嗅鞘细胞移植后大鼠损伤脊髓神经生长因子的表达

目的 研究嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓内的神经生长因子(NGF)表达的影响,以从NGF角度探讨嗅鞘细胞移植修复大鼠脊髓损伤的机制.方法 48只SD大鼠用NYU -Ⅱ撞击机(10g-25 mm)损伤T10脊髓制作脊髓损伤(SCI)模型,随机分为嗅鞘细胞组、DMEM组各24只;另设立正常对照组6只.将GFP-嗅鞘细胞细胞悬液移植入嗅鞘细胞组大鼠损伤处,DMEM组用单纯的DMEM/F12液代替,正常对照组不做任何处理.移植术后1d、7d、14 d、21 d,用BBB评分法测定脊髓运动功能,RT - PCR方法比较各时间点NGF表达差异.移植术后第21天应用免疫组化比较嗅鞘细胞组、DMEM组、正常对照组大鼠脊髓损伤区NGF的表达差异.结果 移植后1d、7d、14 d、21 d,嗅鞘细胞移植组运动功能评分均高于同期DMEM组.NGF表达量在术后第1天最高,第7天达峰值,之后缓慢降低.移植后第21天,嗅鞘细胞移植组脊髓NGF表达量高于同期DMEM组和正常对照组.结论 嗅鞘细胞移植可上调损伤脊髓NGF的表达,从而促进了损伤脊髓的修复.     

阿糖胞苷结合神经生长因子体外纯化培养大鼠嗅鞘细胞*

背景：由于嗅鞘细胞终生具有成髓鞘能力,如何利用简单而又经济的方法获得大量较高纯度的嗅鞘细胞是脊髓损伤研究的热点。目的：分析阿糖胞苷结合神经生长因子对大鼠嗅球源性嗅鞘细胞纯化培养的可行性。方法：将差速贴壁后的大鼠嗅鞘细胞首先用含10 mg/L阿糖胞苷的完全培养基培养24 h,然后用含体积分数为1%胎牛血清和25 μg/L神经生长因子的DMEM/F12培养基进行体外培养。观察嗅鞘细胞的生长变化,采用形态学和免疫组化染色对细胞及其纯度进行鉴定。结果与结论：体外培养的大鼠嗅鞘细胞神经生长因子受体NGFRp75染色呈阳性反应,细胞呈双极和三级,伸出细长突出,并渐结成网状,在体外培养的第7天纯度为95%,第9天时为90%,且形态良好。结果提示阿糖胞苷结合神经生长因子是一种简单实用的嗅鞘细胞纯化培养方法。     

改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化培养大鼠嗅鞘细胞*

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是最适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准。 目的：运用改良差速贴壁法+含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法。 设计、时间和地点：观察性对照实验。实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成。 材料：健康成年SD大鼠6只,体质量150~180 ｇ。 方法：①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化的实验。②单纯改良差速贴壁：将单细胞混悬液以8 000个/cm²密度种植于无包被的25 cm²培养瓶中。经12 h+ 24 h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×109 Ｌ-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中继续培养3周。③单纯无血清条件培养液纯化：将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周。④改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化：经12 h +24 h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0~3.0 d后,改换成无血清条件培养液,孵育36~48 h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养。以后视情况每3~5 d半量换液1次,培养3周。 主要观察指标：运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征。采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14 d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度。 结果：①倒置显微镜观察：差速后3 d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难。差速后再运用无血清条件培养液2 d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长。伴少量扁平状“油煎蛋样”细胞。继续培养至14 d可见细胞立体感及折光性最佳,数量和纯度最高。培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间。②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%~75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%~52%,改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化组纯度可达88%~92%。 结论：实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法。     

神经干细胞与嗅鞘细胞联合移植的研究进展

神经干细胞（NSCs）能分化成神经元替代坏死,凋亡神经元,嗅鞘细胞（OECs）是一种特殊类型的胶质细胞,两种细胞联合移植能在中枢神经系统修复过程中起到互补作用,更好地修复损伤组织,改善宿主运动及认知功能。     

嗅鞘细胞的可塑性研究

2004年诺贝尔医学和生理学奖得主Richard Axel和Linda Buck证实：原来认为不具备分化能力的小鼠嗅感觉神经元能够再次进入细胞周期发生分裂．这一发现是嗅觉神经系统可塑性的典型体现。嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）作为嗅觉系统内一种特殊类型的胶质细胞．大量研究证实其可促进中枢神经系统（central nervous system．CNS）损伤的修复。但目前对OECs生物学特性的认识仍存在不同观点．其可塑性的研究近年来逐渐受到关注。可塑性指在变化的内外环境刺激下细胞改变自身特性．在形态、抗原表达和功能上呈现很大程度的可变性。目前被证实OECS表达的抗原有S100β、神经生长因子低亲和力受体（p751、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrill aryacidicprotein，GFAP）、神经肽Y（neuropeptide Y．NPY）、O4和神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）等。     

