以EB病毒为靶的基因治疗策略

EB病毒与多种人类肿瘤的发生有关，根据EB病毒感染的特点，近年来发展了以EB病毒为靶的基因治疗的基本策略。本文综述了这一研究领域的最新进展。     

Epstein—Barr病毒核抗原的研究进展

Epstein—Barr病毒(EBV)是引起传染性单核细胞增多症(IM)的病原体,且与Burkitt淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)具有密切关系。EBV感染人类B淋巴细胞后引起细胞转化,其基因组整合于宿主细胞DNA或以附加体的形式存在,多数表现为潜伏感染。迄今,在EBV感染或转化的细胞中已发现多种EBV特异性抗原:壳抗原(VCA),膜抗原(MA),早     

EB病毒相关鼻咽癌PD-L1表达与预后相关性研究

摘 要：［目的］ 探讨鼻咽癌中EB病毒及细胞程序性死亡配体-1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）表达及对预后的预测价值。［方法］ 87例接受根治性放化疗的初治非转移性鼻咽癌患者的病理切片,分别采用原位杂交法(in situ hybridization,ISH)和免疫组化法（immunohistochemistry,IHC)行EB病毒编码小RNA(EBV-encoded RNAs,EBER)和PD-L1表达的检测,并将EB病毒状态和PD-L1表达水平与患者近期疗效及长期预后行相关性分析,主要研究终点包括缓解率(response rates,RR)和总生存率(overall survival,OS)。［结果］ 87例鼻咽癌原发病灶病理组织切片中,8例(9.2%)EBER表达阴性,79例(90.8%)阳性;1例（1.1%）PD-L1表达阴性,50例(57.5%)低表达,36例(41.4%)高表达。EBER阳性患者中,PD-L1高表达者较多,但差异无统计学意义(P=0.062)。PD-L1高表达与患者较好的预后呈正相关。亚组分析显示在EBER阳性组中,PD-L1高表达与阴性/低表达者的5年无复发生存率(91.8% vs 78.5%,P=0.039,HR=0.382,95%CI：0.142~1.027) 和5年无进展生存率(82.5% vs 68.0%,P=0.036,HR=0.363,95%CI：0.135~0.974)差异显著,而在EBER阴性组中,PD-L1表达与预后无明显相关性。［结论］ PD-L1高表达与EBV相关鼻咽癌的局部复发和疾病进展相关,深入探讨鼻咽癌的免疫微环境将有助于筛选出免疫治疗的潜在获益人群。     

EB病毒与鼻咽癌相关的前瞻性观察

1986—1990年我们对广东省鼻咽癌高、中、低发区的四会、中山、广州、湛江、汕头共123087名健康人群进行了包括EB病毒血清学、鼻咽脱落细胞学、间接鼻咽镜及鼻咽光纤镜、鼻咽活检在内的前瞻性观察。在这队列中共发现鼻咽癌126例。通过本研究我们发现:(一)、EB病毒IgA/VCA阳性人群中鼻咽癌检出率是阴性人群的40.7倍;但阴性不能完全排除鼻咽癌可能性(二),IgA/VCA抗体的出现可先于鼻咽癌确诊4—46个月。(三)、有下列指标之一者应被视为鼻咽癌的高危人群;①IgA/VCA≥1:80。②IgA/VCA、IgA/EA、DNase三项中任何两项阳性。③上述三项中任何一项滴度持续上升。对列入高然对象者应争取作鼻咽光导纤维镜检查,并在好发部位取活检以发现更多临床T_0或T_1患者。     

鼻咽癌患者的EB病毒IgM／VCA抗体反应的研究

本文应用免疫酶法检测了162例鼻咽癌、34例鼻咽癌粘膜病变、41例其他肿瘤和80例正常人(其中35例已知IgA/VCA抗体阳性)血清中IgM/VCA抗体,并与IgA/VCA和IgA/EA抗体进行比较。发现鼻咽癌患者血清中不仅含有高滴度的IgA/VCA抗体,而且含有高滴度的IgM/VCA抗体,阳性率(≥1:10)分别为97.53％和93.20％,GMT为157.60和95.75。两种抗体水平均明显高于其他对照组。有临床分期的62例鼻咽癌患者的IgM抗体水平,有随病程进展而略有升高的趋势。提示鼻咽癌患者体内的EB病毒慢性持续感染和活跃的复制。 鼻咽癌患者与IgA/VCA阳性的正常人血清中IgA/VCA和IgM/VCA抗体双阳性率分别为92.0％和31.43％;IgA/VCA和IgA/EA抗体双阳性率为48.76％和14.29％。鼻咽癌患者血清中,前者双阳性率高于后者双阳性率,且与正常相比有显著差异(P<0.01)。表明IgA/VCA和IgM/VCA抗体一起作为早期发现鼻咽癌的血清学指标,可能优于沿用的IgA/VCA和IgA/EA指标,操作和成本亦较方便和便宜。     

