaB同时测定53株结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇的耐药性,并与比例法的药敏结果比较,对2种方法检测结果不符的菌株进行Bactec-960药敏测定.结果 PhaB检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇药敏结果与比例法药敏结果符合率分别为94.3%、90.6%、96.2%和88.7%.共有7株菌株16个药敏结果PhaB与比例法检测结果不符.Bactec-960检测结果有5株12个药敏结果支持PhaB结果,2株4个药敏结果支持比例法结果.结论 PhaB同时检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇药敏结果与比例法检测结果有较高的符合率,可作为MTB耐药性的快速筛选方法.     

结核分枝杆菌364株耐药结果分析

目的：分析肺结核患者的耐药情况。方法：对沈阳市胸科医院2007-01/2008-05培养阳性的肺结核患者364例进行4种抗结核药物（异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇）的耐药性测定。结果：364株结核分枝杆菌的总耐药率为54.4%,其中初始耐药率为40.2%,获得性耐药率为69.7%;初始耐药率与获得性耐药率比较,差异有统计学意义（2χ=5.43,P〈0.05）。结论：沈阳地区结核病耐药严重,应采取有效的防控措施。     

徐州市结核分枝杆菌耐药原因分析

目的探讨徐州市结核分枝杆菌产生耐药的原因。方法采用发放调查表的方式对161例肺结核患者分别从年龄、收入、职业、文化程度、治疗史、密切接触史等方面进行调查。结果高中及以上文化程度的肺结核患者初治耐药率显著低于初中以下文化程度的肺结核患者(χ2=6.61,P=0.01),复治敏感患者与复治耐药患者在年龄、治疗史方面差异有统计学意义(t=2.99,P=0.01)、(χ2=5.25,P=0.02),中青年肺结核患者耐药率明显高于其他年龄组(χ2=6.30,4.10;P=0.01,0.04)。结论应加强对肺结核患者尤其是文化程度低的肺结核患者的宣教工作,采取切实有效的措施加强对肺结核患者的管理,把直接面视下短程化疗(DOTS)策略[1]落到实处,提高首次治愈率,减少耐药结核病的发生。     

结核分枝杆菌216株抗结核药物耐药性监测分析

2002-01-2004—12从我院微生物实验室中分离出的216株结核分枝杆菌，对临床常用的抗结核药耐药性检测结果进行分析如下。     

基因芯片与罗氏绝对浓度法对结核分枝杆菌耐药检测的效果比较

目的探讨基因芯片与罗氏绝对浓度法检测结核分枝杆菌耐药性的效果。方法对2012~2013年收集的180例标本进行痰液结核分枝杆菌培养,采用基因芯片检测抗结核药利福平和异烟肼的耐药性,同时采用罗氏绝对浓度法药敏检测进行对照,评价其灵敏度、特异度和符合率。结果以罗氏绝对浓度法作为金标准,基因检测结果显示,利福平耐药性的灵敏度为92.3%、特异度为97.1%、准确度为95.0%;而异烟肼的灵敏度为85.4%、特异度为93.9%、准确度为90.0%。基因检测结果显示,利福平存在rpoB基因突变,异烟肼可能存在inhA、katG和ahpC基因突变。结论基因芯片法和罗氏绝对浓度法对利福平和异烟肼耐药性检测具有较好的一致性,但基因芯片更具快速、准确的特点,值得临床推广应用。     

2318株结核分枝杆菌耐多药性分析

目的 探讨贵阳市肺科医院住院结核病患者中的耐药情况,为临床诊断和治疗耐多药结核病提供可靠的科学依据.方法 对2004年1月至2009年8月住院患者的临床分离株进行菌型鉴定后,进行药物敏感性试验,分析不同类型结核病患者的耐药情况.结果 2318株结核分枝杆菌耐多药率为23.8%,初始耐多药率为12.1%,获得性耐多药率为63.8%.结论 目前结核病患者耐药率较高,应尽快加强耐药结核病患者的防治工作,减少和避免耐多药结核病患者的产生.     

