Notch信号对视网膜前体细胞分化的作用

目的：观察Notch信号对体外培养的SD大鼠视网膜前体细胞分化的影响。方法：从胎龄16 d的SD大鼠分离视网膜神经上皮,采用悬浮法培养视网膜前体细胞。实验分Notch信号抑制组和对照组两组。第14天行免疫细胞化学法分析细胞类型、Notch信号的表达及变化。结果：视网膜前体细胞大部分表达Notch1胞内段及其下游转录因子Hes1,少量细胞表达bHLH转录因子NeuroD和Mash1;自发分化后大量细胞表达bHLH转录因子NeuroD和Mash1,少量细胞表达Notch 1胞内段和Hes1。Notch信号抑制组Nestin,GFAP阳性率显著低于对照组,β-tubulin阳性率显著高于对照组,而Recoverin阳性率与对照组差异无统计学意义。结论：Notch1信号在体外可能参与了对视网膜前体细胞分化的抑制,抑制Notch信号可部分促进视网膜前体细胞向神经元分化,同时抑制了神经胶质细胞的分化。     

地黄多糖诱导大鼠BMSCs向神经样细胞分化中对Notch信号通路的影响

目的 探讨地黄多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞过程中对Notch信号通路的影响。方法 以大鼠BMSCs为研究对象,取P3～P5代细胞随机分为正常对照组(CON组)与地黄多糖诱导组(RGP组),诱导后连续培养7d。以免疫细胞化学法和Western blotting检测诱导后0、1、3、7d各时点Notch1、Jagged1蛋白和Notch1胞内段NICD蛋白的表达,Real-time PCR检测Notch信号通路相关分子mRNA。结果 免疫荧光法检测显示,RGP组与CON组比较各时点Notch1蛋白表达阳性率差异有统计学意义(P＜0.01),且随时间变化Notch1蛋白表达阳性率逐渐降低;Jagged1蛋白阳性细胞率从诱导结束0d到诱导后1d具有明显的上升趋势,1d到7d显著下降,各时点比较差异有统计学意义(P＜0.05), CON组与RGP组各时点比较差异具有统计学意义(P＜0.05);Western blotting检测结果与免疫荧光检测结果相似。Real-time PCR检测显示,RGP组Notch1 mRNA随时间变化表达下降,Presenilin1表达先降低后略有回升,Hes1表达下降,Mash1表达升高,Jagged1表达先升高后降低,各时点与CON组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 地黄多糖在诱导BMSCs向神经样细胞分化过程中抑制Notch1蛋白的表达,并影响Notch信号通路相关基因的表达。     

人巨细胞病毒感染对人神经干细胞定向星形胶质细胞分化过程中Notch相关信号分子表达的影响

目的 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染可抑制神经干细胞(neural stem cell, NSC)的增殖和分化,Notch信号对NSC的增殖和分化具有重要的调控功能.文中研究HCMV感染对人NSC向星形胶质细胞分化过程中Notch信号相关分子Notch1~3、Jagged(JAG)1、delta-like(DLL)1及早老素(presenilin, PS)1表达的影响.方法 体外分离培养海马NSC,并诱导其向星形胶质细胞分化.同时以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为5的HCMV AD169株感染NSC,分别在感染后0、1、3、5、7d收获细胞,用实时RT-PCR法检测细胞内Notch1-3及其受体JAG1、DLL1的转录水平,Western blot法检测Notch1细胞内段(Notch 1 intracellular domain, NICD)含量的变化.结果 未分化状态的NSC含有大量Notch1 NICD,Notch1-3、JAG1、DLL1mRNA呈高表达.诱导分化1d后,Notch各受体、配体mRNA表达均显著下降,3d后表达回升,至第7天显著升高且可检出大量激活的NICD.HCMV感染组细胞在诱导分化1d后Notch相关受体、配体mRNA水平亦明显下降,与对照组相比Notch1、Notch2和DLL1的表达更少.在以后各个时间点Notch相关受体、配体mRNA水平均低于对照组.PS1的表达仅在1d时低于对照组.病毒感染7d后,细胞内NICD含量明显低于对照组. 结论 HCMV感染可抑制Notch相关受体、配体的表达与活化,Notch信号异常表达参与HCMV感染所致NSC分化和增殖异常.     