预损伤嗅黏膜对自体嗅鞘细胞体外培养的作用

目的：比较预损伤嗅黏膜与正常嗅黏膜来源的嗅鞘细胞生长特性和生物学活性的差异。 方法：雄性成年SD大鼠10只，随机分为嗅黏膜损伤组、正常组，5只/组。嗅黏膜损伤组大鼠麻醉后采用自制弯头针，深入鼻腔内直至鼻中隔后1/3处，针尖抵住鼻中隔后切割数下至出血，填塞酒精棉条压迫止血。正常组大鼠不做任何处理。伤后7 d取两组大鼠鼻中隔，将双侧鼻黏膜后1/3从鼻中隔刮下，胰酶消化后体外分离培养嗅黏膜嗅鞘细胞，调整浓度至1×109 L-1，采用改良NASH差速贴壁法进行纯化。 结果：嗅鞘细胞纯度达70%时，正常组需14 d，嗅黏膜损伤组需12 d。正常组培养7 d后细胞进入对数期，嗅黏膜损伤组培养5 d后细胞进入对数期，两组嗅鞘细胞进入平台期后生长趋于缓慢，数量维持在106左右。在细胞生长周期的相同时间点，嗅黏膜损伤组嗅鞘细胞活性大于正常组（t=19.001 3，P < 0.001），两组嗅鞘细胞分泌的神经营养因子3质量浓度基本相似 （P > 0.05）。 结论：预损伤处理嗅黏膜能够加快嗅黏膜嗅鞘细胞的增殖分化，且活性较高。     

嗅鞘细胞培养液对海仁藻酸损伤脊髓神经元一氧化氮产生的影响

目的研究嗅鞘细胞培养液(OECCM)对海仁藻酸(KA)损伤后原代培养脊髓神经元的作用,进一步探讨其保护的作用机理。方法采用原代细胞培养法,分别培养了胚胎小鼠脊髓神经元和成年大鼠的嗅神经鞘细胞(OECs),收集OECCM。通过给予KA建立体外的损伤模型,KA分别作用6,8,12h后,加入OECCM继续培养24￣36h。然后进行抗神经元型一氧化氮合酶(ncNOS)免疫细胞化学染色,观察细胞ncNOS表达情况,并对各组ncNOS阳性神经元数目进行统计,同时运用四唑盐(MTT)比色法检测神经细胞活性;最后对不同组的一氧化氮合酶(NOS)阳性细胞染色情况、阳性细胞数目和细胞活性进行比较。结果KA作用后,一氧化氮(NO)都出现异常表达,但与实验组(OECCM干预组)相比,OECCM处理组NO表达水平明显低于单纯KA损伤组。OECCM处理组NOS阳性细胞数目(6h组,34.3±5.25;8h组,40.6±3.68),明显低于对照组(6h组,42.3±3.48;8h组,54.5±6.30)(P<0.01),在KA损伤12h时,两组NOS阳性细胞数(52.3±5.23vs61.32±6.45)(P<0.05);而细胞活性(6h,0.372±0.034;8h,0.312±0.026)明显高于对照组(6h,0.283±0.041;8h,0.219±0.033)(P<0.01),12h时两组细胞活性没有明显差异(0.199±0.012vs0.202±0.032)(P>0.05)。结论OECCM中可能含有一些保护脊髓神经元免遭KA损伤的因子,这些因子可能在参与抑制NOS异常表达起了重要作用。     

嗅鞘细胞基础与临床研究～2007年回顾

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)作为中枢神经修复学领域重要细胞类型之一,2007年各国神经科学研究者对其细胞学、细胞治疗基础和临床研究继续不断深入。其中Pubmed数据库收录相关文献为63篇,中国知网数据库为70篇,分别比2006年度的49篇和60篇增长14篇(28.6%)和10篇(16.7%)。本文对本年度有关重要研究结果作一汇总。     

