杏仁核点燃癫痫鼠GAD67mRNA的表达

目的 探讨大鼠杏仁核点燃癫痫后脑组织谷氨酸脱羧酶（GAD）mRNA的表达及其在癫痫发作后表达变化的意义。方法 通过建立与人类癫痫发生,形成具有高度相似性的杏仁核点燃大鼠癫痫模型。采用原位杂交技术检测癫痫鼠颞叶及海马组织不同点燃时程GAD67mRNA表达。结果 点燃后1d,GAD67mRNA表达增多并且表达信号增强,至7d时达高峰,以后表达逐渐下降,但在点燃后49d,表达仍高于正常,与对照组及手术对照组相比有统计学差异。结论 在慢性癫痫发作中,GABA能神经元的活性增强,考虑是由于癫痫过程中兴奋性增强,引起GABA能神经元抑制功能代偿性增加的结果,即癫痫发作后GABA能神经元介入的抑制功能代偿性增加的,这可能是机体内源性抗癫痫机制增强的一种反应。     

癫痫状态大鼠海马HSP70mRNA及GAD67mRNA表达水平的研究

目的 研究癫痫演变过程中特定脑区选择性神经元损伤与修复机制。方法 采用分子杂交方法动态观察了马桑内酯（coriaria Lactone,CL)诱导的癫痫状态大鼠海马区早期神经元损伤标志物热休克蛋白（heat shock protein,HSP)70mRNA及谷氨酸脱羧酶（glutamin acid decarboxylase,GAD)67mRNA表达水平的变化,同时也观察了大鼠行为学及脑电图改变。结果 侧脑室注射CL后20分钟,大鼠出现连续发作的四肢抽搐伴有EEG持续性的棘慢波及尖波发放。注射CL后2小时组大鼠海马GAD67 mRNA表达水平有所降低,但HSP70mRNA变化不明显,注射CL后8小时组大鼠海马GAD67mRNA表达水平有所降低,但HSP70mRNA表达变化不明显,注射CL后8小时组大鼠海马GAD67mRNA表达水平明显低于对照组（P＜0．01）,HSP70mRNA表达水平较对照组明显增高（P＜0．01）。结论 癫痫状态期间大鼠海马区可能存在神经元损伤与修复过程,而且GABA能神经元受到不同程度的损伤。     

全脑缺血-再灌注对海马CA1区GAD65表达的影响及意义

目的探讨全脑缺血-再灌注对成年大鼠海马CA1区GAD65表达的影响及意义。方法成年雄性SD大鼠24只,随机分为3组:假手术组(SH)、缺血-再灌注3d组(IR-3)及缺血-再灌注7d组(IR-7),每组8只。采用四动脉阻断法制作全脑缺血-再灌注模型,应用免疫组织化学方法检测海马CA1区谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)同工酶GAD65的表达变化。结果与假手术组相比,IR-3组GAD65的表达明显增多,IR-7组恢复正常。结论GABA能中间神经元对缺血相对耐受;全脑缺血-再灌注3dGAD65的表达增多可能是一种代偿性的机制,以减轻脑缺血后的高兴奋性。     

人类GAD67基因扩增及pEGFP-C2-GAD67真核表达载体的构建

目的扩增人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因，并构建pEGFP-C2-GAD67真核表达载体。方法应用基因重组技术，采用反转录PCR方法对来自人类脑组织cDNA中编码GAD67的基因片段进行扩增，插入PUC57克隆载体，经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切出GAD67基因片段，再克隆入真核表达载体pEGFP-C2后构建pEGFP-C2-GAD67重组载体，经PCR扩增、酶切后测序鉴定。结果人类GAD67基因扩增产物大小为1785bp，编码594个氨基酸残基。重组真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，PCR正确扩增出目的条带。与GenBank中人类GAD67基因序列比较，核苷酸和氨基酸水平的同源性分别达99．78％和99．66％。结论人类GAD67基因克隆后，可成功构建真核表达载体pEGFP-C2-GAD67为进一步该基因转染神经干细胞移植治疗癫痫提供了实验基础。     

