模式生物斑马鱼在中药活性筛选和毒性评价中的应用进展与展望

斑马鱼作为一种非哺乳类模式生物,因其具有体积小、易饲养、发育快速、繁殖力强、便于观察等优势,在医药研究领域得到了广泛应用。近年来,随着技术和方法的不断改进,模式生物斑马鱼在中药领域的应用也逐渐深入,特别是对中药复杂的有效成分、活性物质以及毒性的评价与筛选。斑马鱼作为一种整体动物模型,能够较为客观地对中药活性物质以及毒性进行评价,实现快速有效的高通量筛选。通过对近年来国内外相关文献的查阅与归纳整理,综述了模式生物斑马鱼在中药活性筛选和毒性评价中的应用进展,主要从抗炎、抗血管生成、促血管生成、抗骨质疏松、抗酒精性肝损伤、抗神经性疾病等活性成分筛选以及肝毒性和胚胎毒性等方面进行总结分析,以期为中药安全性与有效性评价提供新的方法和技术。      

8种雷公藤单体免疫抑制活性的筛选

目的筛选具有免疫抑制活性的雷公藤单体。方法以BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞为研究对象,用刀豆素A(Con A)及脂多糖(LPS)活化淋巴细胞,用噻唑盐(MTT)体外检测雷公藤单体对淋巴细胞的增殖反应。结果有1种二萜化合物及2种三萜类化合物表现了明显的免疫抑制活性,且随着浓度的增大,免疫抑制活性增强。结论雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲有明显的免疫抑制活性。     

雷公藤药材存贮期间成分变化的研究

目的研究雷公藤药材中活性成分之一雷公藤甲素的稳定性。方法以甲醇-水为流动相,采用HPLC梯度洗脱法,测定了雷公藤药材的根、枝、叶中雷公藤甲素在不同存贮期的含量。结果雷公藤甲素在雷公藤药材中的含量随着存贮时间的增长而下降。结论雷公藤甲素在雷公藤药材中有不稳定现象存在。      

HPLC法测定雷公藤提取物中雷公藤甲素及两种生物碱的含量

目的 建立高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定雷公藤提取物中雷公藤甲素、雷公藤精碱和wilfornine F的含量.方法 采用YMC-Pack ODS-A(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钠水溶液为流动相梯度洗脱,210 nm波长处检测,流速1.0 mL/min,温度25℃.结果 雷公藤甲素、雷公藤精碱和wilfornine F在一定范围内均呈良好的线性关系,平均加样回收率在98.81%～99.84%范围内,RSD≤1.42%(n=6).结论 该方法准确、重复性好,适用于雷公藤提取物的质量评价.     

基于斑马鱼模型的鳗弧菌减毒活疫苗的生物安全性评价

利用疫苗对养殖鱼类进行疾病预防正得到逐步应用,而减毒活疫苗通过浸泡方式也能使鱼体获得较高的免疫保护力。利用模式动物斑马鱼对鳗弧菌减毒活疫苗MVAV6203的生物安全性进行了评价。首先进行了疫苗对斑马鱼毒性实验,每条鱼注射免疫的半致死量为9.26×104 CFU;其次分析了鳗弧菌在水体中的存活情况,菌体浓度在1.0×106 CFU/mL条件下,10 d后水体基本检测不到鳗弧菌;最后考察了其在鱼体内的存活情况,注射或浸泡免疫3 d后,鱼体组织匀浆物未检测到该菌,表明鳗弧菌减毒活疫苗具有较好的生物安全性。     

利用模式动物斑马鱼构建中药抗缺氧活性快速评价模型

目的：利用模式动物斑马鱼构建适用于中药抗缺氧活性成分研究的快速评价模型。方法：实验选用AB品系斑马鱼,以红景天胶囊为阳性药,以亚硫酸钠为低氧剂,以斑马鱼缺氧后的神经运动行为作为评价指标,考察受精后发育至3 d、4 d、5 d的斑马鱼幼鱼给药预处理开始时间和24 h、48 h、72 h药物预保护时间,建立斑马鱼幼鱼缺氧模型;基于优化的预处理时间及预保护时间,分别检测各组斑马鱼缺氧后的平均心率、脑组织细胞凋亡数量,进一步验证缺氧模型。结果：实验选用发育至5 d的斑马鱼,给药预保护时间48 h,以斑马鱼缺氧后不同阶段的神经运动行为为评价指标,建立缺氧模型。进一步模型评价发现,红景天胶囊预保护组明显增强了缺氧斑马鱼的平均心率,同时降低了由缺氧导致的脑组织细胞凋亡数量（P<0.01）。结论：亚硫酸钠造模后通过斑马鱼不同阶段的神经运动行为可快速评价中药样品的抗缺氧活性模型,为中药药效成分的筛选发现提供关键模型。     