乳鼠海马神经干细胞向神经细胞分化过程中Notch1 mRNA的表达

目的建立神经干细胞(NSC)向神经细胞分化的培养体系,探讨Notch1mRNA在NSC分化过程中的表达情况。方法无菌分离新生(24h)SD大鼠海马NSC,体外扩增、纯化,并诱导NSC向神经细胞分化。细胞诱导前、后,采用免疫荧光化学法鉴定巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇酶(NSE)的表达;用逆转录-PCR检测NSC中Notch1mRNA的表达情况。结果从乳鼠海马分离的NSC在体外能克隆增殖,并表达Nestin。诱导分化后,细胞NSE阳性表达;Notch1mRNA在NSC诱导分化前、后均有表达。与诱导前相比,NSC诱导分化后各阶段Notch1mRNA表达水平均明显降低(P<0.05),而NSC分化各阶段Notch1mRNA表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论诱导NSC向神经细胞分化能抑制其Notch1mRNA的表达,低水平的Notch信号可能有利于神经细胞的分化。     

苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1,Jagged1 mRNA表达的影响

目的:研究肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1, Jagged1 mRNA表达的变化及苦参碱对其的影响.方法:雄性SD大鼠48只按体重随机分为4组:模型组(A组);苦参碱小剂量(B组);苦参碱组大剂量(C组);D组即正常对照组.用免疫组化方法观察造血干细胞标记(Thy-1)表达的变化、半定量RT-PCR方法观察肝组织中Notch1, Jagged1 mRNA表达的变化.结果:与D组比较,A组Thy-1蛋白, Notch1mRNA, Jagged1 mRNA表达显著升高(P＜0.01),与A组比较,C组Thy-1蛋白, Notch1mRNA, Jagged1 mRNA表达显著下调(P＜0.01).结论:苦参碱可有效的调节Notch信号通路、下调Thy-1蛋白表达,可能是其抑制卵圆细胞过度增殖、诱导卵圆细胞向肝细胞方向定向分化的机制之一.     

基于miR-34a-5p/Notch1信号通路探讨蒙药四味土木香散对压力超负荷心肌肥厚大鼠的保护机制

【摘要】目的 探讨四味土木香散（STP）对压力超负荷性心肌肥厚大鼠的保护作用及机制。方法 第一部分：Wistar大鼠随机分为假手术（sham）组、模型（Mod）组、Mod+STP高、中、低剂量（STP-H、STP-M、STP-L）组、Mod+阳性药卡托普利（CAP）组,检测血压、超声心动图、HE及Masson染色。第二部分：Wistar大鼠随机分为sham组、Mod组、Mod+STP-H组、Mod+STP-H+miR-34a-5p激动剂（agomir）组、Mod+STP-H+Notch1抑制剂（DAPT）组,观察HE及Masson染色,RT-qPCR检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、核因子κB（NF-κB）、miR-34a-5p表达量,Western Blot检测Notch1、NICD1、hes1蛋白表达量。结果 第一部分：STP各剂量组均对压力超负荷心肌肥厚具有改善作用,其中高剂量治疗效果最佳。与Mod组比,STP-H组在8、10周时血压降低,心功能提高,细胞短轴直径及心肌纤维化降低,差异均有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。第二部分：与Mod组比,STP-H组 TNF-α、IL-6、NF-κB、miR-34a-5p表达水平降低,Notch1、NICDI、hes1表达量升高,差异均有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。与STP-H组相比,agomir组、DAPT组细胞短轴直径及心肌纤维化增加,TNF-α、IL-6、NF-κB、miR-34a-5p表达水平升高,Notch1、NICDI、hes1表达降低,差异均有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。结论 STP可通过抑制miR-34a-5p的表达,同时靶向激活Notch1通路而改善压力超负荷性心肌肥厚,发挥心肌保护作用。     

γ-分泌酶抑制剂对神经干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t-丁酯(DAPT)与神经干细胞增殖、分化的关系.方法 分离和体外培养大鼠脑神经干细胞(NSC),采用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理后,细胞计数和CCK8检测法观察NSC增殖能力的变化;特异性荧光免疫染色检测NSC诱导定向分化能力的变化;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Notch信号途径节点分子基因RBP-Jk和Hes1的表达.结果 DAPT能够明显抑制NSC的增殖能力;与对照组相比,NSC诱导分化为神经元和少突胶质细胞的比例分别由(3.7±1.0)%和(4.8±1.2)%上升为(13.8±1.2)%和(14.8±1.6)%,而分化成星形胶质细胞的比例由(82.8±3.7)%下降为(63.4 ±1.2)%;DAPT能下调NSC的RBP-Jk和Hes1 mRNA的表达.结论 γ-分泌酶抑制剂DAPT能抑制大鼠脑NSC的增殖,改变NSC定向分化的能力,这些作用可能是通过抑制γ-分泌酶而下调Notch信号所致.     

