ELISA竞争法测定人尿金属硫蛋白的初步应用

探讨应用ELISA竞争法测定正常人尿金属硫蛋白含量的价值。 [方法 ]应用ELISA法测定了2 0～ 2 3岁健康在校大学生 93份 (男 49,女 44 )晨尿样品的MT。 [结果 ]本法的检测下限为 2 5ng/ml,操作内和操作间的变异系数分别为 2 2 5 %和 1 19% ,回收率为 97 6 %～ 10 0 0 % ;人尿MT含量为 (6 86± 6 0 2 )ng/ μmol肌酐。 [结论 ]本法具有较好的精密度和准确度 ;大学生尿MT含量无性别差异。     

太原市孕期妇女体内多环芳烃负荷水平及影响因素研究

目的了解太原市孕期妇女体内多环芳烃暴露水平,探讨多环芳烃暴露的影响因素。方法2006年10月至2008年1月,抽取太原市某两所医院住院分娩孕妇347人,收集产前尿样,利用高效液相色谱-荧光检测法测定尿样1-羟基芘（1-OHPy）水平,并针对生活环境情况进行问卷调查。结果共240名孕妇的尿样符合检测条件,尿样1-OHPy检出率为93．8％,检出浓度中位数为0．794μmol／molCr（P25：0．519μmol／molCr,P25：1．369μmol／molCr）。厨房卧室未分开、做饭时未使用抽油烟机、中学及以下教育程度的孕妇,其尿样1-OHPy含量较高（P〈0．05）。多元线性回归分析显示,孕妇每周烹调时间、被动吸烟和取暖方式是影响孕妇尿样1-OHPy水平的主要因素。结论太原市孕期妇女多环芳烃暴露水平偏高,室内空气污染和行为生活方式在孕期妇女多环芳烃暴露中起着重要的作用。     

镉、锌与金属硫蛋白抗体对金属硫蛋白的竞争结合

[目的]通过镉、锌与金属硫蛋白抗体（MT-Ab）对金属硫蛋白（MT）的竞争结合,探讨MT-Ab在镉致肾损伤过程中的作用机制。[方法]根据不同的实验处理分组,每组包含0、5、10、20、40mg／mL 5个不同实验浓度亚组。采用竞争ELISA法,按波长490nm处的光密度值判断竞争结合的程度。[结果]实验所用包被MT质量浓度为1μg／mL,MT-Ab浓度为32U。随着实验镉、锌离子浓度增加,光密度值下降。[结论]镉、锌与MT-Ab对MT的结合存在着竞争作用,MT-Ab可使CdMT解离产生游离镉离子,从而导致肾损伤效应。     

检测大鼠尿金属硫蛋白竞争ELISA法的建立和初步应用

目的建立竞争酶联免疫吸附法(ELISA)用以检测大鼠尿金属硫蛋白(UMT)的含量。方法用标准MT抗原包被酶标板,加入待测样品或标准MT与包被MT竞争鼠抗MT抗体(一抗)。再加入生物素化抗大鼠IgG(二抗)与一抗进行反应,然后在二抗联与亲和素化辣根过氧化物酶使底物显色,根据吸光度值计算样品浓度。结果该方法在150~2.34μg/ml间线性关系良好(r=0.9899);批内精密度为3.38%~6.43%,批间精密度为5.32%~9.38%;加标回收率为90.13%~96.40%;雄性和雌性大鼠UMT含量分别为17.74μg/mgCr和15.97μg/mgCr。结论该方法简便,灵敏,具有较好的精密度和准确度,可用于大鼠UMT的检测。正常大鼠尿中含有MT,但雄性和雌性大鼠之间UMT无明显差异。     

人胎肝、正常成人肝、肝癌及鼠肝金属硫蛋白的研究比较

分别从人胎肝、正常成人肝、肝癌及鼠肝分离得到金属硫蛋白两个亚型（MT－1，MT－2），研究发现鼠肝MT含量最高1．1～1.45mg／克肝重，其次人胎肝1．0～1．3mg／克肝重，正常成人肝MT为1．13mg／克肝重，而肝癌含量最低56μg／克肝重。氨基酸成份分析表明，四种不同来源MT分子中半胱氨酸约占1／3，未发现有芳香族氨基酸。人胎肝MT的抗血清与其他三科来源MT均有交叉反应。并对金属结合能力进行测定。     