鼻咽癌组织中EB病毒的不同原位检测方法比较

目的：探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测ＥＢ病毒的更快速、更灵敏的方法。方法：用地高辛标记的寡核苷酸ＥＢＥＲ－１和ＥＢＶ ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ｗ片段为探针，分别用原位杂交、原位ＰＣＲ检测鼻咽癌组织切片中ＥＢＶ的分布情况。结果：用寡核苷酸ＥＢＥＲ－１作探针原位杂交检测ＥＢ病毒的方法比用ＢａｍＨＩ－Ｗ片段作探鱼原位杂交及原位ＰＣＲ的方法更灵敏、更简单。结论：用ＥＢＥＲ－１作探鱼原位杂交检测鼻咽癌组     

门诊433例EB病毒IgA／VCA抗体阳性者的EB病毒IgA／EA抗体测定

1989年1—6月我们用免疫酶法测定在我所就诊病人BE病毒IgA/VCA抗体,对433例抗体阳性者用免疫酶法测定EB病毒IgA/EA抗体.其结果报道如下: 材料和方法 1、来我所就诊病人采血免疫酶法测定血清中EB病毒IgA/VCA抗体,对抗体阳性者测定其IgA/EA抗体。 2、B_(95)—8细胞片本所自制。Raji细胞片由中国预防医学科学院病毒所肿瘤病毒室供给。     

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌形成中的作用

EB病毒潜伏感染在鼻咽癌的形成中起着重要的作用.现综述近年来研究EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌形成作用中的进展情况,并着重介绍其对细胞信号传导通路、血管生成及转移等的影响.     

V-val subtype of Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 preferentially exists in biopsies of nasopharyngeal carcinoma

Epstein-Barr virus (EBV) has been suggested to be involved in pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma (NPC). However, EBV infection is ubiquitous, whereas NPC occurs with strong geographic and racial distribution. Whether a substrain of EBV contributes to this phenomenon remains uncertain. Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 (EBNA-1) is one of the most frequently detected EBV proteins in NPC tissues. Based on the polymorphism of amino acids at position 487, EBNA-1 is classified into five subtypes: P-ala, P-thr, V-val, V-leu and V-pro. To examine the relationship between subtypes of EBNA-1 and NPC, we determined the subtypes of EBNA-1 in biopsies of NPC, peripheral blood lymphocytes (PBL), and throat washings (TWs) obtained in endemic and non-endemic areas of NPC within China. The results revealed that V-val was the only subtype detected in NPC tissue, whereas three subtypes of EBNA-1, V-val, P-ala, and P-thr, were detected in PBL and TWs irrespective of origin, and mixed infection of V-val and P-ala was also observed. In addition, the variations of V-val derived from biopsies of NPC were identical to those derived from PBL and TWs in the context of N-terminus and C-terminus of EBNA-1. These facts indicate that a substrain of EBV with V-val subtype of EBNA-1 infects NPC preferentially and a susceptibility to a particular EBV isolate in the nasopharynx may exist during development of NPC.     

Rearranged Epstein-Barr Virus Genomes and Clonal Origin in Nasopharyngeal Carcinoma

Epstein-Barr virus (EBV) is known to be associated with two malignant diseases, nasopharyngeal carcinoma (NPC) and endemic Burkitt's lymphoma. In this study, the genomes of EBV in biopsy specimens from 4 NFC patients in Japan were analyzed using Southern blot hybridization. The NPC tissues of all examined cases contained rearranged EBV genomes whose Bam HI H fragments were larger than those of prototype EBV genomes. One of them had a Bam HI fragment containing contiguous sequences of Bam HI Y and H. A single-sized EBV DNA terminus was observed in these NPC tissues, implying the evolution of the carcinoma from a single EBV-infected cell.     