用重组噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性

目的　建立一种特异性强 ,灵敏度高的结核分枝杆菌 (结核菌 )的检测及药敏试验方法。方法　采用生物发光技术检测可表达荧光素酶的分枝杆菌噬菌体phage 40 ,对不同细菌的发光反应和药敏试验进行测定 ,探讨噬菌体生物发光检测方法的灵敏度和特异性。结果　phage 40对各种分枝杆菌均有特异性发光 ,对非分枝杆菌发光值很低 ,两者差异有显著性意义 ;不同的分枝杆菌发光值有差异 :卡介苗的发光值最高 ,在 4 2× 10 6 ml时最大发光值为 2 84 7mV ,结核菌的发光值最低 ,H37Ra在 6 4× 10 6 ml时最大发光值为 72 4mV ,H37Rv在 7 6× 10 6 ml时的最大发光值是 74 3mV ;在含抗结核药物的培养基中 ,耐药结核菌的发光强度比非耐药结核菌强 ,其强度差异有显著性意义。phage40的药敏试验结果与常规罗氏培养基法符合率一致 ,可在 72h内得到结果。结论　生物发光技术可快速、敏感地检测结核菌 ,通过发光分析 ,建立了一种简便、快速的药敏试验方法     

噬菌体生物扩增法和最低抑菌浓度法检测结核分枝杆菌氧氟沙星耐药性

目的探讨噬菌体生物扩增法（PhaB）和液体培养基最低抑菌浓度法（MIC）检测结核分枝杆菌（MTB）氧氟沙星（OFX）耐药性的临床应用价值。方法应用两种方法同时检测90株MTB临床分离株OFX耐药性，并与绝对浓度法比较检测结果的敏感性、特异性及准确性。结果90株MTB临床分离株用绝对浓度法、MIC、PhaB三种方法分别测得70株、60株、67株敏感株和20株、30株、23株耐药株。若以绝对浓度法测定结果为判断标准，则PhaB检测OFX耐药性的敏感性、特异性和准确性分别为85．0％、91．4％和90．0％；MIC检测的敏感性、特异性和准确性分别为100．0％、85．7％和88．9％；若以绝对浓度法和MIC测定结果为判断标准，则PhaB检测的敏感性为85．0％，特异性为98．3％，准确性为95．0％。结论PhaB检测OFX耐药性有较高的敏感性和特异性，只需要3d，且操作简单、不用特殊仪器设备，可作为OFX耐药性的快速筛选方法；液体培养基MIC测定OFX耐药性平均需要20d，不能满足快速药敏试验需要。     

探针熔解分析法检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的应用和评价

目的 评价PMA技术检测MTB对INH耐药突变的价值,调查INH耐药突变发生特征.方法 MTB标准株H37Rv来自国家结核病参比实验室,1株INH敏感株和1株katG S315TACC突变株来自厦门市疾病预防控制中心,7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株来自深圳慢性病防治中心、河南省疾病预防控制中心、中国人民解放军第309医院和厦门市疾病预防控制中心.707份MTB临床分离株来自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心,126份MTB涂阳痰标本来自厦门市同安区疾病预防控制中心.MTB标准株H37Rv、7株MTB INH耐药株和833份临床标本均采用厦门致善结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒热裂解法提取基因组DNA,1株INH敏感株和1株katG S315T ACC突变株采用AxyPrepTM细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.熔解曲线分析所检标本与野生型对照在katG315位密码子、inhA启动子区(- 17～-8位点)、ahpC启动子区(-44～-30以及-15 ～3位点)及inhA94位密码子的熔解温度(Tm值)差异判断标本是否发生INH耐药突变.3×105拷贝/反应的野生株和katG S315T ACC突变株以10倍梯度稀释至300拷贝/反应,分析PMA技术的灵敏度.用PMA技术检测7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株,评价特异性,并就其中5种耐药突变进行重复性检验.测序验证PMA技术对833份标本INH耐药性的临床检测效能.结果 PMA技术从核酸提取到结果判断可在3小时内完成,在标准96孔实时PCR仪器上可同时检测46份标本.对野生株和katG S315T ACC突变株的灵敏度均为300拷贝/反应,能够同时区分9种INH耐药相关点突变或缺失,5种耐药突变的Tm值标准偏差均在0.5℃之内.检出的162份突变标本与测序验证结果均一致.临床标本验证突变率为19.4％( 162/833),在所检出的14种INH耐药突变katGS315T( AGC →ACC)、inhA启动子区- 15C→T和katG S315N (AGC→AAC)这3种突变占INH耐药突变标本的83.3％(135/162).结论 PMA技术可快速、灵敏、特异检测结核INH耐药突变.     

