化学去细胞同种异体神经移植的实验研究

目的探讨化学去细胞同种异体神经的免疫学特性及其修复灵长类动物神经缺损的能力。方法(1)分别获取SD大鼠的坐骨神经和猕猴的正中神经,经4.0%TritonX-100和72mM脱氧胆酸钠溶液重复消化处理,制备SD大鼠和猕猴的化学去细胞神经。在Wistar近交系大鼠的皮下植入化学去细胞同种异体神经和新鲜SD近交系大鼠的神经,检测植入部位组织内T淋巴细胞及其亚群的浸润程度。(2)用化学去细胞同种异体神经移植修复猕猴5cm长的正中神经缺损,通过功能观察、神经电生理检测、神经再生组织学、S-100免疫组织化学染色和运动终板染色观察神经移植后的效果。结果化学去细胞异体神经植入体内后,移植神经周围组织浸润的CD3+、CD4+和CD8+细胞数量明显少于新鲜同种异体神经移植的对照组。去细胞同种异体神经可以修复猕猴5cm长的周围神经缺损,在移植术后5个月患肢功能均有不同程度的改善。移植术后6个月神经电生理检测显示,刺激可以通过移植段神经到达远端的效应器,在神经支配区肌肉可以记录到运动诱发电位,跨过移植神经段的传导速度已达(40.5±6.8)m/s。神经再生组织学检查显示有再生的神经纤维通过移植段神经,在去细胞异体神经移植段内分布纵行排列的雪旺细胞,在支配区肌肉可以检测到重建的运动终板。结论化学去细胞同种异体神经的抗原性明显降低,可修复高等哺乳类动物的周围神经损伤。     

灵长类去细胞神经的萃取制备及异体移植后早期神经再生观察

目的发展新的化学处理方法，清除灵长类周围神经中的细胞和髓鞘，降低其抗原性，萃取粗大和长段的去细胞神经移植物，并观察其同种异体移植的早期神经再生。方法以Triton X-100和脱氧胆酸钠溶液化学处理猴长段正中神经和坐骨神经。萃取的去细胞神经行普通组织学染色、免疫组化染色及透射电镜检查，观察其组织结构。以去细胞神经同种异体移植修复猴正中神经3．0cm和胫神经5、0cm缺损，术后3周和8周，通过大体观察、HE染色及免疫组化染色观察早期神经再生一结果细胞和髓鞘已被彻底清除，神经基底膜和雪旺细胞基底板层保留完好，去细胞神经成为空的神经基质管。移植术后8周轴突再生已通过远端吻合口，移植段再血管化及雪旺细胞增殖良好。结论该化学处理可萃取灵长类粗大和长段的去细胞神经，作为同种神经移植物不会被排斥吸收。     

优化法去细胞大鼠神经同种异体移植修复坐骨神经缺损

[目的]以优化法去细胞大鼠神经移植,修复同种异体坐骨神经缺损,观察术后动物的免疫排斥、早期功能恢复及神经再生情况。[方法]以优化去细胞方法处理新鲜取材的成年SD大鼠坐骨神经,移植修复同种异体1.0cm坐骨神经缺损,以自体神经和新鲜异体神经移植为对照,术后1个月行坐骨神经功能指数评价、神经电生理和组织学检查,观察动物在功能恢复、免疫排斥及神经再生方面的情况。[结果]自体神经和去细胞异体神经移植组动物的坐骨神经功能指数无显著差异(P>0.05),大体观察均可见神经连续性良好。电生理检测表明2组动物移植神经均已恢复电传导能力,在传导速度(CV)上无显著差异(P>0.05),但均未达到正常神经水平(P<0.05)。组织学观察则显示2组再生神经纤维均已长入移植段远端。S-100免疫组化显示两者在雪旺氏细胞数、形态和排列等方面无明显差异。2组在CD8 T细胞和巨噬细胞免疫组化染色阳性面积百分比上差异无统计学意义(P>0.05)。计算移植神经中段轴突密度后表明两者无显著差异(P>0.05),但都比正常神经小(P<0.05),比新鲜异体神经移植组大(P<0.05)。[结论]优化去细胞神经移植组与自体神经移植组在免疫排斥、功能恢复及神经再生方面无显著差异。优化法去细胞神经在移植修复同种异体神经缺损时,可以达到免疫耐受,其早期功能恢复和神经再生情况良好,在修复周围神经缺损时可以作为自体神经移植的一种替代疗法。     