建筑工人在高温高空环境下作业机体内分泌代谢的变化

目的观察高温高空作业对建筑工人机体生理代谢的影响,以提高劳动者高温高空作业能力,预防事故发生。检测暴露在30℃以上作业人员血清中激素含量的代谢变化。方法以文职工作人员为对照组（30人）,高温、高空作业人员为高温高空组（37人）;体温检测采用口温表法,出汗量采用体重差法,促甲状腺素（TSH）、甲状腺素（T4）和三碘甲腺原氨酸（33）与肾素（PRA）、血管紧张素Ⅱ（ATⅡ）和醛固酮（ALD）含量测定采用放射免疫法;采用SPSS10．0软件进行统计分析,组间差异用t检验。结果30～35℃下作业,高温高空组体温[（37．04±0．65）℃],明显高于对照组[（36．02±0．21）℃];高温高空组4h出汗量[（389．80±126．13）g／h],明显高于对照组[（97．46±43．02）g／h],高温高空组TSH含量[（4．91±0．36）tzU／m1]、T4含量[（89．60±3．64）ng／m1]和B含量[（1．14±0．06）ng／m1]也均明显高于对照组的TSH含量[（2．90±0．15）μU／ml]、T4含量[（6．71±2．93）ng／ml]和T3含量[（1．07±0．03）ng／m1];高温高空组PRA含量[（12．38±0．38）ng／ml·h]、ATⅡ含量[（687．00士36．37）ng／m1]和ALD含量[（1615．50±50．70）pg／m1]也明显高于对照组的PRA含量[（2．89±0．04）ng／ml·h]、ATⅡ含量[（78．07±5．92）ng／m1]和ALD含量[（131．40±13．00）pg／ml],2组相比,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论高温高空作业对机体的生理和神经内分泌功能产生了应激响应变化,应及时调整作业时问,补充营养,避免由于机体生理不适而引发安全性事故。     

糖尿病足部溃疡患者白介素-1β对成纤维细胞增殖及基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的影响

目的检测糖尿病足部溃疡创面白介素-1β（IL-1β）的含量，探讨IL-1β对溃疡局部成纤维细胞（Fb）增殖功能及其基质金属蛋白酶-2（MMP-2），基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活性和其蛋白表达的影响。方法取糖尿病足溃疡边缘成纤维细胞培养、传代至4-6代，在24、48、72h时间段分别加培养液及不同浓度IL—1β，观察成纤维细胞生长。并用酶谱法检测IL-1β对真皮成纤维细胞MMP-2、MMP-9活性的影响，用蛋白印迹（Westernblott）检测其MMP-2、MMP-9蛋白表达量。结果糖尿病急性创面组IL-1β含量[（8．84±7．06）ng／m1]低于糖尿病足部难治溃疡组[（89．16±38．14）ng／m1]，差别有统计学意义（P〈0．001）；IL-1β0．5～5ng／ml对Fb增殖有明显促进作用，随着IL-1p浓度增加，对F1）的促增殖作用减弱，IL-1β50ng／ml对Fb增殖无影响；IL-1β500ng／ml对Fb增殖有明显抑制效应（P〈0．01）；IL-1β50ng／ml不仅能显著增加基质金属蛋白酶（MMP-2，MMP-9）的活性，而且也使MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著增加。结论糖尿病足难治溃疡组IL-1β显著增高，进而抑制了成纤维细胞的增殖，同时通过增加MMP-2、MMP-9活性及其蛋白表达，使细胞外基质等分解增加。     