EB病毒感染鼻咽癌细胞后的增殖周期变化

背景与目的:EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)在不同组织类型鼻咽癌细胞内的增殖周期特征决定了基因治疗所采取的策略。本研究探讨EBV感染鼻咽癌细胞后的增殖周期特征。方法:利用EBV阳性的B95-8细胞标准株与鼻咽癌细胞CNE2接触培养,通过补体激活的细胞毒性试验去除共培养体系中的B95-8细胞,并采用逆转录聚合酶链式反应及Southern印迹杂交的方法分析鼻咽癌细胞中病毒的初始感染状态。结果:B95-8细胞与CNE2细胞接触共培养的方法使EBV成功感染CNE2细胞,EBV裂解期标志性基因BZLF1转录时间平均为12d,病毒感染标志性基因EBER转录时间平均为22d。结论:EBV侵入CNE2细胞后可能多数病毒开始处于裂解期增殖,之后EBV从裂解期进入了相对稳定的潜伏期,并随着细胞的传代培养病毒逐渐丢失。     

鼻咽癌前期病变中的EB病毒感染

背景与目的：鼻咽癌中的浸润性癌细胞均感染了EB病毒（Epstein-Barr virus．EBV）。前期病变可见于早期鼻咽癌癌旁上皮。本研究旨在通过检测前期病变中的EB病毒,探讨EB病毒感染存鼻咽癌变过程中的作用,及其基因型在鼻咽癌变过程中发生的宿主内演变。方法：采用核酸原位杂交检测15例早期鼻咽癌活检组织中的EB病毒编码RNA（EBV—encoded RNA,EBER）。采用巢式PCR法检测前期病变和癌巢中的EB病毒类型和潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1,LMPI）EB病毒株。具有代表性的LMPI基因羧基末端PCR产物采用四色荧光终止序列技术进行DNA序列分析。结果：所有15例早期鼻咽癌中的绝大多数浸润性癌细胞均呈EBER阳性。在15例的期病变中．14例可检测到EBER阳性的异常上皮细胞和／或浸润性淋巴细胞。单个A型EB病毒可在9例癌巢（11例适用）及9例前期病变（10例通用）的DNA样本中检测到。EB病毒LMP1基因羧基末端在15例癌巢DNA样本中均可检测到,其中14例是30bp缺失型LMP1 EB病毒株,1例是野生型和30bp缺失型LMP1株的混合感染。在11例适合做EB病毒LMP1基因羧基末端扩增的前期病变的DNA样本中,5例呈野生型和30bp缺失型LMP1 EB病毒株的混合感染,4例是单个缺大型LMP1 EB病毒株感染,1例呈单个野生型LMP1 EB病毒株感染,1例呈阴性反应。野生型LMP1基因羧基末端的DNA序列与B95—8细胞的DNA序列完全一致;30bp缺大型LMP1基因羧基末端的DNA序列却其有30bp缺失（密码子：346～355）和4个错义点突变（密码子：334、335、338和366）。结论：鼻咽上皮细胞的EB病毒感染是癌变过程中侵袭前的事件;而在鼻咽癌变过程中,EB病毒基因型会产生宿主内的演变。     

Functional advantage of NPC-related V-val subtype of Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 compared with prototype in epithelial cell line

Epstein-Barr virus (EBV) is closely associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC) and the viral nuclear antigen 1 (EBNA1) plays a crucial role in viral latency. Three EBNA1 subtypes, P-ala, V-thr and V-val have been detected from healthy carriers in Guangzhou area. A close relation of V-val EBNA1 with NPC was suggested by its preference to infect NPC cells. We therefore investigated the functional difference among these three EBNA1 subtypes in human epithelial cell line. The three coding sequences of the EBNA1 subtypes were cloned into the pGFP-C2 vector, and transfected into 293 cells, respectively. Effect of EBNA1 expression on cell proliferation was examined. The maintenance activity and expression level of EBNA1-plasmid in 293 cells were evaluated by using GFP as a reporter. The expression of P-ala, V-thr or V-val EBNA1 had no effect on 293 cell growth, while the relative average intensity of fluorescence after 14-day selection in V-val-EBNA1/293 cells was statistically higher than P-ala-EBNA1/293 (P<0.05, t test). We suggest that V-val EBNA1 with the functional advantage compared with prototype shown in this study might contribute to the tumorigenesis of NPC by increasing the expression of itself or other viral or cellular genes.     

EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响

背景与目的:已证实EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein,LMP1)具有转化致瘤作用,在鼻咽癌的发生发展中起重要作用。LMP1的转化致瘤作用可能与细胞凋亡有关,本实验目的是观察EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响,探索LMP1在鼻咽癌发生发展中的可能机制。方法:用电转染的方法将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,用荧光显微镜检测报道基因GFP的表达情况;用免疫组化法及Westernblot法检测目的基因LMP1的表达情况;用流式细胞仪、荧光染色及DNA片段分析等方法检测在有地塞米松磷酸钠或无血清饥饿诱导的情况下LMP1对CNE1细胞凋亡的影响。结果:CNE1G细胞(转染空载质粒PAT-GFP的CNE1细胞)及CNE1GL(转染目的基因质粒PAT-GFP-LMP1的CNE1细胞)有绿色荧光蛋白表达,CNE1细胞(未经转染的CNE1细胞)无绿色荧光蛋白表达;CNE1GL细胞LMP1呈阳性表达,而CNE1及CNE1G细胞均为阴性。CNE1、CNE1G及CNE1GL3组细胞分别用地塞米松磷酸钠或无血清1640培养液处理后均有凋亡出现,且两种诱导方法均能使CNE1GL组细胞的凋亡指数(apoptosisindex,AI)较CNE1及CNE1G组明显增高(P<0.05),而CNE1与CNE1G组的凋亡指数无明显差别。3组细胞常规培养下则无凋亡出现。结论:LMP1基因成功导入CNE1细胞     

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端Xho I酶切位点的丢失

背景与目的：众所周知,EB病毒LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用。本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho I酶切位点的丢失,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法：收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。收集EB病毒健康携带者外周血单个核细胞(PBMCs)10例作为对照。采用QIAamp DNA Mini Kit和QIAamp DNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区,并用Xho I对扩增产物进行酶切。采用四色荧光末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果：10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho I酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79．37％)出现Xho I酶切位点的丢失(Xho I—loss),还有4例(6．34％,)为Xho I酶切位点部分丢失,只有9例(14．29％)未见Xho I酶切位点的丢失(wt-Xho I)。除了Xho I酶切位点的丢失(nt：169423～169428;GAGCTC→GA□TCTC)外,还发现四个错义点突变。结论：本研究所检测的广东地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的：EB病毒LMP1基因为wt—Xho I,而在鼻咽癌组织中主要为Xho I-loss。因此,我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho I酶切位点的丢失和其他的错义点突变可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的。     

EBV-LMP1上调Ezrin表达对鼻咽癌细胞转移潜能的影响

背景与目的:细胞骨架相关蛋白Ezrin的异常表达与肿瘤侵袭转移密切相关,既往研究已证实EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein1,EBV-LMP1)可促进鼻咽癌细胞的转移能力。本研究旨在进一步探讨EBV-LMP1是否通过改变Ezrin的表达来影响鼻咽癌细胞的转移能力。方法:采用免疫细胞化学和Western blot检测两种鼻咽癌细胞株-CNE1细胞(EBV阴性)和CNE1-GL细胞(稳定转染EBV-LMP1)中LMP1和Ezrin的表达;细胞-基质粘附实验检测CNE1、CNE1-GL和经Ezrin抗体预处理的CNE1-GL细胞(AntiEzrin-CNE1-GL)对细胞外基质的粘附力;Transwell小室法检测上述3种细胞的运动和对重组基底膜侵袭能力。结果:CNE1细胞中Ezrin阴性表达,而CNE1-GL细胞中Ezrin强阳性表达。CNE1-GL细胞对细胞外基质的粘附率[(89.38±6.12)%]强于CNE1细胞[(49.42±5.37)%](P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞对基质的粘附率[(56.94±4.08)%]明显下降,与CNE1-GL相比,差异有统计学意义(P<0.05)。运动实验和侵袭实验均提示CNE1-GL细胞运动、侵袭能力(107±11和179±25)强于CNE1细胞(27±3和46±6),差异均有统计学意义(P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞的运动、侵袭能力(38±4和51±5)较CNE1-GL细胞显均显著下降(P<0.001)。结论:CNE1细胞中EBV-LMP1可通过上调Ezrin表达来促进细胞转移。     

Polymorphisms of Epstein-Barr virus BHRF1 gene, a homologue of bcl-2

Background and Objective: EBV BamHI fragment H rightward open reading frame 1 (BHRF1), the Epstein-Barr virus (EBV) early gene, is structurally and functionally homologous to the oncogene bcl-2 and may play an important role in the development of EBV-associated tumors. To characterize the polymorphisms of BHRF1 in EBV-associated tumors, we analyzed the sequences of BHRF1 in isolates from nasopharyngeal carcinoma (NPC) and EBV-associated gastric carcinoma (EBVaGC) biopsies as well as throat washing (TW) samp...