人类去细胞同种异体神经移植物化学萃取方法的研究

目的：新鲜同种异体神经免疫排斥反应的标靶是细胞、髓鞘。发展新的化学处理方法,清除人类周围神经中的细胞和髓鞘 ,萃取粗大和长段的去细胞神经移植物。方法：切取年轻男性遗体捐献者的长段尺神经,以triton X-100和脱氧胆酸钠溶液按一定浓度和程序进行化学处理。萃取神经及新鲜神经行HE染色、髓鞘染色及纤维素染色,以观察细胞、髓鞘及神经基底膜;免疫组织化学染色以显示许旺细胞基底板层;行半薄切片及超薄切片透射电镜检查,观察超微结构。结果：去细胞神经的延展性及神经外膜的韧弹性良好。细胞和髓鞘被彻底清除,神经基底膜被保留;许旺细胞基底板层保留完好;去细胞神经为一种没有细胞髓鞘及其碎片的空的神经基质管。结论：Triton X-100及脱氧胆酸钠化学处理方法,可有效清除人类周围神经中的细胞及髓鞘,萃取粗大和长段的去细胞神经;该神经移植物保持了网管柱状组织结构,保留了许旺细胞基底板层及板层素。     

化学去细胞异体神经修复神经缺损长度的实验研究

[目的]研究神经长度是否影响化学去细胞神经的质量及化学去细胞异体神经修复犬神经缺损的适当长度范围。[方法]切取犬的坐骨神经全长，截取直径近似段长度12cm，去除神经外膜的脂肪组织及血管，在5．0％Triton X-100和5．0％脱氧胆酸钠中重复消化得到化学去细胞神经；部分神经用于组织学评价，将12cm神经按顺序切割为6段，石蜡包埋制备切片，厚度5μm。HE染色和Fastblue染色，观察去细胞程度、神经细胞外基质结构完整性、髓鞘染色强度，观察每段神经的差异。在体内实验中，用化学去细胞异体神经桥接犬的坐骨神经缺损，缺损长度分别为8、10cm组，每组各有6条成年犬，随访时间12个月。观察动物肢体功能恢复、肌电图变化及再生神经组织学表现，包括HE染色、S-100免疫组织化学染色、乙酰胆碱酯酶染色。[结果]去细胞神经全长各段在去细胞程度、结构完整性及残余髓鞘染色综合评价中无差异。体内移植实验结果显示8cm去细胞异体神经移植组的犬在术后12个月踝关节可直立行走，而10cm去细胞异体神经移植组犬12个月时踝关节不能直立行走。肌电图检查结果显示，两组动物的手术肢体均可记录到诱发的运动和感觉电位。肌电图波幅、时限及运动神经传导速度结果显示，8cm移植组明显高于10cm移植组（P〈0．05）。组织学检查显示8cm移植组再生的神经轴突通过移植段神经到达远侧的神经中，并与所支配的肌肉建立新的运动终板联系，坐骨神经支配的小腿三头肌中有大量新生的运动终板形成。在10cm移植组有部分再生的神经纤维通过移植段神经进入远端的神经，小腿三头肌中新生的运动终板数量和大小明显低于8cm移植组（P〈0．05）。[结论]在化学去细胞神经的制备中，神经的长度对去细胞的质量无影响；化学去细胞异体神经修复神经缺损的长度若不超过8cm可取得较满意的功能康复结果。     