皮层扩散性抑制对大鼠脑缺血后谷氨酸载体EAAC1 mRNA表达的影响

方法：用氯化钾诱发ＳＤ大鼠皮层扩散性抑制（ＣＳＤ）,改良 Ｌｏｎｇａ法制作大鼠 ＭＣＡＯ模型,用地高辛标记的 ｃＲＮＡ探针,行原位杂交检测谷氨酸载体ＥＡＡＣ１ ｍＲＮＡ表达。结果：假手术组脑片上单位面积ＯＤ为（２ １８９±２６３）,阳性颗粒数为（４３．２±４．７）个。缺血 ３０ｍｉｎ时皮层ＥＡＡＣ１ ,ｍＲＮＡ表达明显上调,经ＣＳＤ处理后再缺血时,与对照组比较表达水平均明显增高,其中Ｌｉ ３０ｍｉｎ时最高。结论：ＣＳＤ的作用可能与诱导ＥＡＡＣ１合成,增加谷氨酸的摄取有关。     

葛根素对脑缺血再灌注大鼠脑组织eNOS蛋白表达的影响

目的观察葛根素对脑缺血再灌注大鼠的脑保护作用及脑组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响。方法采用神经功能缺损评分评价脑缺血再灌注模型大鼠神经功能变化,取脑测定脑含水量、脑梗死面积和脑组织eNOS蛋白的表达。结果治疗组神经功能缺损较对照组明显减轻,其脑含水量和脑梗死面积减少,脑组织eNOS蛋白表达也减少,但较假手术组高。结论葛根素可通过减少脑缺血再灌注亚急性期脑组织eNOS蛋白的表达而发挥脑保护作用。     

Antisense GAD67ODN对戊四氮所致慢性癫痫大鼠的作用

目的 :探讨谷氨酸脱羧酶 (GAD)的抗癫疒间作用。方法 :采用戊四氮制备大鼠慢性癫疒间 模型 ,利用反义寡脱氧核苷酸技术 ,通过选择性地抑制海马GAD基因的表达来观察其对慢性癫疒间大鼠行为、发作阈值及脑电图的影响。结果 :给予AntisenseGAD67ODN处理后 ,GADmRNA表达下降、GABA浓度下降、疒间 性发作潜伏期缩短、发作程度加重及脑电图疒间 波频率增加。结论 :从反面进一步说明GAD基因可能是抗疒间基因 ,为GAD基因治疗癫疒间提供实验依据     

阿托伐他汀钙对实验性脑缺血MMP-9表达变化的影响

目的探讨阿托伐他汀钙对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中MMP-9mRNA及蛋白表达的影响。方法采用大脑中动脉线栓法制备脑缺血再灌注模型,参考Longa5分制法在动物麻醉清醒后进行评分,应用原位杂交和免疫组化法检测MMP-9mRNA及蛋白表达。结果大鼠脑缺血再灌注后缺血脑组织中MMP-9mRNA和蛋白表达增加(P<0.01),24h达高峰;阿托伐他汀钙干预治疗后能减少缺血脑组织中MMP-9mRNA和蛋白表达(P<0.05);降低神经功能缺损评分(P<0.05)。结论阿托伐他汀钙能抑制大鼠脑缺血再灌注后脑组织中MMP-9mRNA及蛋白表达,减轻缺血再灌损伤。     

人类GAD67基因转染骨髓基质源性神经干细胞及初步检测

目的利用转基因技术将人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因转染骨髓基质源性神经干细胞仍MSCs-D-NSCs），获得GAD67修饰的成体专能干细胞。方法以PCR、双酶切及测序鉴定pEGFP-C2-GAD67和pcDNA3.1-GAD67重组子；利用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs并促其向NSCs方向分化，将编码人类GAD67基因的真核表达质粒pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3．1-GAD67分别转染BMSCs-D-NSCs，荧光显微镜下观察并用流式细胞仪检测转染效率。结果pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD6，均可扩增出约1800bp目的条带，经双酶切和基因测序证实。荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光细胞，两种载体转染效率分别为39.3％和40.5％。结论pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67真核表达载体重组正确，利用脂质体介导人类GAD6，基因能有效转染BMSCs-D-NSCs，为进一步观察其GAD67基因和蛋白的表达提供了前提条件。     

葛根素对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的研究葛根素对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制.方法采用4血管闭塞法建立SD大鼠全脑缺血再灌注模型,并给予葛根素干预,于缺血再灌注后6、24、72 h、5、7 d进行HE染色及免疫组织化学染色,分别检测大鼠脑组织海马CA1区神经元数目、形态变化和bc1-2表达.结果 (1)脑缺血再灌注后6、24 h海马CA1区神经元未见明显死亡,再灌注后72 h、5、7 d葛根素组神经元存活数目显著高于无药物干预的再灌注组;(2)葛根素组与再灌注组比较各时间点bc1-2表达均明显增多;(3)葛根素组与再灌注组神经元存活数目与bc1-2阳性细胞数均呈显著正相关.结论葛根素对脑缺血再灌注损伤有保护作用,可延缓迟发性神经元死亡的发生,其机制可能与葛根素上调抗调亡基因bc1-2表达有关.     

