As2O3免疫毫微球对急性早幼粒细胞白血病 NB4细胞的特异性杀伤作用

目的:验证单克隆抗体CD33导向的三氧化二砷免疫毫微球(CD33-As2O3-BAS-MS)对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞的特异性杀伤作用.方法:通过光镜和电镜鉴定单克隆抗体CD33与毫微球的共价连接,用MTT比色分析法、苔酚蓝染色、3H-YDR掺入法检测CD33-As2O3-BAS-MS的细胞杀伤活性,流式细胞计数法测定细胞凋亡与分期.结果:先镜下可见NB4细胞周围结合免疫毫微球,电镜下可见NB4细胞伸出伪足紧密地与免疲毫微球结合在一起;MTT比色分析法、苔酚蓝染色、3H-TDR掺入法进一步验证了免疫毫微球特异性杀伤NB4细胞的活性.肿瘤细胞被诱导凋亡,GO/G1期细胞百分比减少,G2/M期百分比明显增加.结论:CD33-As2O3-BAS-MS能特异性杀伤急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞.     

细胞内砷浓度与三氧化二砷治疗敏感性的关系

 目的 研究几种白血病和实体瘤细胞内三氧化二砷（As₂O₃）浓度对其治疗敏感性的影响。方法 将几种白血病细胞株和原代细胞及实体瘤细胞株分别给予特定浓度和时间As₂O₃干预后，原子荧光法测定细胞内砷浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 一定浓度和时间As₂O₃干预后，不同细胞内药物浓度不同。NB4细胞株＞APL原代＞K562细胞株＞CML原代＞HL60细胞株＞AML-M2原代＞HeLa细胞株＞肝癌腹水H₂₂细胞株＞胃腺癌SGC-7901细胞株＞喉癌Hep-2细胞株。在最低促凋亡浓度水平以上的低浓度、长时间持续干预比短期高浓度干预的细胞内砷浓度高，凋亡率大。结论 细胞内砷浓度不同可能是As₂O₃治疗敏感性不同的原因之一。     

靶向给药系统材料与制剂

 目的：探索用于靶向载药系统的材料与制剂方法。方法：以溶解淀粉为原料，环氧氯丙烷为交联剂，Fe₃O₄为磁性材料,采用逆相悬浮交联聚合机制合成了中性磁性淀粉微球(ESM,一种用环氧氯丙烷作交联剂的淀粉微球)。以其为原料,用Na₃P₃O₉作交联剂进行二次交联和阴离子化,得到一种阴离子型磁性淀粉微球(TSM,一种用三聚偏磷酸钠作交联剂的淀粉微球)。研究了上述两种微球的表观形态、粒径分布、溶胀性、载药性能和体外磁响应性。结果：两种磁性微球的各项性质符合设计要求。结论：以溶解淀粉代替预糊化淀粉,1～2μm粒径的Fe₃O₄代替30μm以下小粒径磁质制备磁性微球是可行的。     

As2O3 不同给药方式对 NB4 细胞侵袭力和 MMPs 活性的影响

 目的 对比 As₂O₃ 不同干预方式对白血病细胞株 NB4 的侵袭力和基质金属蛋白酶 2,9(MMP-2 、 MMP-9) 活性的影响。 方法 噻唑蓝（ MTT ）法检测 As₂O₃ 恒定和变化两种体系体外干预对 NB4 细胞的增殖抑制, ELISA 检测 2 种体系中处理的 NB4 细胞的 MMP-2 和 MMP-9 蛋白含量的变化。明胶酶谱法检测 2 种 As₂O₃ 处理前后 NB4 细胞 MMP-2 活性变化, Westen blot 检测活性 MMP-9 蛋白表达, Transwell 小室穿透实验检测两种 As₂O₃ 处理方式对 NB4 细胞穿透力的影响。 结果 ①与平行对照组比较 0.1 μmol·L^-1 As₂O₃ 恒定浓度体系中持续作用 72 h ,对 MMP-2 、 MMP-9 的活性和 NB4 细胞侵袭力影响不显著。 0.5 μmol·L^-1 As₂O₃ 持续作用 24 h 与对照组比较无明显差异, 48 h 以后 MMP-2 、 MMP-9 的活性和 NB4 侵袭力降低,与对照组比较差异显著。 1.0 μmol·L^-1 以上浓度 As₂O₃ 处理 24 h , MMP-2 、 MMP-9 活性和 NB4 细胞侵袭力下降,并呈时间依赖性。② 2.0 μmol·L^-1 As₂O₃ 恒定浓度体系与峰浓度为 5.0 μmol·L^-1 ,终质量浓度为 0 μmol·L^-1 的变化浓度体系比较,前者对 NB4 的侵袭力和 MMPs 活性的抑制程度比后者更显著。 结论 NB4 细胞的侵袭力与其 MMP-2 、 MMP-9 活性有关,促分化有效的低浓度 As₂O₃ 对 NB4 细胞侵袭力和 MMP-2 、 MMP-9 活性抑制作用不明显。在干预时间相同的情况下,促凋亡有效的恒定浓度 As₂O₃ 持续作用,对 NB4 细胞侵袭力和 MMP-2 、 MMP-9 活性的抑制强度大于峰浓度很高但持续时间很短的变化浓度体系 , 这可能是临床上 As₂O₃ 持续缓慢输注法较常规给药法更能有效降低急性早幼粒细胞白血病（ APL ）中枢神经系统浸润和早期的致死性脑出血发生率的机制之一。     

