检测人乳总蛋白质含量新方法的研究——ICBB法

经过研究,我们确立了用改良考马斯亮蓝(ICBB)结合法测定人乳中总蛋白量.本法准确、灵敏,重复性好,较传统的微量凯氏定氮法及福林-酚法操作简便.经统计学处理本法与微量凯氏定氮法测定人乳总蛋白结果对照差异不显著(P>0.05).国内外目前尚未见到相同方法测定人乳总蛋白的报道.该法适用于较大量母乳营养状况的调查,对优生优育有重要指导意义.     

融合蛋白P11-A1的构建、表达及生物活性研究

目的:获得P11-A1融合蛋白并对融合蛋白的生物活性进行分析.方法:将人类栽脂蛋白A1和P11基因进行拼接.然后连接在表达载体pBV220上,将表达载体转化到大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析其表达情况.通过离子交换层析对融合蛋白进行纯化、Western印迹检测纯化产物.用液体闪烁计数器检测融合蛋白体外合成高密度脂蛋白(HDL)的能力来测定转酯活性,同时用溶圈法检测融合蛋白的溶栓活性.结果:融合蛋白的表达量为29%;离子交换层析获得纯度约为90%的蛋白;Western印迹显示该重组蛋白能够特异地识别载脂蛋白A1抗体,并且该融合蛋白在浓度为0.28 mg/ml时转酯活性为21.93 nmol/(h·ml),溶栓活性为22.2 U/mg.结论:成功获得具有转酯活性和溶栓功能的P11-A1融合蛋白.     

乙型肝炎病毒前S_2蛋白活力与病毒复制的关系

本文通过用ELISA法检测了122例各型乙型肝炎病人血清中的Pre-s_2蛋白:研究其与HBV复制的各种标志的关系,并讨论了其临床意义。 前s_2蛋白(Pre-s_z蛋白)测定以单克隆抗Pre-s_2抗体为主要试剂,采用夹心法原理,检测患者血清中Pre-s_2蛋白,具体操作方法按试剂盒说明书进行,S/N比值≥2.1及血清滴度>1∶10为阳性;HBV标志(HB_sAg,抗-HB_s、HB_eAg、抗-HB_e、抗-HB_c)均采用ELISA法     

SEREX方法鉴定CTCL细胞肿瘤抗原

目的 分离纯化皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞系SeAx细胞膜蛋白并制备多克隆抗体.利用SEREX法从SeAx cDNA噬菌体表达文库中筛选肿瘤抗原.方法 培养SeAx细胞至2×1010个,用组织匀浆器匀浆后差速离心法分离细胞各组分,富集细胞膜抗原.用细胞器特异性抗体对纯化步骤中的各组分进行检测.用膜蛋白组分免疫家兔4次,每次免疫后用ELISA法测定血清抗体滴度.4次免疫后用Western blot方法测定多抗与SeAx细胞各组分蛋白反应的特异性.重组噬菌体感染大肠杆菌,将表达的重组蛋白转印到硝酸纤维素膜上,与SeAx细胞膜蛋白免疫的兔血清进行反应,阳性的克隆测定核苷酸序列,通过数据库搜索比较确定基因.结果 用差速离心法得到SeAx细胞膜蛋白,免疫家兔4次后获得了效价为1×10-5的多克隆抗体.共筛选了1×106个噬菌体克隆,得到25个阳性克隆,经核苷酸序列测定和数据库分析,其中4个cDNA片段为膜蛋白成分,分别为integrin alpha 4,ligatin,matrix metalloproteinase 24和MHC-I molecule HLA-A.结论 分离并纯化了CTCL细胞系SeAx细胞膜蛋白,成功制备了多克隆抗体,用SEREX方法从SeAx mRNA建立的cDNA噬菌体表达文库中筛选到4个肿瘤细胞膜蛋白基因,它们可以引起机体产生体液免疫反应,并可能成为潜在的免疫治疗靶点.     