改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究

[目的]改进去细胞异体神经化学萃取制备方法，制备出细胞及髓鞘去除完全、神经机构保存完好的去细胞异体神经移植物。[方法]SD大鼠14只，取双侧坐骨神经（共28根），分3组进行化学萃取去细胞处理：Son．dell法组（10根）、改良法组（10根）和对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为TritonX-100和脱氧胆酸钠；改良法组所用萃取剂为TritonX-200、SB-10和SB-16；对照组未进行化学处理。处理后神经行HE染色、快蓝染色、基底膜素免疫组化染色及环境扫描电镜观察，并从去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面综合评价。[结果]在去细胞异体神经物理性状方面，改良法制备的去细胞异体神经韧性弹性略好于Sondell法；HE染色表明，2种方法的去细胞效果均较好，但改良法对神经结构的破坏较小；快蓝染色、基底膜素免疫组化染色、环境扫描电镜结果均表明，改良法在对髓鞘的去除、基底膜素的保留及神经结构的保存方面均优于Sondell法；综合质量评分结果表明，2种方法在去细胞效果方面相似（P1〉0．05），髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法（P2、P3〈0．05），综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性3方面，改良法制备的去细胞异体神经质量优于Sondell法（p4〈0．05）。[结论]综合运用萃取剂TritonX-200、SB-10和sB-16的化学萃取方法，是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物，为自体神经移植找到了较好的替代解决方法。     

优化法去细胞神经同种异体及异种移植的比较

目的 分别以优化法去细胞(OA)大鼠坐骨神经及兔臂丛分支移植修复大鼠坐骨神经缺损,观察免疫排斥情况、早期功能恢复及神经再生情况,以比较此优化法处理的同种异体及异种神经移植物修复周围神经缺损的能力. 方法 以新鲜新西兰大白兔臂丛分支、自体坐骨神经、OA处理过的新鲜取材的SD大鼠坐骨神经及新西兰大白兔臂丛分支,移植修复成年SD大鼠坐骨神经1.0 cm缺损,即新鲜异种神经移植组、自体神经移植组、OA异种神经移植和OA异体神经移植组,分别于术后1个月及3个月行功能评价(SFI)、电生理(CV)和组织学检查,观察免疫排斥、功能恢复及神经再生情况. 结果 术后1个月,OA异体和OA异种神经移植组的SFI、CV、轴突密度分别为:61.38±5.59、(32.23±0.91)m/s、(22.26±1.74)m/s和(0.782±0.081)(个/100 μm2),3个月分别为59.00±5.40、(31.80±0.99)m/s、(23.35±2.40)m/s和(0.778±0.046)(个/100μm2);术后1个月,异体和异种神经移植CD8+T细胞和巨噬细胞染色阳性百分比分别为0.17385±0.01805、0.09299±0.01565和0.30223±0.09449、0.19537±0.02010.同种异体神经移植组与异种神经移植组在免疫排斥、功能恢复及神经再生方面差异无统计学意义(P＞0.05),且都明显优于未处理新鲜神经移植组(P＜0.05).3个月时的神经再生及功能恢复情况优于1个月组(P＜0.05). 结论 优化去细胞法处理的同种异体及异种神经移植物在修复周围神经缺损时,均可以达到免疫耐受,移植动物早期功能恢复和神经再生情况良好.     