GAD67/GAD65在颞叶癫痫大鼠海马内源性促痫机制中的作用

目的探讨GAD67/GAD65在颞叶癫痫发生后大鼠海马内源性促痫机制中的作用.方法112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水.选取腹腔注射后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、7 d、30 d为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位.腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行EEG描记.免疫组织化学法检测GAD65、GAD67蛋白的表达.结果海人酸致痫后6 h,实验组大鼠海马CA1区、CA3区GAD67/GAD65的比率较对照组升高(P＜0.01);海人酸致痫后30 d,实验组大鼠海马齿状回GAD67/GAD65的比率较对照组降低(P＜0.05).结论颞叶癫痫急性期CA1区、CA3区GAD67/GAD65比率的增高及慢性期齿状回GAD67/GAD65比率的降低与颞叶癫痫发生及癫痫发生后机体的内源性抗痫机制密切相关.     

葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注线粒体功能的影响

目的观察葛根素对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后线粒体功能的影响。方法健康成年雄性SD大鼠40只,随机分成5组(n=8):假手术组、脑缺血-再灌注组、葛根素预处理24h 100mg组、葛根素预处理24h 200mg组和葛根素预处理24h 400mg组,其中葛根素预处理24h组于脑缺血前24h给予相应剂量葛根素腹腔注射行单次预处理,采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血-再灌注模型,缺血90min,再灌注24h后,测定缺血侧海马线粒体内游离MDA、SOD、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性。结果与脑缺血-再灌注组相比,葛根素预处理-24 h100mg组、葛根素预处理-24h 200mg组及葛根素预处理-24h 400mg组大鼠脑线粒体内MDA含量明显下降,SOD、Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性明显升高(P<0.05),而在葛根素预处理3个剂量组间比较差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论葛根素预处理对脑缺血-再灌注后线粒体损伤具有非剂量依赖性保护作用。     

GAD67 and GAD65 mRNA and protein expression in cerebrocortical regions of elderly patients with schizophrenia

Gamma-Aminobutyric acid (GABA), the principal inhibitory neurotransmitter of CNS, has been consistently implicated in the pathophysiology of schizophrenia. GABA is synthesized from glutamate by the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD). Two isoforms of GAD have been identified and have been named GAD65 and GAD67 based on their apparent molecular weights. In this study, GAD65 and GAD67 mRNA and protein levels were measured by using real-time RT-PCR and immunoblotting, respectively, in post-mortem brain tissue from the dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) and the occipital cortex of the elderly persons with schizophrenia and matched normal controls. In addition, the mRNA expression of GAT-1, one of the principal transporters of GABA, was also studied in the same subjects. Expression of GAD65 and GAD67 mRNA in the DLPFC and in the occipital cortex was significantly elevated in patients with schizophrenia, whereas the expression of the corresponding proteins and GAT-1 mRNA was unchanged. Although the levels of GAD65 and GAD67 messages were increased in schizophrenia subjects, the proportion of the two GAD isoforms remained constant in controls and schizophrenics. In the human DLPFC, GAD65 mRNA was found to be expressed significantly less than the message for GAD67, approximately 16% of that observed for GAD67. On the contrary, the abundance of GAD65 protein in the DLPFC was about 350% of that observed for GAD67. The results suggest a substantial dysregulation of GAD mRNA expression in schizophrenia and, taken together with the results of protein expression studies, raise the possibility that both cortical and subcortical GABA function may be compromised in the disease.     

葛根素对大鼠全脑缺血再灌注后学习记忆障碍保护作用及其机制的研究

目的 探讨葛根素对大鼠全脑缺血再灌注后学习记忆能力的影响及其机制。方法 采用四血管阻断法建立SD大鼠全脑缺血再灌注损伤模型，暗回避反应法测定学习记忆能力，并应用免疫组织化学法、原位末端标记法，检测大鼠全脑缺血再灌注海马CA，区的bcl-2阳性细胞数、凋亡细胞数的动态变化。结果 (1)与再灌注组相比，葛根素组大鼠潜伏期明显延长；(2)脑缺血再灌注后，海马CA1区bcl-2蛋白的表达随再灌注时间不同而变化，缺血20min后再灌注24h达高峰，葛根素组bcl2蛋白的表达于相应的时间点明显增多；(3)脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡损伤在再灌注72h损伤最重，葛根素组可减少相应时点神经细胞凋亡数。结论 葛根素对全脑缺血再灌注后大鼠学习记忆能力具有明显的改善作用，其作用机制可能与通过上调bcl-2基因表达从而抑制或延迟脑缺血再灌注后细胞凋亡有关。     