对溴甲酚绿·甲醇法测定血清总蛋白的方法学评价

血清总蛋白测定通常采用双缩脲法。1992年温杰等(中华医学检验杂志,1992,15(1):2)在国内首先报道应用溴甲酚绿·甲醇法测定血清总蛋白。为了考核该法的实用性和可靠性,我们将该法与双缩脲法作了较系统的方法学评价,报告如下。     

大肠杆菌O157∶H7新蛋白Ecs4563的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7新预测分子伴侣蛋白Ecs4563,以进一步开展其结构与功能的研究.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出分子伴侣基因ecs4563,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现诱导表达,采用Western印迹法进行鉴定,通过Ni2 螯合柱纯化获得目的蛋白.结果:构建了pET-24a-ecs4563重组质粒,实现了目的蛋白的融合表达,Ni2 金属螯合法纯化了目的蛋白,通过Western印迹法验证了融合蛋白的特异性.结论:得到了新预测分子伴侣Ecs4563,为下一步研究蛋白功能,进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

PTEN反义寡核苷酸对辛伐他汀调控心肌细胞肥大的影响

目的:观察抑癌基因—PTEN的反义寡核苷酸对辛伐他汀调控心肌细胞肥大的影响。方法:应用图像分析系统及[3H]-亮氨酸掺入法分别测定心肌细胞表面积及蛋白合成速率,RT-PCR检测心钠素(ANP)mRNA表达,RT-PCR和West-ern blot法检测PTEN的mRNA和蛋白表达水平。结果:辛伐他汀 PTEN反义链组心肌细胞表面积、[3H]-亮氨酸掺入率、ANP mRNA水平均明显高于辛伐他汀组(P<0.01),PTEN mRNA及蛋白表达水平明显低于辛伐他汀组(P<0.01)。结论:PTEN反义寡核苷酸能够抑制PTEN表达、部分逆转辛伐他汀对心肌细胞肥大的抑制作用。     

HCV核心蛋白诱导肝细胞侵袭性的体外研究

目的:探讨HCV核心蛋白对肝细胞侵袭性的影响.方法:构建HCV核心蛋白真核表达载体pIRES-core,稳定转染L02细胞,通过间接免疫荧光和Western印迹方法检测核心蛋白的表达,电镜观察肝细胞的形态变化,用体外迁移侵袭力实验测定转染HCV核心蛋白肝细胞的迁移侵袭的能力.结果:未转染细胞L02和转染空载体细胞相比,转染HCV核心蛋白细胞表达基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)的水平升高,并且该细胞的迁移侵袭能力明显升高(P<0.01).结论:HCV核心蛋白可能通过上调EMMPRIN的表达以提高肝细胞的迁移侵袭能力,为进一步探讨核心蛋白如何诱导肝细胞侵袭性奠定了基础.     

表阿霉素脂质体的制备与质量评价

目的:制备盐酸表阿霉素脂质体,建立HPLC含量测定方法并优选包封率测定方法.方法:采用薄膜分散-pH梯度法制备盐酸表阿霉素脂质体;采用HPLC测定药物含量;采用葡聚糖凝胶色谱、超滤及透析3种分离方法测定脂质体的包封率.结果:制备的表阿霉素脂质体粒径较小、分布较窄;3种方法测得盐酸表阿霉素脂质体的包封率分别为96.1%,98.4%,92.9%;结论:薄膜分散-pH梯度法适于制备盐酸表阿霉素脂质体,含量测定方法可靠.超滤法可以准确、快速地测定脂质体包封率.     

超离心SD法测定牛血清白蛋白及肉毒毒素分子量

用分析超离心机作蛋白质分子量测定,不需要标准蛋白,一般采用的方法有普通沉降平衡法,近似平衡法和(SD法)等三种。普通沉降平衡法为经典方法,计算公式理论推导可靠性强,测定结果准确,但离心时间很长,仪器耗费大。近似平衡法离心时间虽短,但不够精确。因而我们采用了SD法,     

基于N蛋白稳定表达细胞株的SARS-CoV间接免疫荧光检测方法的建立

目的:建立基于SARS-CoV N蛋白稳定表达细胞系的间接免疫荧光法,以在普通实验室对SARS-CoV特异抗体进行检测.方法:将含有SARS-CoV N基因的重组质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,筛选稳定表达细胞系并制备间接免疫荧光抗原片,以鼠抗SARS血清进行检测,并以其他呼吸道病毒抗体评估其特异性.结果与结论:建立了可检测SARS-CoV抗体的基于SARS-CoV N蛋白稳定表达重组细胞系的间接免疫荧光法,检测其他呼吸道病毒抗体为阴性,特异性良好.该间接免疫荧光法为SARS-CoV抗体的普通实验室检测提供了快速安全的诊断方法.     