大鼠脱细胞异体脊髓支架的免疫原性研究

[目的]评价脱细胞脊髓支架的免疫原性,为其在组织工程中的应用奠定理论基础。[方法]将脱细胞脊髓(冻融 3%脱氧胆酸钠 DNase,RNase消化)及新鲜大鼠脊髓分别植入SD大鼠椎旁肌内,于术后1～4周分别取材进行组织学观察,通过HE染色评价炎症反应程度;应用免疫组织化学方法观察移植物及周围组织中的CD3、CD4和CD8阳性T细胞浸润程度,评价免疫排斥反应强度。[结果]组织学观察显示术后均引起周围组织炎症反应,脱细胞组术后1周可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润,但2周后只有少量淋巴细胞浸润;新鲜异体脊髓移植组术后1周可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,术后4周仍有大量淋巴细胞浸润;与新鲜异体脊髓移植比较,化学去细胞异体脊髓植入后免疫原性明显降低,但仍有轻度细胞介导的免疫反应存在。[结论]移植经化学去细胞处理的异体脊髓后,仅引起轻微的炎症反应和免疫排斥反应,具有良好的组织相容性,并有可能成为良好的脊髓组织工程替代材料。     

化学去细胞异种神经移植后宿主的许旺细胞在移植物内的增殖

目的 观察化学去细胞异种神经移植后宿主许旺细胞向移植物内增殖的情况。方法 移植化学去细胞兔神经修复大鼠1cm坐骨神经缺损，4个月后处死动物，取移植物行苏木精-伊红染色、S-100免疫组织化学染色及透射电镜观察。结果 再生神经纤维顺利长入移植物，围绕再生纤维有大量胞体S-100免疫组化反应阳性的细胞呈条索状排列，半薄切片显示移植物内再生轴突排列整齐，透射电镜显示有细胞包绕再生轴突并形成髓鞘。结论 化学去细胞异种神经移植后宿主许旺细胞可随再生纤维长入移植物并形成髓鞘。     

化学去细胞异体神经促神经再生的体外实验研究

[目的]对大鼠化学去细胞异体神经蛋白成分进行电泳分析,观察去细胞异体神经中的蛋白组分;制备去细胞神经薄膜,接种背根神经节,观察其结构对神经生长的影响。[方法]按Sondell法制备大鼠的去细胞异体神经,将制备好的神经进行电泳分析,观察28～30 kDa区域的髓鞘蛋白的去除程度;将制备的神经进行冰冻切片,接种鸡胚背根神经,进行神经纤维荧光染色,观察神经纤维在神经切片上的生长方向。[结果]去细胞异体神经电泳结果显示:28～30 kDa区域髓鞘蛋白完全消失,化学萃取的去细胞神经可以完全去除髓鞘蛋白;背根神经节发出大量的神经纤维沿着去细胞神经基底膜管方向生长。[结论]去细胞异体神经中无残留引起免疫反应的髓鞘蛋白,保留的基底膜管结构对促神经纤维再生具有引导性作用。     

化学去细胞同种异体神经移植物储存方法的初步研究

目的探索犬去细胞神经的最佳储存方法.方法采用真空封装辐照灭菌法深低温储存犬去细胞坐骨神经12个月,进行细菌学检查、一般组织学观察、免疫组化染色、透射电镜观察.结果储存过程中不会发生细菌污染,储存去细胞神经的延展性及神经外膜的韧弹性保持良好;其基本结构、神经基底膜及许旺细胞基底板层被保留;仍然保持为没有细胞髓鞘及其碎片的空的神经基质管.结论真空封装辐照灭菌法可有效储存去细胞神经1年.     