大鼠嗅鞘细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化作用的比较研究

目的比较大鼠嗅鞘细胞与星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法分别从新生SD大鼠嗅球、海马、皮质分离、培养嗅鞘细胞、神经干细胞和星形胶质细胞。收集嗅鞘细胞、星形胶质细胞及其上清液,分别对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)进行诱导分化,倒置显微镜下观察细胞的生长情况,并采用免疫组化法对分化细胞鉴定和计数。结果嗅鞘细胞组分化为神经元比率高于星形胶质细胞组(P<0.01)。结论嗅鞘细胞较星形胶质细胞能更好地促进神经干细胞分化为神经元。     

嗅鞘细胞对原代培养神经干细胞增殖、分化的影响

目的 观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖、分化的影响.方法 新生大鼠脑OECs和NSCs原代培养,采用免疫荧光及免疫细胞化学方法鉴定相关细胞.取原代OECs分为2组,实验组去除培养孔的间隔,使OECs和NSCs共用一培养液体系;对照组不破坏培养孔的间隔,单独培养NSCs,其余同实验组.观察2组细胞增殖、分化情况.结果 原代培养的OECs表达神经生长因子受体(P75NGFR);原代培养的神经球表达巢蛋白(nestin),神经球分化的细胞表达神经丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP).增殖实验中,实验组NSCs数量较对照组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05).诱导分化实验中,实验组4d、7d时NF200阳性细胞率较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明2种细胞共液培养时,OECs提高了NSCs向NF200阳性细胞分化率.结论 OECs可促进NSCs增殖,并提高了NSCs向神经元分化的效率.     

Neurosphere cell differentiation to aldynoglia promoted by olfactory ensheathing cell conditioned medium

Cells from central nervous system with morphology similar to radial glia and properties intermediate between astrocytes and Schwann cells were called growth‐promoting glia or aldynoglia. These cells are present in adult brain olfactory bulb, hypothalamus, hypophysis, pineal gland and in the developing brain, and spinal cord (Cameron and Rakic ( 1991 ) Glia 4:124–137; Gudiño‐Cabrera and Nieto‐Sampedro ( 2000 ) 30:49–63). We report now that neurosphere cells, abundantly generated from E15 rat or E13 mouse corpus striatum, differentiate to aldynoglia‐like cells when plated onto an adhesive substrate, and cultured in the presence of olfactory ensheathing cell conditioned medium, supplemented with EGF and bFGF. The immunophenotype, mRNA expression (microarray and RT‐PCR analysis), neurite growth‐promoting and ensheathing properties of the cells derived from neurospheres were similar to those of aldynoglia. Neurosphere‐derived, aldynoglia‐like cells expressed, with respect to neurospheres, very increased levels of GFAP, high levels of nestin and vimentin, extracellular matrix proteins, and inhibitors of the catabolism of those extracellular matrix proteins. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

不同来源嗅鞘细胞移植治疗脑出血的比较

背景：嗅鞘细胞是目前已知用于移植细胞中惟一可以跨越周围神经系统与中枢神经系统边界的细胞。在众多的国内外文献中,大多以嗅球来源嗅鞘细胞作为观察对象;但采用嗅黏膜嗅鞘细胞移植具有来源方便、损伤小、可自体取材等优势。 目的：比较嗅球来源嗅鞘细胞和嗅黏膜嗅鞘细胞移植对脑出血后神经功能损伤恢复作用的差异。 设计、时间及地点：免疫组织化学水平的随机对照动物实验,于2005-10/2007-10在无锡市第三人民医院细胞实验室完成。 材料：选用健康雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为3组,对照组、嗅球来源嗅鞘细胞移植组及嗅黏膜嗅鞘细胞移植组各10只。 方法：分别获取人鼻中隔黏膜、人胚嗅球,进行嗅鞘细胞的分离培养纯化,取培养10 d的细胞用作细胞移植。取SD大鼠制备尾状核出血模型,嗅球来源嗅鞘细胞移植组及嗅黏膜嗅鞘细胞移植组各取10μL细胞悬液在立体定向下引导微量注射器向大鼠脑组织内匀速注射(1 μL/min),对照组注入等量培养基,注射点为右侧尾状核。 主要观察指标：观察两种来源嗅鞘细胞的体外培养情况。嗅鞘细胞移植后对动物行定期行为学评定,功能损伤越重,得分越高;并观察组织切片靶区域免疫细胞化学分析结果。 结果：从体外培养结果看,无论在形态上还是表型上,两者无明显区别。嗅球来源嗅鞘细胞移植组及嗅黏膜嗅鞘细胞移植组大鼠的Longa 5分制法及前肢放置试验评分在移植后第14,28,56天显著低于对照组（P < 0.05）,两移植组差异无显著性意义（P > 0.05）,移植组各时间段差异无显著性意义（P > 0.05）。 结论：用于移植修复神经功能的两种嗅鞘细胞在细胞特性、移植效果方面均无明显差异。     