热性惊厥患儿血清褪黑素水平和细胞免疫功能的变化及其临床意义

目的探讨热性惊厥（FS）患儿血清褪黑素（MT）水平和细胞免疫功能的变化及其临床意义。方法实验组：FS患儿50例,其中复杂性热性惊厥（CFS组）23例,单纯性热性惊厥（SFS组）27例;对照组：上呼吸道感染发热惠儿25例。采用酶联免疫吸附法（ELISA）和流式细胞仪分别测定实验组和对照组血清MT水平和细胞免疫功能。结果CFS组血清MT水平[（14．91±2．61）ng／L]明显低于SFS组[（20．72±2．54）ng／L]和对照组[（23．93±2．01）ng／L]（P〈0．01）。细胞免疫功能：CFS组CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋／CD8＋比值分别为（54．53±3．67）％、（21．95±1．78）％、（33．37±2．84）％、0．664±0．02;SFS组分别为（59．06±3．89）％、（24．80±3．12）％、（26．784-g．79）％、0．94±0．06;对照组分别为（62．11±6．90）％、（27．36±3．94）％、（24．49±2．75）％、1．23±0．15。FS患儿CD3＋、CD4＋、CD4＋／CD8＋比值均降低,CD8＋增加,CFS组与对照组及SFS组间差异均有统计学意义（P〈0．01）;SFS组与对照组比较CD4＋／CD8＋比值降低（P〈0．05）,但CD3＋、CD4＋降低和CD8＋增加差异无统计学意义（P〉0．05）。FS患儿CD3＋、CD4＋、CD4＋／CD8＋比值的降低与MT水平的降低均呈正相关（r≥0．472,P〈0．05）。结论FS患儿细胞免疫功能的异常可能与MT减少有关,MT水平降低可能是患儿反复出现·凉厥导致脑损伤的主要原因之一。     

锌或铜诱导肝脏金属硫蛋白结合锌镉比值与铜镉比值的研究

[目的]观察镉（Cd）染毒后锌（Zn）或铜（Cu）诱导肝脏金属硫蛋白（MT）结合锌镉比值（Zn／Cd）与铜镉比值（Cu／Cd）的关系及其意义。[方法]将28只雄性Wistar大鼠随机分为7组,每组4只,分别为：空白对照组（0）,不做任何处理;非预处理组（A1、A2）,皮下注射生理盐水;Zn处理组（B1、B2）,皮下注射ZnCl2（每千克体重染Zn 25mg）;Cu处理组（C1、C2）,皮下注射CuSO4（每千克体重染Cu 12.5mg）。预处理24h后,为实验组动物皮下注射镉．金属硫蛋白（CdMT,Cdmetallothionein）,造成Cd急性中毒,其中A1、B1、C1组每千克体重染Cd0．1mg,A2、B2、C2组每千克体重染Cd0．4mg。24h后处死,取肝脏,制备匀浆。离心后取上清液,加入SephadexG-75色谱层析柱。[结果]空白对照组动物肝脏中与MT结合的最主要金属元素是Zn,而Cd、Cu含量在检测限以下;与前者相比,A1、A2组动物肝脏MT和Cd含量随染毒剂量增加而升高,且A1、A2组肝脏MT中Zn／Cd值分别为20．0和10．0;B1、B2组肝脏MT中Zn／Cd值分别为20．8和20．3,Cu离子未检出;C1、C2组肝脏MT的Cu／Cd值分别为80．0和36．5,Zn含量下降明显。[结论]不同剂量Cd染毒后,Zn或Cu诱导动物肝脏MT中金属含量比例存在差异,Cu／Cd值高于Zn／Cd值,即与MT结合的Cd相比,Cu更易取代与MT结合的Zn。另外,肝脏中非MT结合Zn也是影响与MT结合的金属离子稳态的重要因素。     

气相色谱质谱联用快速确证氯美扎酮中毒

[目的]研究建立气相色谱-质谱联用（GC／MS）检测确证氯美扎酮中毒的分析方法。[方法]采用多阶程序升温的色谱分离方法。分别对血样、尿样、呕吐物、洗胃液等中毒样品中氯美扎酮的提取、富集、净化、分离、检测等进行了实验研究。并采用建立的GC／MS方法进行中毒样品实际测定和加标样品回收率测定。[结果]标准系列在0．1000ng范围内线性良好，在100μg/kg加标水平样品回收率范围70．3％～90．2％之间，同一样品平行测定7次相对标准偏差7．6％，选择离子检测方式最低检测量（S／N=10）为42．50ng。[结论]该方法定性、定量准确，能适应于氢美扎酮快速中毒检测的要求。     