神经节苷脂对染砷人脑皮层神经元的保护作用

 目的研究神经节苷脂对As2O3体外干预的皮质神经元的保护作用及可能机制。方法将人原代脑皮质神经细胞分为 5组,空白对照组、5 μmol·L^-1 As₂O₃干预组和5μmol·L^-1 As₂O₃加神经节苷脂50,100,200 μg·L^-1组,Fluo-3/AM荧光探针标记皮质神经元胞浆钙([Ca²⁺]i),激光共聚焦显微镜实时测定[Ca²⁺]_i的变化。磷基转移法测定细胞膜和胞浆的蛋白激酶C(PKC) 的活性。流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。结果 5 μol·L^-1的As₂O₃,作用3 min,[Ca²⁺]_i开始升高,并随时间延长逐渐明显,As₂O₃加神经节苷脂200 μg·L^-1,作用9 min,[Ca²⁺]i才开始升高,且程度远没有As2O3组明显。5 μmol·L^-1的As₂O₃组的 PKC活化程度明显高于As₂O₃加神经节苷脂组,以细胞膜相明显。24 h凋亡率分别为:As₂O₃组78.5%,As₂O₃加神经节苷脂 200μg·L^-1组13.5%。结论神经节苷脂抑制As₂O₃引起的皮质神经元的[Ca²⁺]i升高和PKC活化,抑制细胞凋亡。并通过对细胞膜靶点的保护来实现对神经细胞的保护作用,这进一步证明砷剂最初的作用靶点是细胞膜。     

独活不同提取部位抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的： 通过比较独活不同提取物对H₂O₂ 致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,筛选药理活性最强的提取部位 方法： 以回流提取,溶剂萃取及硅胶柱层析方法得到独活不同提取部位预保护6 h后与250 μmol·L^-1 H₂O₂ 共同作用于人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y） 24 h,MTT检测细胞活力,并试剂盒法测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量,以及免疫荧光细胞化学法检测脑源性神经营养因子（BDNF）和神经因子-3（NT-3）的表达量 结果： 独活各提取物除石油醚萃取物外均能救护H₂O₂ 所致SH-SY5Y细胞活力降低,且有明显的量效关系;4种提取物均能增强SOD活性,降低MDA含量,不同提取部位抗氧化作用无差异;石油醚-乙酸乙酯组显著增强BDNF、NT-3蛋白表达（与正常组比较,分别为94.5%和97.5%）,其神经营养作用强于其余提取物。结论： 独活不同提取部位均可不同程度保护H₂O₂ 损伤SH-SY5Y细胞,其中石油醚-乙酸乙酯组作用最强。     

银杏叶提取物对H2O2诱导的巨噬细胞凋亡的抑制作用

 目的研究银杏叶提取物(EGb761)对H₂O₂所致RAW264.7巨噬细胞凋亡的保护作用。方法以H₂O₂诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡为实验模型,用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞术、蛋白质印迹分析、琼脂糖凝胶电泳和荧光分析分别检测细胞存活率、线粒体膜电位、细胞色素C的释放和Bax,bcl-2蛋白水平、DNA的降解、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)活性。结果EGb761能明显降低H₂O₂对RAW264.7细胞的氧化损伤,提高细胞的存活率；维持线粒体膜的完整性,抑制跨膜电位的耗散和细胞色素C的释放；抑制caspase-3的活化和DNA的降解。结论EGb761具有清除活性氧,减轻H₂O₂所致RAW264.7细胞的氧化损伤,在对H₂O₂诱导的细胞凋亡中发挥重要的抗凋亡作用。     