Notch1干扰对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中细胞凋亡的影响及机制研究

目的探讨缺口受体-1（Notch1）干扰对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺组织中细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法18只SPF级雄性大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组和干扰组,每组6只。制备COPD大鼠模型。造模前1天干扰组大鼠尾静脉注射1mLNotch1干扰腺病毒（3×109pfu/mL）,对照组和模型组注射等体积0.9%氯化钠注射液。HE染色观察大鼠肺组织病理形态变化并测定半定量评分;测定肺血管壁厚度;Tunel染色检测肺组织中细胞凋亡情况;使用活性氧（ROS）检测试剂盒测定肺组织ROS水平;采用Westernblot法测定肺组织Notch1、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3蛋白表达。结果与模型组相比,干扰组大鼠肺组织半定量评分显著下降（P＜0.01）,管壁厚度占外径的百分比和管壁面积占血管总面积的百分比均显著降低（均P＜0.01）,Tunel染色阳性细胞凋亡率显著下降（P＜0.01）,肺组织中ROS水平显著降低（P＜0.01）,Notch1和Caspase-3蛋白表达灰度值均显著降低（均P＜0.01）,Bcl-2蛋白表达灰度值显著升高（P＜0.01）。结论Notch1干扰可减少COPD大鼠肺组织的细胞凋亡,下调ROS水平,下调Notch1和Caspase-3蛋白表达及上调Bcl-2蛋白表达。     

脂多糖诱导成骨细胞增殖的Notch信号通路研究

目的:探讨脂多糖(LPS)对成骨细胞增殖的Notch信号通路的诱导激活作用.方法:以MC3T3-E1细胞为模型,设计正常对照组、LPS浓度梯度组(5、10μg组)、DAPT组(先加入DAPT,随后加入10μg LPS)和DMSO组(先加入DMSO,随后加入10μg LPS).分别于OBDM培养基中诱导分化5d和15d时加入不同浓度的脂多糖、DAPT和DMSO,培养3d后进行MTT实验,随后采用PCR检测各组细胞中HES1mRNA表达量.结果:与对照组相比,加入脂多糖5μg组第5天,脂多糖10 μg组第5、6、7天时细胞吸光度显著降低(P＜0.01);与正常对照组相比,5μg组和10 μg组脂多糖均能够使MC3T3-E1细胞和成骨细胞前体细胞增殖能力降低(P＜0.01),而仅5μg组LPS能够使成骨细胞增殖分化能力降低(P＜0.01);不同浓度LPS均能够诱导HES1mRNA的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);随着LPS浓度增加,HES1mRNA表达量显著增加(P＜0.01);与对照组相比,DM-SO组HES1mRNA量显著较高,差异具有统计学差异(P＜0.05).结论:脂多糖抑制骨头发育和愈合,可能是通过激活经典的Notch信号通路,诱导HES1mRNA的表达,抑制成骨细胞及其前体细胞的增殖分化造成.     

Notch1和Notch2表达与宣威女性肺癌的关系及意义

目的 研究Notch1和Notch2在宣威女性肺癌中表达的临床意义.方法 采用免疫组化SP法检测54例宣威女性肺癌患者癌组织及远端正常肺组织中Notch1和Notch2表达,结合患者的临床病理特征及随访资料,探讨Notch1和Notch2在宣威女性肺癌患者病情评估及预后判断中的作用.结果 Notch1和Notch2蛋白主要表达于细胞质,在宣威女性肺癌中的阳性表达均显著高于远端正常肺组织(P＜0.05);Notch1和Notch2蛋白在不同临床分期、分化程度及淋巴结转移与否患者中的表达差异有统计学意义(P＜0.05).Notch1、Notch2蛋白在宣威女性肺癌中的表达呈正相关(P＜0.05).结论 宣威女性肺癌组织中存在Notch1和Notch2基因异常表达升高,Notch1和Notch2蛋白的表达水平结合临床分期作为宣威女性肺癌患者预后判断的参考指标有一定的指导意义.     