GAD在颞叶癫痫大鼠海马内源性促痫机制中的作用

目的:探讨GAD65、GAD67在颞叶癫痫发生后海马内源性促痫机制中的作用。方法:112只雄性SD大鼠随机分为实验组(n=70)与对照组(n=42),实验组大鼠选用海人酸腹腔注射法建立颞叶癫痫模型,对照组大鼠腹腔注射无菌生理盐水。选取腹腔注射后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、7天、30天为研究的时间点,颞叶海马的CA1区、CA3区、齿状回为研究部位。腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化,大鼠处死前进行EEG描记。用原位杂交方法检测不同时间点海马不同区域GAD65、GAD67mRNA的表达,免疫组织化学法检测GAD65、GAD67蛋白的表达。结果:实验组大鼠海马GAD65 mRNA及其蛋白的表达随时间呈逐渐增高趋势,致痫后48小时～30天,GAD65 mRNA及其蛋白表达较对照组增高(48小时P<0.05;7～30天P<0.01);海人酸致痫后6小时、24小时实验组大鼠海马的GAD67mRNA及其蛋白表达较对照组增高(分别为P<0.01、P<0.05)。结论:颞叶癫痫急性期海马GAD67表达的增高及慢性期海马GAD65表达的增高是癫痫发生后机体的内源性抗痫机制。     

灵芝对大鼠缺血性脑损害的预防性保护作用研究

目的研究灵芝水溶性提取物（ＥＧＬ）对大鼠脑缺血性损害的预防性保护作用。方法在大鼠脑梗塞前后分别灌服ＥＧＬ,观察梗塞体积、病理及超微结构的改变,同时观察ＥＧＬ对小鼠缺氧及疲劳耐受能力的影响。结果预防性治疗组较梗塞后治疗组梗塞体积更小,组织病理学改变更轻;ＥＧＬ可增强小鼠对缺氧及极度疲劳的耐受能力。结论ＥＧＬ对大鼠脑缺血性损害具有预防性保护作用     

电针对脑缺血大鼠神经黏蛋白mRNA表达与细胞超微结构的影响

目的观察电针对易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke prone renovascular hypertensive rats,RHRSP)脑缺血-再灌注后不同时间点神经黏蛋白mRNA(neurocan-mRNA)表达、细胞超微结构的影响。方法用环形银夹使SD大鼠的双侧肾动脉狭窄,制成RHRSP,再用线栓法制成一侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlu-sion,MCAO)模型。运用原位杂交和电镜等技术观察电针对脑缺血2h后再灌注1、7、14、30d大鼠脑内神经黏蛋白-mRNA表达与细胞超微结构的干预作用,并与对照组比较。结果电针组脑缺血-再灌注7、14、30d大鼠脑缺血区周围及海马区neurocan-mRNA表达均低于同期对照组,差异有统计学意义(P<0.05);电针组神经元、血管壁等细胞超微结构的损伤较对照各组减轻。结论电针对RHRSP脑缺血-再灌注损伤的保护作用,可能与其下调神经抑制因子neurocan-mRNA表达、减轻细胞超微结构损害等机制有关。     

葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制

目的探讨葛根素预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。方法健康成年雄性SD大鼠120只,随机分成5组（n=24）：假手术组（S组）,脑缺血再灌注组（IR组）,Pc-24h100mg组,Pc-24h200mg组,Pc-24h400mg组,其中Pc-24h组于脑缺血前24h给予相应剂量葛根素腹腔注射行单次预处理,采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型,缺血90min,再灌注24h。大鼠清醒后进行神经功能缺陷评分,再灌注24h时处死大鼠,处死后取脑组织,测定脑梗死容积比（BIVP）、脑组织含水量及MDA水平。结果葛根素预处理可以改善大鼠脑缺血再灌注损伤的神经功能缺损评分,降低BIVP、脑组织含水量及MDA水平（P均〈20.01）。其中Pc-24h400mg组减低神经功能缺损评分、BIVP及脑组织含水量明显优于Pc=24h100mg及Pc-24h200mg组（P均〈0.01）,而Pc-24h100mg及Pc-24h200mg组之间无显著差异（P均〉0.05）。结论葛根素预处理可能通过抑制脑水肿及氧化损伤来减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。葛根素预处理的脑保护作用具有一定的量效关系。