毒死蜱单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

[目的]制备毒死蜱单克隆抗体,为建立毒死蜱残留检测方法奠定基础。[方法]以毒死蜱原药与3-巯基丙酸为起始原料,合成半抗原并对其进行结构鉴定。利用该半抗原与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原,再取已免疫的经过筛选的Balb／c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对2株细胞进行鉴定,并测定与其他农药的交叉反应率。[结果]获得两株稳定分泌毒死蜱单克隆抗体的细胞株,其检测范围为0．04～0．42mg／L,半数抑制浓度为0．135mg／L,最低检测限为0．03mg／L,与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷几乎没有交叉反应。[结论]成功制备两株分泌毒死蜱抗体的单克隆细胞株,初步建立了毒死蜱间接ELISA检测方法。     

用麻疹活疫苗制备抗麻疹病毒单克隆抗体及其应用

[目的]制备抗麻疹病毒(MV)的单克隆抗体(单抗,McAb),并用该单抗研制捕获法ELISA检测MV-IgM的诊断试剂盒。[方法]以MV减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠,其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗MV的杂交瘤细胞株,以获得该单抗,并对用其研制的检测抗MV-IgM试剂盒进行考核。[结果]获得的杂交瘤细胞株中,B2能稳定分泌高滴度抗MV单抗。经考核,用该单抗酶结合物研制的检测抗麻疹-IgM试剂盒特异性和稳定性良好,与同类商品试剂盒比较,其检出麻疹病例血清抗MV-IgM的时间较早。[结论]应用麻疹减毒活疫苗成功地制备了小鼠杂交瘤细胞,其中B2株能稳定分泌高效的抗MV单抗,用于研制检测抗MV-IgM捕获法ELISA试剂盒,其敏感性、特异性和稳定性令人满意。     

抗桔青霉素单克隆抗体的研制与鉴定

目的制备抗桔青霉素的单克隆抗体。方法采用活性酯法、甲醛加成法和羰基二咪唑法制备了4种桔青霉素与载体蛋白的偶联物(A、B、C和D),免疫小鼠制备抗桔青霉素单克隆抗体。结果免疫原性鉴定证明偶联物C可刺激BALB/c小鼠产生抗桔青霉素的抗体,细胞融合后筛选到一株抗桔青霉素的单克隆抗体,单抗与赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1和展青霉素等毒素交叉反应低于0.01%,在此基础上建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为20~10,00ng/ml,检测下限为10ng/ml。在小麦样品中的加标回收率为95%~112%,变异系数为9.1%~18.6%。结论本研究成功筛选到抗桔青霉素单克隆抗体。     

抗体制备ELISA试剂诊断肾综合征出血热

目的研究汉坦病毒重组抗原及其单克隆抗体制备双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）试剂早期诊断肾综合征出血热（HFRS）.方法将汉坦病毒76118株S1.3kb基因克隆于pET28a质粒,诱导大肠埃希菌表达出48kd的汉坦病毒核蛋白抗原.以此抗原免疫Balb/c小白鼠,取其B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,小鼠腹腔接种,制备单克隆抗体.用重组抗原及其单克隆抗体,制备ELISA诊断试剂,并与美国产汉坦病毒重组抗原ELISA诊断试剂和间接免疫荧光法（IFA）比较.结果自产重组抗原及其单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA试剂与美国产抗原ELISA试剂在87例HFRS和56例非HFRS诊断中完全吻合.结论自产ELISA试剂可用于早期诊断HFRS,且意义重大.     

环境镉接触人群尿金属硫蛋白排泄与镉致骨损伤效应

目的研究环境镉接触人群尿金属硫蛋白(UMT)的排泄与镉致骨损伤效应的关系。方法镉污染区居民为环境镉接触人群,非污染区居民为对照人群。人群尿镉(UCd)与血镉(BCd)用原子吸收分光光度法测定,用环境接触量估测总镉摄入量(TCd)。UMT、尿β2微球蛋白(UB2M)、尿视黄醇结合蛋白(URBP)及尿白蛋白(UALB)用ELISA法测定,尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(UNAG)和UNAG同工酶B(UNAGB)用荧光分析法测定,均用尿肌酐校正。单光子骨密度仪测定人群前臂骨密度。结果UMT能反映机体接触镉时镉负荷的变化。而高剂量接触镉可先后导致肾功能障碍及骨质疏松。人群UMT排泄量与骨密度的关系同UMT排泄量本身是否异常有关。根据各指标与尿镉的剂量-反应曲线计算得到的基准剂量95%低限水平BMDL值,从小到大排列为UNAGB、UNAG、UB2M、UMT、URBP、T评分及UALB。结论镉致骨质疏松的发生与镉致肾功能障碍有关并迟于后者。UMT不仅能特异而敏感的反映镉致肾的毒性,而且能在一定程度上反映镉对骨骼的损伤。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇七肽模拟表位淘选及应用