Notch1调控小鼠脑出血后海马神经发生与神经功能恢复

目的 探讨Notch1在小鼠脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后对海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分裂方式影响中的作用以及对小鼠ICH后远期神经功能恢复的影响.方法 利用免疫荧光、Western blot、转轮实验和平衡木实验等方法检测小鼠脑出血后海马NSCs的分裂方式情况、Notch1蛋白表达情况和神经功能恢复情况.结果 与Sham组比较,ICH导致小鼠海马NSCs水平分裂的比例明显降低(P＜0.01),同时发现小鼠海马中Notch1的表达也明显降低(P＜0.05).促进ICH小鼠海马中Notch1的表达能够有效地增加小鼠海马NSCs水平分裂的比例(P＜0.01),维持NSCs的数量,同时能够有效地增加ICH后小鼠转轮实验掉落的潜伏期以及小鼠海马中DCX阳性细胞数(P＜0.01),维持神经发生的持续性,另外还能够减少ICH后小鼠平衡木行走实验腿的滑落次数(P＜0.01).结论 Notch1信号可以调控脑出血后小鼠海马NSCs的分裂方式以及促进远期神经功能恢复.     

BMP2在SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化中的调控作用

目的 研究BMP2在SVZa神经干细胞向γ-氨基丁酸(GABA)能神经元分化中的调控作用.方法 体外分离培养P0昆明小鼠室管膜下区(SVZa)神经干细胞,纯化传代培养3代后,使用不同浓度BMP2诱导SVZa神经干细胞,采用流式细胞仪检测不同浓度BMP2作用下SVZa神经干细胞分化为GABA能神经元的比例;另外利用活体荧光GFP标记GAD67特异性启动子,动态地研究BMP2在SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化中的作用.在此基础之上,采用RT-PCR检测不同浓度BMP2作用下Mash1的表达.结果 不同浓度BMP2作用组分化为GABA能神经元的比例均高于空白对照组,10 ng/ml浓度的BMP2组比例最高;10 ng/ml浓度BMP2组,GAD67-GFP标记阳性细胞数目明显高于对照组;10 ng/ml浓度BMP2组Mash1表达高于其他组.结论 BMP2促进SVZa神经干细胞向GABA能神经元的分化;10 ng/ml浓度的BMP2显著促进Mash1的表达.     

电针结合左归丸对脑缺血再灌注大鼠SYN表达及突触超微结构的影响

目的：观察电针、左归丸对脑缺血再灌注大鼠突触素（synaptophysin,SYN）在缺血侧额顶叶皮层不同时间表达的影响,以探讨电针、左归丸促进脑缺血损伤后突触可塑性的相关机制。方法：采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注动物模型,随机分为假手术组、模型组、左归丸组、电针组、电针结合左归丸组（针药组）。电针组电针百会、大椎、心俞、肾俞,左归丸组给予左归丸灌胃,电针加左归丸组同时用电针、左归丸治疗。应用免疫组织化学法检测电针、左归丸对缺血区额顶叶皮层突触素的表达。结果：与模型组比较,在第7、14天,电针组、左归丸组、针药组SYN表达极显著增高（P〈0.01）。与电针组比较：在第7、14天,针药组SYN表达极显著增高（P〈0.01）,左归丸组SYN表达水平极显著降低（P〈0.01）;与左归丸组比较,针药组在第7、14天均极显著高于左归丸组（P〈0.01）。电针和左归丸促进脑缺血大鼠额顶叶皮层病理损伤具有改善作用,明显促进突触超微结构的恢复。结论：电针和左归丸促进脑缺血大鼠额顶叶皮层突触超微结构的恢复,促进突触重建。左归丸及电针对脑缺血再灌注模型大鼠SYN表达均具有不同程度的促进作用,它们可能通过保护大鼠缺血区皮层的突触超微结构促进突触可塑性的形成。     