三氧化二砷对豚鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

 目的 研究三氧化二砷(As₂O₃)对豚鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响。方法Fluo-3／AM荧光探针标记豚鼠心室肌细胞游离钙离子,激光共聚焦显微镜实时测定不同浓度As₂O₃干预5 min后心室肌细胞的胞浆钙的变化。不同剂量的As₂O₃对正常台氏液中的豚鼠心肌细胞体外浓度递减性干预13 h后心肌细胞DNA片断化的情况。结果 不同浓度As₂O₃对心室肌细胞的胞浆钙影响不同。在正常台氏液中,低浓度As₂O₃引起一过性钙增高,高浓度的As₂O₃引起持续钙增高,并被钙通道阻滞剂维拉帕米不完全阻断。在无钙台氏液中,低浓度As₂O₃对胞浆钙无影响,高浓度的As₂O₃引起持续钙增高。10μmol·L^-1的As₂O₃体外浓度递减性干预13 h后,豚鼠心肌细胞发生DNA的片断化。低于10μmol·L^-1的As₂O₃体外浓度递减性干预13 h后,心肌细胞无明显的DNA片断化。结论 As₂O₃影响细胞外钙内流和细胞内钙库释放,导致心肌细胞内的游离钙升高,其机制可能有电压依赖性钙通道参与。低浓度引起胞内一过性钙升高;高浓度导致胞内持续性钙升高。后者可能是As₂O₃诱导细胞凋亡的机制之一。     

中心复合设计优化5-氟尿嘧啶肝动脉栓塞微球的制备工艺

 目的 应用中心复合设计优化5-氟尿嘧啶肝动脉栓塞明胶微球的制备工艺，以提高微球性质的可预测性。方法 采用乳化交联法制备，以微球栽药量、粒径、包封率为因变量对明胶浓度(X₁)、乳化剂的用量(X₂)、乳化转速（X₃)3个自变量的各水平进行多元线性回归和二项式拟合，并进行预测分析。结果 载药量、包封率和粒径拟合所得多元二次方程的复相关系数r²分别为0.949 5,0.808 6,0.891 5。结论 中心复合设计法优化微球制备工艺预测性良好。     

芍药苷对H2O2诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用

目的 研究芍药苷对过氧化氢（H₂O₂）诱导人神经瘤母细胞（SH-SY5Y）凋亡的保护作用及其机制。方法 制备H₂O₂诱导的氧化应激损伤模型。相差显微镜观察SH-SY5Y细胞形态的变化;CCK-8法测定细胞存活率;Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡;碘化丙啶染色、流式细胞仪检测细胞周期;2′, 7′-二氯荧光素二乙酸盐（DCFH-DA）法检测细胞内活性氧（ROS）;INT显色反应法测定乳酸脱氢酶（LDH）的量;ELISA法检测8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的量;caspase-3催化特异性底物反应检测caspase-3活性。结果 与对照组相比,200 μmol/L H₂O₂作用SH-SY5Y细胞24 h,使细胞存活力显著下降（P＜0.01）,细胞凋亡率上升（P＜0.01）,增殖指数（PI）降低（P＜0.05）,8-OHdG的量上升（P＜0.01）,LDH释放量和细胞内ROS量增加（P＜0.01）,caspase-3活性增强（P＜0.01）。与H₂O₂损伤组相比,芍药苷终浓度为20～40 μmol/L,可浓度相关地减轻H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞上述指标的变化（P＜0.05）;芍药苷10 μmol/L组细胞PI、LDH和8-OHdG量未有明显改观,但能显著减轻H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞毒性、ROS和caspase-3活性（P＜0.05）。结论 芍药苷对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞损伤具有显著保护作用,该作用可能与其清除ROS、减轻DNA氧化损伤、抑制细胞凋亡的caspase通路激活和调节细胞周期有关。     

主动载药法制备三氧化二砷脂质体

目的 采用主动载药法制备三氧化二砷（As₂O₃）脂质体,并优化处方组成,考察主动载药法制备As₂O₃脂质体的可行性。方法 采用正交设计法筛选处方,主动载药法制备As₂O₃脂质体;用葡聚糖凝胶G-50柱分离脂质体和游离药物,用原子荧光分光光度法测定包封率;用电镜观察脂质体的外观形态,并用激光粒径分析仪测定脂质体的粒径和Zeta电位;并进一步考察其优势。结果 所得脂质体的包封率为（72.3±0.8）%;形态为粒径均匀的球形或类球形,粒径为（193±12）nm,Zeta电位为（36.1±3.0）mV;脂质体具有良好的安全性与较好的稳定性。结论 优选得到的As₂O₃脂质体处方和制备工艺合理,并且所制备的As₂O₃脂质体具有良好的安全性。     