中国结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及其耐药性分析

目的 选用间隔区寡核苷酸分型方法对有中国代表性的菌株进行基因分型,研究不同基因型在中国的流行情况,并分析基因型与耐药表型的关系.方法 中国疾病预防控制中心于2007-2008年,按照流行病学抽样的原则从中国31个省收集涂片阳性的结核病患者的临床分离株4 017株,采用比例法进行药物敏感性实验,选用寡核苷酸分型方法对菌株进行基因分型.基因型检出率差异比较采用x2检验.结果 在4017株结核分枝杆菌临床分离株中,北京基因型菌株包括2 500株(62.2％).北方地区来源菌株北京基因型检出率达76.5％(1 913株),高于南方地区检出率(53.2％,1 330株),差异有统计学意义(x2=219.69,P＜0.05).南方地区T1型检出率达13.3％(332株),高于北方地区检出率(4.3％,108株),差异有统计学意义(x2=88.07,P＜0.05).北京基因型在耐利福平(21.7％)、耐氧氟沙星(4.9％)和MDR( 11.3％)的比例都高于非北京基因型的相应菌株比例18.4％、2.4％和7.4％,差异有统计学意义(x2值分别为22.10、14.42和14.83,P均＜0.05).结论 北京基因型目前仍然是中国主要流行基因型,并且比例呈现出地域差别,北方地区显著高于南方地区.北京基因型菌株与耐利福平、耐氧氟沙星和MDR有关.     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变

目的 评价探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的应用价值,为临床检测提供指导依据.方法 613份痰标本于2009年9月至2010年4月收集自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心.结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于国家结核病参比实验室.37株包含结核与非结核分枝杆菌的标准盘由中国药品生物制品检定所提供.首先采用梯度稀释的野生型标准株H37Rv DNA考察探针熔解曲线分析法的分析灵敏度,然后用标准盘验证其检测特异性,最后以测序法为对照方法,采用613份结核分枝杆菌的标本评价该方法的临床应用价值.结果 探针熔解分析法可检测到3拷贝/反应,且能特异检测结核分枝杆菌.613份结核分枝杆菌的检测结果显示,符合要求的583份标本的试剂盒检测结果与测序结果完全一致,其中embB306突变菌株数为34株,embB 378-380突变菌株数为23株,embB 406突变菌株数为3株,embB 497突变菌株数为3株.结论 探针熔解分析法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变特异性好,灵敏度高,能有效地检测临床标本常见乙胺丁醇耐药突变位点,是值得推广的快速检测方法.

Abstract：

Objective To evaluate the potential use of a probe melting analysis (PMA) assay in detecting the embB mutations which confer resistance against ethambutol in Mycobacterium tuberculosis. Methods The analysis sensitivity and specificity of PMA were investigated by detecting a serially diluted H37 Rv DNA and a reference panel from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product. Six hundred and thirteen sputum samples were collected from the Xiamen Center for Disease Control and Prevention, Xiamen First Hospital and Center for Zhangzhou Disease Control and Prevention from September 2009 to April 2010. The PMA assay was then evaluated by detecting 613 clinical isolates and the results were compared with the sequencing results. Results The PMA assay could specifically detect Mycobacterium tuberculosis and had a limit of detection of 3 copies per reaction. The assay results with 613 clinical isolates showed that PMA gave a 100% concordance with sequencing in the 583 qualified samples, among which 34 were mutations at embB 306,23 at embB 378-380, 3 at embB 406 and 3 at embB 497. Conclusions PMA assay is a sensitive and specific method enabling efficient detection of common embB mutations causing ethambutol-resistance. The rapidness of this method together with its reliability would facilitate its use in routine testing.     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

mRNA定量法检测结核分枝杆菌药物敏感性的应用评价

目的评价应用mRNA定量法进行结核分枝杆菌利福平、异烟肼药物敏感性分析的临床应用价值。方法应用定量聚合酶链反应（PCR）方法检测三株结核分枝杆菌标准株在利福平、异烟肼处理24小时后85B mRNA表达水平的变化;并以不同的结果判断标准,比较本方法和绝对浓度法对87株临床分离菌株利福平、异烟肼药敏试验检测结果的差异性。结果利福平或异烟肼敏感株在相应的药物处理24小时后85B mRNA表达水平明显下降,分别为无药对照的0.01%和0.35%以下,而耐药株无明显变化。以85B mRNA的表达水平下降到无药对照的1%以下为敏感,大于10%为耐药,1%～10%之间为可疑进行判断,本方法与绝对浓度法有一致的检测结果。结论85B mRNA可以作为结核分枝杆菌药物敏感性试验的分子标志,应用85B mRNA检测结核分枝杆菌的耐药性是一种快速有效的检测方法。