GC/TOF-MS代谢组学技术研究雷公藤甲素在大鼠体内的急性毒性

采用GC/TOF-MS代谢组学技术研究雷公藤甲素对大鼠尿液中内源性小分子化合物的影响和毒性作用机制,寻找与毒性相关标志物,为雷公藤类药物临床毒性的早期预防和诊断提供依据。SD大鼠随机分为4组,分别为雷公藤甲素高(2.4 mg/kg)、中(1.2 mg/kg)、低(0.6 mg/kg)剂量组及空白对照组。单次灌胃给药后,收集第0、1、3和7天的尿液,GC/TOF-MS进行分析,对尿液中内源性小分子化合物进行鉴定并获取半定量数据,经过主成分分析发现:不同剂量给药和不同时间取样尿液中内源性小分子代谢谱有明显差异,可被清晰区分并呈明显的动态变化轨迹。代谢组学数据分析结果与常规血液生化和组织病理学检查结果基本吻合。研究结果发现,给药引起尿液中的苹果酸、枸橼酸、牛磺酸、谷氨酸、苏氨酸及软脂酸等发生明显改变,提示与雷公藤甲素毒性相关,为潜在的毒性标志物。本研究结果表明,通过测定尿液中小分子代谢物可反映雷公藤甲素对大鼠的毒性,代谢组学技术可以作为药物毒性评价方法。代谢通路分析结果提示,雷公藤甲素对肝脏的毒性机制可能与大鼠肝脏线粒体受损、影响三羧酸循环、氨基酸代谢及脂质代谢有关。     

RP-HPLC法测定五味子中三种成分的含量

目的:建立反向高效液相色谱法测定五味子中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量的方法。方法:采用SUNTEK Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),Dikma Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以水-甲醇梯度洗脱为流动相,流速:1 mL/min,检测波长:254 nm。结果:五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素进样量均在0.02μg~1.0μg范围内与峰面积有良好线性关系,r2=0.999 9、1.0、0.999 8;平均回收率分别为98.5%、98.1%、98.6%;RSD分别为1.2%、1.4%、2.4%(n=9)。结论:该方法方便、准确、专属性好,适用于五味子的质量控制。     

阿霉素对模式生物斑马鱼中abcb4基因表达的影响

目的 选择斑马鱼作为实验对象,研究阿霉素(doxorubicin,DOX)对其abcb4基因表达的影响,进一步了解abcb4基因在斑马鱼多药耐药机制中可能的作用。方法 分别以2 mL/L二甲基亚砜（DMSO）,10 μmol/L DOX及含2 mL/L DMSO的10 μmol/L DOX对斑马鱼胚胎进行药物处理,另以Eggwater处理的胚胎作为对照组。将正常发育的4~16个细胞期斑马鱼胚胎,随机分入以上各组中,药物处理至120 hpf。收集药物处理下的斑马鱼不同时期胚胎运用实时荧光定量PCR和胚胎原位杂交技术,检测abcb4基因在斑马鱼中的表达变化情况。结果 相较于对照组,药物处理的斑马鱼胚胎abcb4基因mRNA表达水平升高(P<0.05),而abcb5基因mRNA表达情况则无明显变化。通过斑马鱼胚胎原位杂交,均在斑马鱼120 hpf胚胎小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且药物处理的斑马鱼胚胎在脑及心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论 DOX能诱导斑马鱼胚胎abcb4基因表达水平增高,对阐明abcb4基因在斑马鱼多药耐药产生机制中的作用具有重要意义。     

雷公藤属3种植物不同群体和个体中雷公藤甲素的研究

目的测定雷公藤属3种植物(雷公藤、昆明山海棠和黑蔓)不同群体和个体中雷公藤甲素(tripto lide),为评价雷公藤药材质量和寻找雷公藤的优质种质奠定基础。方法建立雷公藤甲素HPLC测定方法,并测定了全国主要分布区25个群体91个个体的木质部和韧皮部中的雷公藤甲素。结果黑蔓的雷公藤甲素质量分数很低;雷公藤和昆明山海棠种间的雷公藤甲素差异不明显,个体质量分数木质部为1.0×10-6~5.83×10-5;韧皮部为2.3×10-6~1.030×1-0 4。结论雷公藤和昆明山海棠不同个体雷公藤甲素质量分数最高值与最低值相差约50倍,不同居群雷公藤甲素质量分数最高值与最低值相差10多倍,不同来源的药材质量差异极大,严重影响用药的安全性;雷公藤甲素质量分数高的居群位于浙江西南部和中部、湖南新宁、贵州雷山和安徽黄山;湖南新宁、贵州雷山和浙江江山居群中有雷公藤甲素质量分数极高的个体,值得进一步研究,以寻找质量分数高的优良单株。     

7504与胺菊酯混配对家蝇的毒力测定

用点滴法测定7504、胺菊酯对家蝇的LC_(50),然后按两药的LC_(50)的不同比例进行混配。试验表明:7504的LC_(50)的70％与胺菊酯的LC_(50)的30％的混配增效最显著,混配液对家蝇具有很好的击倒作用和杀灭能力。但毒性没有增加。     