己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的促增殖、分化作用及其机制。方法:取孕16天SD胎鼠海马NSCs培养,分别设空白对照组,己烯雌酚1×10-7 mol/L组、1×10-8 mol/L组、1×10-9 mol/L组,以及脑源性神经营养因子(BDNF)5×10-2 mg/L组;免疫荧光化学方法检测Nestin、神经元特异烯醇化酶及神经胶质酸性蛋白的表达,RT-PCR检测BDNF mRNA的含量。结果:不同剂量己烯雌酚处理各组神经球面积、积分光密度值、平均突起长度与平均突起数均增加,其中10-8 mol/L组海马NSC增殖与分化最明显,BDNF mRNA表达量亦最高(P<0.01)。结论:己烯雌酚对海马NSCs的增殖分化具有促进作用,且可能与上调BDNF的表达有关。     

Wnt3a影响大鼠海马神经干细胞增殖的体外研究

目的:探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外增殖的影响。方法:采用机械分离、无血清传代培养法,从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对NSCs及其分化情况进行鉴定。将NSCs与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)共孵育,观察Wnt3a对NSCs体外增殖情况的影响。结果:海马源胚胎NSCs具有增殖能力,可以传代培养,可分化为神经元和星形胶质细胞。与Brdu共孵育后,添加Wnt3a的实验组Brdu阳性率高于对照组(P0.01)。结论:使用机械分离、无血清培养的方法获得的NSCs具有增殖和多向分化能力,Wnt3a可以促进大鼠海马NSCs的体外增殖。     

神经干细胞的命运决定机制及其靶点调控的研究进展

神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是哺乳动物神经系统中神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的分化来源。近年来对于NSCs的增殖与分化机制及其在临床治疗神经退行性疾病的研究在世界范围内引起了学者们的极大兴趣。多种细胞调节因子存在于微环境中共同调节NSCs的自我更新、迁移及分化。其中Notch通路,NF-κB通路与Wnt通路尤其作为NSCs发育中的“命运决定者”而受到广泛的关注。它们中的每条通路均具有独自控制分化与增殖的能力。本文针对Notch通路、Wnt通路以及NF-κB通路对NSCs增殖与分化的作用机制进行了归纳与阐述,对其中潜在的药物作用靶点与目前最新的内、外源化合物对NSCs增殖与分化的作用进行了总结,希望对今后神经再生方面的研究提供理论指导。     

全反式维甲酸诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用

目的：观察全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）体外对大鼠中脑神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的诱导分化作用及其可能的分子机制。方法：分离培养孕14～15 d大鼠中脑NSCs,使用1.0μmol/L ATRA诱导1、3、5和7 d,以免疫组织化学染色观察ATRA对NSCs分化为多巴胺能神经元的影响;RT-PCR分析维甲酸（retiadic acid,RA）各受体表达情况。结果：ATRA诱导后多巴胺能神经元特异性酪氨酸羟化酶（TH）染色呈阳性,细胞有多个细长突起,与对照组比较,诱导7 d后多巴胺神经元特异性TH染色阳性细胞率均明显升高（P〈0.01）;各诱导组RA受体βmRNA的表达量均明显升高（P〈0.01）,而且存在时间依赖性。结论：ATRA能显著提高NSCs分化为多巴胺能神经元的比例,同时发现细胞维甲酸A受体（RAR）βmRNA表达增加,RARβ激活可能促进NSCs向多巴胺神经元方向的分化。     

外源性神经节苷脂对神经干细胞增殖、分化作用的初步研究

目的 探讨外源性神经节苷脂(GM1)对从胎鼠大脑分离培养的神经干细胞(NSCs)增殖及分化的作用.方法 ①利用无血清培养技术从胎鼠大脑皮层和海马分离培养原代细胞,加血清诱导其分化.②在NSCs培养基和DMEM/F12培养基中加入不同浓度的GM1,观察GM1对NSCs增殖和分化的影响.结果 ①与不含GM1的NSCs培养基相比,在NSCs培养基中加入低浓度的GM1,NSCs的生长无明显改变,随着GM1浓度的增加,NSCs克隆球体积逐渐减小,细胞逐渐死亡;②在DMEM/F12培养基中单独加GM1而不加血清,NSCs克隆球均未见继续生长,也未见分化,而是迅速的死亡.结论 在NSCs培养基中,低浓度(12.5 μg/mL)GM1对NSCs的增殖无明显影响,但较高浓度的GM1对NSCs的增殖有抑制作用;在无血清的DMEM/F12培养基中,GM1不能诱导NSCs分化.