异种神经基膜管桥接周围神经缺损的初步研究

目的探索经化学萃取的去细胞神经基膜管支架用于异种移植桥接周围神经缺损的可行性.方法 SD大鼠 30只,随机分为5组,分别制作预溃变2周(溃变支架桥接组)和新鲜的兔胫神经进行化学萃取,形成去细胞神经基膜管支架(异体支架桥接组),兔新鲜胫神经束(异种神经移植组);切取自体神经15 mm原位移植(自体神经移植组),修复大鼠坐骨神经长15mm 的缺损.坐骨神经切断后不作移植修复,为对照组.术后6个月行坐骨神经功能指数(SFI)测定和疼痛试验,用美蓝染色、免疫组织化学、透射电镜等方法对吻合口、移植体中央和远侧神经段的再生神经纤维进行形态学观察,并对再生有髓纤维的数量、直径及髓鞘厚度等进行量化分析.结果术后3个月,仅有溃变支架桥接组、支架桥接组和自体神经移植组动物患肢行走逐渐恢复.6个月时,针刺患足可引起背部肌肉收缩和下肢屈曲反应;术后6个月行SFI检测,溃变支架桥接组为-36.2%±9.7%,支架桥接组为-30.7%±6.8 %,自体神经移植组为-33.9%±11.3%,各组间比较无统计学意义(P>0.05).组织学观察见溃变支架桥接组与支架桥接组移植体中央横切面再生神经呈微束状分布.透射电镜观察见再生神经纤维具有正常的形态和结构.图像分析结果显示溃变支架桥接组再生有髓纤维的数量和直径均达到自体神经移植组的水平(P>0.05);但溃变支架桥接组再生纤维的髓鞘厚度明显小于自体神经移植组(P<0.05).结论用化学方法萃取的兔神经基膜管支架能移植于大鼠,成功桥接周围神经缺损,为应用动物神经修复人体周围神经缺损提供了实验依据.     

无细胞的异体神经修复鼠坐骨神经缺损

目的 通过化学萃取同种异体神经,去除髓鞘和雪旺细胞,形成无细胞基膜管后桥接鼠坐骨神经缺损,研究神经再生效果。方法 正常鼠坐骨神经用非变性生物剂处理后得到无细胞的基膜管,桥接鼠坐骨神经20mm缺损。实验分3组:无细胞基膜管移植组(A组),自体神经移植组(B组)和异体神经移植组(C组)。术后进行肌电图、光镜、电镜及图象分析仪检查。结果 A组再生神经有大量轴突通过移植体,术后2个月电生理检测再生神经的潜伏期及波幅低于B组(P<0.05),术后3个月2组差异无显著意义。髓鞘厚度在术后3个月时亦低于B组,差异有显著意义(P<0.05)。轴突直径及数目两组无差异。C组因无神经再生,结果无法测量。结论 这种无细胞基膜管移植体能支持轴突的生长和雪旺细胞的迁移,是一种良好的神经移植替代材料。     

Nerve graft immunogenicity as a factor determining axonal regeneration in the rat

Acellular basal lamina grafts have recently been reported to support axonal regeneration and have been used in peripheral nerve repair. The present study was designed to determine the immunogenicity of such basal lamina allografts (grafts that are genetically different) and their potential as bridging material for nerve gap repair. Inbred strains of Fischer and Buffalo rats with known histocompatibility differences were used. Acellular grafts were prepared by repeated freezing and thawing nerve tissue predegenerated in situ for 6 weeks. Non-frozen predegenerated nerves were used as cellular grafts for comparison. Fischer rats were used as hosts and received cellular or acellular grafts obtained from Fischer (isograft, genetically identical) or Buffalo (allograft) donors. The grafts were evaluated morphologically at 1, 2, 4, and 12 weeks after transplantation. The cellular isografts supported axonal regeneration best. The cellular allografts were invariably rejected and were unsuccessful or only partially successful in supporting regeneration. In contrast, acellular allografts, in spite of their mild immunogenicity were successful in supporting regeneration, as were the acellular isografts. The rate of host axonal regeneration and recovery of target muscle was reduced in acellular allografts and isografts as compared to cellular isografts. It is concluded that acellular allografts are suitable for supporting axonal regeneration and may be used to bridge gaps in injured peripheral nerves.     