大黄素胶囊小鼠急性毒性试验

目的观察大黄素胶囊灌胃1日后小鼠产生的急性毒性反应和死亡情况,以评价其安全性。方法将大黄素胶囊的内容物大黄素粉以最大浓度给ICR小鼠灌胃给药,发现小鼠没有出现死亡,未测出LD50,故测其最大给药量。结果大黄素粉最大给药量为15g/Kg。结论大黄素胶囊具有较好的安全性。     

妇洁灵的抗炎作用和急性毒性及局部毒性研究

妇洁灵对二甲苯、巴豆油及新鲜蛋清所致急性炎症模型具有明显的抑制作用,妇洁灵小鼠灌胃的LD=L_为35.4=1.15ml/kg,其毒性明显小于芝兰型香水,妇洁灵对家兔皮肤及外阴部无刺激作用,但对眼粘膜有刺激作用,实验结果揭示,妇洁灵是安全、有效、他用方便的妇女卫生保健用品。     

Preliminary Observation on Acute Toxicity of Different Kansui Extractson Zebrafish

目的 评价甘遂不同提取物对模式生物斑马鱼的急性毒性.方法 采用回流提取方法制备甘遂水提物、醇提物、先醇提后水提物;将甘遂不同提取物按几何级数设置浓度梯度,添加到鱼只生活的水中,观察给药后96 h鱼只的死亡情况,以此为判断待测药物毒性大小的依据,采用SPSS 13.0软件计算各药物对斑马鱼的半数致死浓度(LC50).结果 斑马鱼对甘遂不同提取物均表现出急性毒性反应,并呈现出明显的量-毒关系;甘遂水提物LC50为31.00μg/mL,甘遂醇提物LC50为6.89 μg/mL,甘遂先醇提后水提物LC50为4.26 μg/mL.结论 以斑马鱼作为实验动物,发现甘遂先醇提后水提物急性毒性最强,水提物毒性最弱,为进一步认识与评价甘遂的毒性作用提供了依据.     

Acute Developmental Toxicity of Panax notoginseng in Zebrafish Larvae

Objective: To evaluate toxicity of raw extract of Panax notoginseng(rPN) and decocted extract of PN(dPN) by a toxicological assay using zebrafish larvae, and explore the mechanism by RNA sequencing assay. Methods: Zebrafish larvae was used to evaluate acute toxicity of PN in two forms: rPN and dPN. Three doses(0.5, 1.5, and 5.0 μg/mL) of dPN were used to treat zebrafishes for evaluating the developmental toxicity. Behavior abnormalities, body weight, body length and number of vertebral roots wer...     

盐酸头孢他美酯急性毒性实验

目的：观察盐酸头孢他美酯的急性毒性，为临床应用提供依据。方法：给实验小鼠灌服不同浓度的盐酸头孢他美酯溶液，测定小鼠灌胃最大耐受量，采用Bliss法测定小鼠腹腔注射半数致死量（LD50）。结果：实验小鼠灌胃给药的最大耐受量大于12600mg/kg，超过人临床口服剂量的83倍；腹腔注射半数致死量（LD50）为4740.8mg/kg。结论：临床应用盐酸头孢他美酯安全可靠。     

消痔栓的急性毒性实验研究

目的：观察消痔栓的急性毒性，测定其半数致死量。方法：简化机率法。结果：测得消痔栓灌胃给药的半数致死量(LD50)为1137．22mg／kg。LD50可信限为870．96～1479．11mg／kg。平均可信限率为26．74％。结论：消痔栓的半教致死量为有效量的8倍，因而其用药安全性是可靠的。     

倍他福林对小鼠的急性毒性试验

目的：观察倍他福林（Betaphrine）一次性灌胃和尾静脉注射给药对小鼠的急性毒性反应和死亡情况。方法：对昆明系小鼠进行一次性灌胃（ig）和尾静脉注射（iv）给药，连续观察14d。结果：小鼠一次性ig的半数致死量（Median lethal dose, LD50）为893.61（775.43-1029.74）mg/kg，最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）为524.29mg/kg,iv的LD50为195.58（179.76-212.79）mg/kg,MTD为130.50mg/kg。结论：倍他福林对小鼠的急性毒性作用较低。     

布洛芬注射液小鼠单次腹腔注射给药毒性的试验研究

目的观察布洛芬注射液单次腹腔注射以后小鼠的急性中毒反应。方法试验采用ICR小鼠,给药后观察出现的各种应激反应和临床中毒症状。连续观察14d后将动物安乐死,对肉眼所见异常的组织器官进行组织病理学检查。结果给药后,小鼠出现活动减少、困倦、趴伏、呼吸减少的症状。550、467、397、337mg／kg组死亡动物数分别为10、9、2、1,动物死亡数随着剂量降低而减少;287mg／kg组及溶媒对照组未见动物死亡。结论按Bliss法计算,布洛芬注射液小鼠单次腹腔注射给药的LD50和95％可信区间为414．39mg／kg,385．17—445．89。