目的从噬菌体随机七肽库中淘选脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的模似表位，并以之替代人工抗原建立ELISA检测方法。方法利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体12D1，从噬菌体随机七肽库中淘选到脱氧雪腐镰刀菌烯醇七肽模似表位，七肽模拟表位氨基酸序列为CMRPWLQ。以含有DON七肽模拟表位的噬菌体替代DON人工抗原建立DON间接竞争ELISA检测方法，检测范围为20-400ng／ml，并应用于小麦、玉米样品中DON含量的检测。结果检删结果与德国r—Biopharm公司DON检测试剂盒差异无统计学意义。结论DON噬菌体模拟表位替代DON人工抗原建立的ELISA检测方法可应用于小麦和玉米样品中DON的检测。     

大肠杆菌O157多克隆抗体及食品中双抗ELISA测定方法的研究

本研究获得了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7的多克隆抗体 ,建立了一种适宜食品样品检测的双抗ELISA检测方法。该方法对纯培养菌液检出限为 10 3 ～ 10 4 cfu ml;只对O157菌株有特异性反应 ,对非O157菌株无交叉反应 ;经过增菌 ,鸡肉与牛奶染菌样品中的大肠杆菌O157的检出限均为 0 1cfu g(cfu ml)。     

抗结核分枝杆菌特异抗原单克隆抗体的制备和特异荧光染色检测技术的研究

目的对结核分枝杆菌的蛋白抗原进行初步分析，制备抗结核分枝杆菌的特异单克隆抗体，探讨特异性免疫荧光法在痰标本结核分枝杆菌检查上应用的可行性。方法采用丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹技术对结核分枝杆菌的蛋白抗原进行初步分析，确定特异、免疫原性强的蛋白抗原，制备抗特异蛋白抗原的高效价单克隆抗体，采用饱和硫酸铵粗提，Sephadex G-50层析纯化；同时制备高效价的抗结核分枝杆菌免疫血清。用异硫氰酸荧光素（FITC）标记，初步应用于临床痰涂片的检测。结果获得4株针对结核分枝杆菌38×10^3蛋白抗原的单克隆抗体，ELISA检测小鼠腹水单克隆抗体效价达到1：6400～1：12800。建立了直接荧光抗体染色方法，60份临床疑似肺结核病人痰标本，用抗酸染色法、结核分枝杆菌免疫血清和单克隆抗体免疫荧光法三种方法检测，阳性率分别为：36．7％（22／60）、58．3％（35／60）和56．7％（34／60），其中，抗酸染色阳性22份标本，两种免疫荧光法检查均为阳性，符合率100％。结论成功制备出抗结核分枝杆菌38×10^3蛋白的单克隆抗体。免疫荧光法检查痰标本结核分枝杆菌阳性率大大高于抗酸染色，具有良好的应用前景。     

甲型肝炎病毒H2株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 为甲型肝炎病毒(HAV)的诊断和相关研究提供高效价的抗体来源. 方法 用细胞培养获得的H_2株HAV免疫BALB/C小鼠,经细胞融合技术,ELISA筛选和有限稀释克隆化培养. 结果 获得3株能稳定分泌抗HAV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为6-A8、6-F2和1-H3.经鉴定,其上清和腹水的抗体效价分别为1∶(2048～16 824)和1∶(65 536～524 288).6-A8和6-F2属IgG2a亚型,1-H3属IgG1亚型.染色体数分布在92～98之间.3株细胞株McAb分别能与HAV不同抗原位点结合. 结论 3株能稳定分泌抗HAV McAb的杂交瘤细胞株成功建立,并获得高效价的抗HAV McAb.