JAK,PTPs抑制剂钙拮抗剂对As2O3引起的[Ca2+]i变化的影响

 目的　研究蛋白酪氨酸激酶 (JAK)、蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPs)抑制剂和Ca²⁺通道阻滞剂对As₂O₃致人脑皮层神经元和白血病细胞的胞浆 [Ca²⁺]_i变化的影响。方法　Fluo-3/AM荧光探针标记胞浆游离Ca²⁺,激光共聚焦显微镜实时测定不同浓度As₂O₃干预后胞浆[Ca²⁺]_i 的变化及JAK PTPs抑制剂和Ca²⁺通道阻滞剂对As₂O₃引起的胞浆[Ca²⁺]_i 变化的影响。结果　As₂O₃升高胞浆[Ca²⁺]_i,并被Ca²⁺通道阻滞剂不完全抑制。1μmol·L^-1的As₂O₃使NB4胞浆[Ca²⁺]_i明显增高,而对神经元胞浆[Ca²⁺]_i 影响不明显。JAK抑制剂genistein能浓度依赖性抑制As₂O₃触发的[Ca²⁺]_i 升高。给药后 280s的总抑制率均值分别为NB4:(6.7± 2.9)%,(25.6±2.5) %和(52.2±3.5)%;皮层神经元:(7.8±3.1)%,(18.1± 2.8) %和(51.3±3.3)%。结论　As₂O₃对不同细胞的胞浆[Ca²⁺]_i 升高程度不同。JAK,PTPs参与As₂O₃触发的钙池操纵性Ca²⁺内流。Ca²⁺通道阻滞剂参与了As₂O₃触发的电压门控性Ca²⁺内流。     

纳米雄黄炮制方法的探讨

目的:以炮制品得率及残渣质量,粒径分布,As2S2和As2O3的含量为指标,考察不同炮制方法对纳米雄黄的影响,筛选其最佳炮制方法。方法:采用高能球磨法制备纳米雄黄生品,利用水飞法、酸水飞法和碱水飞法对其进行炮制,计算各炮制品得率及残渣质量;利用激光散射法测定粉体粒径,电镜扫描法观察粉体的表观形貌;直接碘量法和二乙基二硫代氨基甲酸银法(Ag-DDC法)分别测定各样品中As2S2与As2O3的含量。结果:水飞品、酸水飞品和碱水飞品的得率分别为96.71%,95.86%,79.08%,残渣质量分别为0.328,0.891,2.208 g;生品及各炮制品的平均粒径分别为(157.3±4.8),(143.9±6.2),(137.7±4.5),(139.8±5.3)nm;As2S2质量分数分别为(94.26±1.33)%,(98.97±0.98)%,(99.58±1.45)%,(99.37±2.60)%,As2O3质量分数分别为(9.64±0.68),(3.44±0.29),(2.83±0.27),(18.17±1.70)mg·g-1。结论:3种炮制方法均能减小纳米雄黄生品的粉体粒径,提高其As2S2的含量,且水飞法和酸水飞法均可降低其As2O3的含量。确定最佳炮制方法为酸水飞法。     

不同剂型三氧化二砷增效减毒作用的研究进展

三氧化二砷(As₂O₃)已有两千多年的药用历史，其药性猛烈，中医经典方剂中常作以毒攻毒之用，主要将As₂O₃用于各类疑难杂症的治疗。现代医学研究发现，As₂O₃在治疗血液系统恶性疾病和抗肿瘤方面效果显著，但其安全剂量小，不良反应强，限制了As₂O₃的临床使用与疗效。随着新型给药系统研究与发展，以及制剂材料、设备技术日渐丰富成熟，各种As₂O₃新剂型应运而生，为推进实现As₂O₃类药物制剂减毒增效这一核心目标提供了强大助力。归纳了As₂O₃古今各种剂型，总结As₂O₃的药用特性、已有制剂类型及其相关临床适应证，并以此为基础探讨As₂O₃制剂的未来发展方向和应用前景，以期为深入发掘As₂     