改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法体外分离培养大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞*☆

背景：目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低。 目的：拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成。 材料：10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备。 方法：完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109 L-1密度接种于未包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18~20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm 2玻璃培养瓶中（第1次差速贴壁）,24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中（第2次差速贴壁）,接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞。在差速贴壁培养后二三天,加入3.0~5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞。 主要观察指标：嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定。 结果：体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞。纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上。 结论：改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞。     

Neuroprotective effects of ultrasound-guided nerve growth factor injections after sciatic nerve injury

Nerve growth factor (NGF) plays an important role in promoting neuroregeneration after peripheral nerve injury. However, its effects are limited by its short half-life; it is therefore important to identify an effective mode of administration. High-frequency ultrasound (HFU) is increasingly used in the clinic for high-resolution visualization of tissues, and has been proposed as a method for identifying and evaluating peripheral nerve damage after injury. In addition, HFU is widely used for guiding needle placement when administering drugs to a specific site. We hypothesized that HFU guiding would optimize the neuroprotective effects of NGF on sciatic nerve injury in the rabbit. We performed behavioral, ultrasound, electrophysiological, histological, and immunohistochemical evaluation of HFU-guided NGF injections administered immediately after injury, or 14 days later, and compared this mode of administration with intramuscular NGF injections. Across all assessments, HFU-guided NGF injections gave consistently better outcomes than intramuscular NGF injections administered immediately or 14 days after injury, with immediate treatment also yielding better structural and functional results than when the treatment was delayed by 14 days. Our findings indicate that NGF should be administered as early as possible after peripheral nerve injury, and highlight the striking neuroprotective effects of HFU-guided NGF injections on peripheral nerve injury compared with intramuscular administration.     

牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin影响嗅鞘细胞增殖的量效关系

背景：生长因子参与调节嗅鞘细胞增殖、分化及代谢功能,因此有望通过应用其合理的序贯刺激形式,达到细胞数量地大量扩增。 目的：观察牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin对嗅鞘细胞增殖的影响及剂量-效应关系。 方法：采用原代培养技术,从新生大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,并用差速贴壁+化学药物+胰酶快速消化法纯化培养嗅鞘细胞,添加牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin 3种促增殖因子及其组合。MTT法检测各组嗅鞘细胞生长的情况。根据NGFRp75抗体的免疫细胞化学染色统计嗅鞘细胞的纯度和计算嗅鞘细胞的增殖率。 结果与结论：在嗅鞘细胞原代培养和纯化后,添加牛垂体提取物具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,但未见典型的剂量-效应关系;添加碱性成纤维细胞生长因子具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,且呈现典型的剂量-效应关系;添加Forskolin并不具有促进嗅鞘细胞增殖的效应。说明合理应用不同质量浓度的碱性成纤维细胞生长因子与Forskolin进行联合刺激,能有效促进细胞的增殖。结果表明序贯的使用合适浓度的生长因子组合,将是有效促进嗅鞘细胞增殖的合理策略,有助于解决脊髓损伤治疗中种子细胞来源不足这一问题。     

Effects of nerve growth factor and heart cell conditioned medium on neurite regeneration of aged sympathetic neurons in culture

The effects of nerve growth factor (NGF) and heart-cell-conditioned medium (HCM) on the neurite regeneration of aged sympathetic neurons were investigated in culture. Investigation of HCM was carried out by two different methods: one was the use of whole HCM on collagen substratum, which reflected component(s) effective in solution (HCM-S); the other was the use of polyornithine (PORN)-binding component(s) (P-HCM). Superior cervical ganglion neurons prepared from male mice from 6 to 30 months of age were cultured in MEM-10% FCS on collagen or gelatin-PORN substratum for 3 days. The number of neurons with neurites and the length of neurites were quantified as neurite production and elongation, respectively. Neuronal survival was not affected by addition of NGF, HCM-S or P-HCM. Neurite production of early adult neurons was enhanced by NGF, HCM-S or P-HCM. In contrast, neurite production of aged neurons was enhanced by only HCM-S, but not NGF or P-HCM. HCM-S did not promote neurite elongation in neurons at any age. Neurite elongation of early adult neurons was enhanced by NGF or P-HCM. Neurite elongation of aged neurons was enhanced by P-HCM. However, responsiveness of NGF for neurite elongation varied according to substrata. No age-related difference was found in neurite production and elongation in the absence of NGF, HCM-S or P-HCM. These results indicate that responsiveness of aged sympathetic neurons is various in different growth factors.