化学去细胞法对粗大神经质量评价方法及影响因素的探讨

目的 通过对粗大神经去细胞方法的研究，探讨对去细胞神经评价和制备的适宜方法。方法 取杂种犬3只，切取5段直径6mm的新鲜坐骨神经，每段长50mm，在3％ Triton-100和7％脱氧胆酸钠溶液中去细胞处理。实验分为5组：Ⅰ组，去细胞2遍；Ⅱ组，去细胞3遍；Ⅲ组，去细胞4遍；Ⅳ组，神经段两端用4号缝合线结扎后去细胞2遍；Ⅴ组，神经段两端用4号缝合线结扎后去细胞3遍。另设对照为未经处理的新鲜犬坐骨神经。从去细胞程度、基底膜板层素（Laminin）活性、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性4个方面进行评价。结果 所有实验组神经段去细胞完全，Laminin活性保存完好。髓鞘染色评分以Ⅳ组和Ⅴ组最低，纤维管道完整性评分以Ⅰ组和Ⅳ组最佳。综合评价对于粗大神经的去细胞处理方法以Ⅳ组处理方法最佳。结论 化学去细胞的神经脱髓鞘程度与去细胞次数不平行。在去细胞神经的质量控制中，应考虑基底膜Laminin的活性、去细胞、脱髓鞘及结构完整性的程度。对于粗大神经的处理，结扎神经段两端后再行去细胞处理可能是一种较好的方法。     

粗大去细胞神经移植物的化学萃取及组织学研究

目的：发展新的化学处理方法，清除犬周围神经中的细胞和髓鞘，萃取粗大长段的去细胞神经移植物。方法：以Triton X-100和脱氧胆酸钠溶液化学处理犬坐骨神经，萃取神经行组织学及免疫组织化学观察。结果：去细胞神经弹性好，细胞和髓鞘被彻底清除，雪旺细胞基底板层保留完好，成为空的神经基质管。结论：该方法可有效清除大型哺乳类粗大神经的细胞及髓鞘，该神经移植物保持了网管柱状结构，保留了雪旺细胞基底板层及其主要成分一板层素。     

去细胞异种神经复合神经生长因子修复神经缺损的实验研究

目的 应用含有神经生长因子(NGF)的去细胞异种神经基膜管作为神经移植替代物桥接大鼠坐骨神经缺损,观察其对神经再生的作用.方法 选用Wistar大鼠45只,随机分为3组,每组15只,于术制成右后肢坐骨神经长10 mm的神经缺损,取兔胫神经制成去细胞神经基膜管,电镜及HE染色观察神经基膜管超微结构,流式细胞仪检测去细胞前后神经主要组织相容性抗原Ⅱ(MHC Ⅱ)的变化情况.A组以含有NGF的去细胞异种神经基膜管桥接神经缺损,B组单纯采用去细胞异种神经基膜管桥接神经缺损,C组采用自体神经移植修复神经缺损.术后1个月行神经电生理检测即胫后肌群运动诱发电位,用HE染色、免疫组化染色、透射电镜等方法对移植体远端吻个口再生神经纤维进行形态学观察,并对再生有髓神经纤维的数量、密度、直径及雪旺细胞的密度进行量化分析.结果 移植前新鲜神经组MHC-Ⅱ检测值为72.14±19.88,去细胞组MHC-Ⅱ检测值为4.19±3.11,两组比较差异有统计学意义(t=3.817,P＜0.05);透射电镜观察显示为胶原性管道,无细胞成分.术后4周,处死前行运动诱发电位检测,神经传导速度A组为(21.16±2.31)m/s,B组为(13.37±1.89)m/s,C组为(21.43±2.18)m/s,A组与 C组比较差异无统计学意义(P＞0.05),A组与 B组比较差异有统计学意义(P＜0.05).组织学观察见3组移植体远端吻合口横切面再生神经纤维呈微束状,透射电镜观察再生神经纤维具有正常的形态和结构.A、C组再生神纤纤维数量及直径均优于B组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 经化学萃取的去细胞兔胫神经基膜管能够移植于大鼠,成功修复大鼠坐骨神经缺损,而且复合NGF的去细胞基膜管在神经修复质量上优于单纯的去细胞神经基膜管,更加接近自体神经移植的效果.