不同产地雄黄及其炮制品中二硫化二砷和可溶性砷含量比较

目的:比较研究不同产地雄黄及其炮制品中主成分As2S2及可溶性砷盐As2O3的含量差异。方法:采用2010年版《中国药典》雄黄项下的滴定法测定不同产地雄黄及其炮制品中As2S2的含量,采用AFS-230E型原子荧光光度计检测上述样品中可溶性砷盐As2O3含量。结果:不同产地的雄黄及其炮制品中As2S2,As2O3含量存在显著差异。雄黄炮制后,炮制品中As2S2含量均提高,As2O3含量均明显降低。除吉林和江苏2个产地的的雄黄及其炮制品中As2S2含量<90.0%,其余样品均符合药典规定;且雄黄炮制品中As2O3含量均能控制在1.7 mg.g-1以下。结论:研究结果可为指导雄黄临床合理用药提供参考依据。     

Angiopep-2修饰的载三氧化二砷介孔二氧化硅脂质囊纳米递药系统的构建及体外评价

目的以聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA)接枝的介孔二氧化硅纳米粒(mesporous silica nanoparticles,MSN)为核(PAA-MSN),采用薄膜水化法自组装形成Angiopep-2(氨基酸残基序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)修饰的功能化MSN脂质囊纳米粒(ANG-LP-PAA-MSN)。通过Angiopep-2与血脑屏障(blood brain barrier,BBB)和脑胶质瘤细胞上高表达的低密度脂蛋白相关受体1(LRP-1)特异性地识别、结合,旨在增加水溶性药物三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)跨血脑屏障并靶向脑胶质瘤能力。方法采用透射电子显微镜(TEM)、热重分析仪(TGA)等考察递药系统的理化性质和载药量,透析袋法考察其不同pH(pH 6.0、7.4)环境下的释药特征;噻唑蓝(MTT)比色法考察递药系统对人脑微毛细血管内皮细胞(HBMEC)和脑胶质瘤细胞(C6)毒性;通过构建体外BBB细胞模型研究载体对As_2O_3跨膜转运能力的影响。结果该载药纳米粒(ANG-LP-PAA-MSN@As_2O_3)呈圆整的"核-壳"结构,分散性与稳定性良好,载药量为6.32%;PAA接枝后的递药系统突释现象显著改善并表现出pH响应特性;脂质囊包裹以后的递药系统显著提高了生物安全性,同时增加了药物的跨BBB转运率;体外抗肿瘤活性结果表明ANG-PAA-LP-MSN@As_2O_3具有较好的体外抗脑胶质瘤效果。结论该智能靶向递药系统能够有效增加As_2O_3跨BBB转运,增加药物在脑胶质瘤部位的聚集,并实现肿瘤部位pH响应释放药物。     

As2O3对人骨肉瘤细胞的体外效应

 目的研究三氧化二砷(As₂O₃)对人骨肉瘤细胞U20S的生物学效应及其机制。方法利用MTT法观察As₂O₃对U20S 细胞的生长抑制作用;Annexin V-FTTC+PI双参数检测细胞凋亡;流式细胞仪测定经不同浓度As₂O₃处理后U20S细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡相关蛋白Fas和Bcl-2阳性细胞百分率及细胞内钙离子(IECa²⁺)含量变化。结果As₂O₃可显著抑制U20S细胞生长,且剂量-效应和时间-效应关系显著(P<0.05),其24,钙和72 h的IC₅₀值分别为10.66,2.43和0.46 μmol·L^-1。U20S细胞经As₂O₃处理后可发生凋亡。As₂O₃能显著增加Fas蛋白表达和IECa²⁺含量(P<0.01),下调PCNA蛋白表达(P<0.01),对Bcl-2表达无影响(P>0.05)。结论As₂O₃在体外可显著抑制人骨肉瘤细胞U20S生长并引起凋亡,其机制可能与上调Fas表达和IECa²⁺含量及降低PCNA蛋白表达有关。     

三氧化二砷结合靶向递送系统——实体瘤治疗的新策略

从50年前“癌灵一号”成功应用于白血病治疗以来,国内外学者对三氧化二砷(As₂O₃)进一步应用于实体瘤进行了大量的探索。然而,由于砷本身毒性大,且在到达肿瘤组织前会被免疫系统快速清除,其在实体瘤治疗中的应用仍处于开发研究阶段。靶向递送系统具有毒性小、靶向性好的优点,与新技术新材料结合后,在实体瘤的治疗中显现出优势,具有广阔的研究前景。鉴于此,研究者们开发了一系列具有被动靶向性、主动靶向性和响应性释放的新型As₂O₃靶向递送系统,以实现As₂O₃的定时定位靶向递送。总结和梳理了近年来有关As₂O₃靶向递送系统应用于实体瘤治疗的研究进展,以期为As₂O₃靶向递送系统应用于实体瘤的治疗研究提供参考。