人乳头瘤病毒16 E7 (HPV16E7)逆转录病毒载体的构建

目的 构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段（HPV16E7）的逆转病毒载体。方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段，并用酶切，连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上，然后再用酶切，测序进行鉴定，通过Genbank的数据库分析软件对PV16E7进行同源性分析。结果 经酶切分析，测序证明，从HPV16cDNA克隆的300bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组，HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源怀。结论 构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体，为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。     

HPV16 E6/E7融合基因真核表达载体的构建

目的构建pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。方法应用聚合酶链反应技术(polymerasechain reaction,PCR)从SiHa细胞中扩增出人类乳头瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因全长片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上。结果获得了包含全长阅读框架的HPV16E6/E7基因,并成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。     

HPV16E7基因的原核克隆及表达

目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制

目的 为研究HPV16 E7蛋白在肿瘤早期预报中的作用及研制治疗性疫苗,特制备HPV16 E7的单克隆抗体.方法 将构建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的质粒转化BL21细菌,在IPTG诱导下,稳定表达GST-HPV16E7融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA双筛,直至检测所有孔均为E7阳性而GST阴性为止,扩大培养、建株、冻存并制备腹水、单克隆抗体.结果 成功制备出HPV16 E7的单克隆抗体,可在多种肿瘤组织细胞核中染色.结论 该抗体是HPV16 E7蛋白特异性的McAb.     

人乳头瘤病毒16型早期基因E7的克隆及其在原核细胞中的表达

目的 进一步研究与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因的生物学活性。方法 采用ＰＣＲ法从妇女宫颈癌标本中扩增ＨＰＶ１６早期基因Ｅ７,测人ＤＮＡ诉序列,结果 克隆的ＨＰＶ１６Ｅ７基因与标准型进行比较表明,前者无核苷酸突变。将此基因装入原核表达载体,能在Ｅ．Ｃｏｌｉ中高效表达出谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）－Ｅ７蛋白,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,此融合蛋白能在Ｅ７抗体特异地结合。结论     

人乳头瘤病毒16型E7基因原核表达载体的构建及表达

目的: 构建人乳头瘤病毒16型 (HPV-16) E7基因原核表达载体,观察目的基因的蛋白表达。方法:人工合成HPV16 E7基因核苷酸序列,利用特异性引物通过聚合酶链反应扩增HPV16 E7基因,并克隆至pGEX-4T1原核表达载体,构建重组表达载体pGEX-4T1-HPV16-E7。 将其转化到工程菌Rosetta后,经IPTG诱导表达,进行E7-GST融合蛋白的SDS-PAGE分析和Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果: E7基因PCR扩增产物和重组表达质粒的双酶切产物经琼脂糖
凝胶电泳,均可见300 bp的目的基因条带。表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳和纯化后,在相对分子质量约36 000处有特异性表达带,与预期相符。结论: 在原核系统中含E7基因的重组质粒可有效表达E7-GST融合蛋白。     

Telomerase expression in normal human fibroblasts by introduction of human papillomavirus type16(HPV16) E6 and E7 genes

用已构建的含有     

人成纤维细胞转染HPV16型早期蛋白基因后端粒酶的活性表达

用已构建的含有HPV16的早期蛋白的质粒载体:pME6SN、pME7SN和pME6E7SN经脂质体介导,转入正常的人成纤维细胞.经G418选择筛选及鉴定后证实,E6、E7、E6E7转化的细胞寿命延长;E6、E6E7表达的细胞中有端粒酶的表达,E7表达的细胞中未能检测到端粒酶的表达.提示端粒酶的表达是细胞转化后的一个后续事件.     

人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a( ),并构建重组质粒pET32a( )/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.     

人乳头状瘤病毒16型E2基因的克隆表达

采用分子克隆技术在大肠杆菌中表达HPV16 E2 ORF。用Cfol和BamHI将含有E2基因的3.2kb片段从HPV16基因组中切出来,用S1核酸酶修平末端;同时,表达性载体pBD2 DNA用HindⅢ切开后也用S1核酸酶修平末端.两者连接后转化E coli BMH71—18.用原位杂交技术筛选出阳性重组子,进行DNA酶切分析和蛋白质SDS-PAGB分析及免疫学鉴定.我们认为表达的蛋白质为β-gal与E2的融合多肽。     

宫颈癌组织中HPV16 E7序列多态性分析

目的探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性.方法采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变.结果50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例.33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸.结论广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846.     

宫颈癌组织中HPV16E7序列多态性分析

目的 探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性。方法 采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变。结果 50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例。33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸。结论 广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846。     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。     

逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

目的 研究HPV16E7（human papillomavirus 16 E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞，检测HPV16E7基因的整合与表达，并用生长曲线，血清依赖试验，电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察，了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆，已传代50代，PCR及RT－PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录，转化细胞的生长速率要高于正常软骨,二者都对血清有较大程度的依赖，转化细胞的核质比大，核仁明显，S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强，可连续传代达50代。     

宁波地区人类乳头瘤病毒16型E6基因序列分析

目的 分析宁波地区妇女宫颈癌组织中HPV 16型E6基因的变异情况.方法 收集宫颈组织石蜡标本80份,按诊断时的年龄分组,其中年龄≤35岁为A组（37例）;年龄＞35岁为B组（43例）.从宫颈癌组织石蜡样本中提取HPV病毒基因组DNA,采用PCR技术扩增HPV 16型E6 DNA,并进行DNA测序.结果 HPV 16型E6 DNA总阳性率为43.75％,其中A组阳性率为56.76％,B组阳性率为32.56％,两组差异有统计学意义（P＜0.05）;与德国标准株相比,本次研究共发现9个突变位点,其中178位点突变频率最高,A与B组178位点突变率差异无统计学意义（P=0.70）.结论 HPV 16型引起的宫颈癌有年轻化趋势,T178G突变可能是HPV 16型持续性感染的重要因素,在宫颈癌的防治中应当引起重视.     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达。结果经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功。结论构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础。     

噬菌体抗体库技术构建HPV16 E7人源化单克隆抗体

目的：构建抗ＨＰＶ１６Ｅ７的噬菌体抗体库。方法：由感染者抗凝血中分离外周淋巴细胞，提取细胞总ＲＮＡ，以逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ），用人ＩｇＧ　Ｆａｂ基因特异引物，从合成的ｃＤＮＡ中分别扩增出抗体轻链和重链可变区基因，回收纯化ＰＣＲ产物。用ＳｐｅＩ＋ＸｈｏＩ酶切重链可变区基因，ＸｂａＩ＋ＳａｃＩ酶切轻链可变区基因，先后克隆入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３。结果：ＰＣＲ产物经电泳证实分子量大小正确，酶切电泳证实质粒构建正确。结论：成功构建抗体轻链和重链基因克隆，建立抗ＨＰＶ１６Ｅ７噬菌体抗体库。     

人乳头瘤病毒16型E7C端亚基因片段的克隆与表达

目的旨在获得无转化活性而保留抗原性的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７Ｃ端,为进一步研制抗ＨＰＶ１６疫苗打下基础。方法应用自行设计合成的引物进行ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ端亚基因片段,并克隆入真核表达载体ｐＬＮＣＸ。结果准确获得含有Ｅ７Ｃ亚基因片段的重组质粒ｐＬＮＣＥ７Ｃ,将ｐＬＮＣＥ７Ｃ转染Ｂ１６细胞。对Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交阳性克隆应用Ｅ７多抗进行免疫组织化学方法检测,检出Ｅ７Ｃ的表达。结论所构建的表达质粒适于ＤＮＡ疫苗的制备。