血浆NGAL在创伤脓毒症诊断中的作用研究

目的 探讨血浆中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associate dlipocalin,NGAL)在创伤合并脓毒症诊断中的意义.方法 2007年6月～2010年6月就诊的81例创伤病人.入院当时以及12、24、48小时采血,ELISA法检测血浆NGAL浓度.测定入院时血液白...     

重组梅毒螺旋体表位抗原及多表位嵌合抗原研究

目的 :为梅毒检测试剂提供抗原性强、特异性高的重组表位抗原和多表位嵌合抗原。方法 :对梅毒螺旋体的主要抗原蛋白TpN15 ,TpN17,TpN44 .5和TpN47的优势抗原表位进行计算机分析 ,从中选取具有强抗原性的表位。根据大肠杆菌的偏性密码子 ,推断出这些抗原表位的基因序列 ,采用化学合成法合成表位抗原基因并克隆表达。结果 :获得了梅毒各抗原蛋白的优势抗原表位 ,构建了各表位基因及多表位嵌合基因的表达质粒 ,在E .coli中获得了高效表达。用获得的重组蛋白质纯品 ,对 12 2份心磷脂测定阳性血清样品进行测定 ,证明重组梅毒表位抗原和多表位嵌合抗原具有预期的抗原活性。结论 :重组梅毒表位抗原及多表位嵌合抗原具有较好的抗原活性 ,可用于研究不同类型的梅毒检测试剂     

考马斯亮兰测定微量蛋白及其应用改进

考马斯克兰法(CBB)测定脑脊液蛋白(CSF—P)存在有空白吸光度值(Ao)高、产物吸光度值差小(△_A)、试剂稳定性差等缺点,手工法测定极不稳定。我们参照有关文献,对该法作了改进并应用于泰尔康RA—500型全自动生化分析仪上,测定各种微量蛋白,效果满意,现介绍如下。1 试剂与方法1.1 试剂:3g/L CBB甲醇贮存液1ml/支 3.5％HclNS液100ml(其中含CH_3OH20ml10％Brj;351ml);室温保存可用4周。     

PTD-NGF融合蛋白的制备、活性分析及其跨膜功能研究

目的:构建PTD-NGF融合基因,检测表达的重组蛋白生物学活性和跨膜转运功能.方法:提取小鼠大脑组织RNA逆转录后,钓取β-NGF基因.PCR技术构建PTD-NGF融合基因,插入表达质粒pBV220后,转化大肠杆菌DH5α进行表达与纯化.稀释法复性后,SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达重组蛋白.PC12细胞分化培养检测融合蛋白的生物学活性.重组蛋白与HepG2细胞共孵育,免疫组化检测其跨膜功能.结果:PTD-NGF融合基因测序正确,表达产物与目的蛋白大小相符,能与NGF抗体发生结合反应.纯化后蛋白纯度可约达90%以上,重组蛋白经复性可诱导PC12细胞出现明显分化,并能跨膜进入HepG2细胞内部.结论:成功构建了融合基因,表达的重组蛋白具有显著的生物学活性及跨膜转运功能.     

两种方法检测尿WBC、RBC的结果比较

目的:了解尿液分析仪与显微镜测定RBC、WBC结果是否有差异.方法:使用长春迪瑞H-300型自动尿液分析仪及配套尿10项试纸条对尿液标本按规定进行测定,同时混合尿液离心镜检.结果:两种方法对RBC、WBC检出率一致.两种方法对RBC检测的敏感度略高于对WBC的敏感度.结论:干化学法合并尿沉渣镜检法将为临床提供更可靠的诊断依据.     

活化小胶质细胞移植后损伤脊髓内TGF-β1 mRNA、蛋白的表达及意义

目的 探讨活化小胶质细胞移植后脊髓组织内TGF-β1mRNA和蛋白表达及意义.方法 应用改良Allen法制造Wistar大鼠脊髓损伤模型,将活化小胶质细胞移植到脊髓损伤模型,测定脊髓组织内TGF-β1mRNA和蛋白表达.结果 各时相点对照组TGF-β1mRNA及其蛋白表达量明显低于移植组(P<0.01).结论 活化小胶质细胞移植后,可以上调损伤脊髓表达TGF-β1;脊髓内TGF-β1蛋白的高表达可能对脊髓损伤修复起促进作用;活化的小胶质细胞可能是TGF-β1的主要来源.     

具有靶向免疫抑制作用新型重组融合蛋白B7-2-PE40KDEL真核表达载体的构建及其生物效应

目的:构建B7-2-PE40KDEL的真核表达载体,探讨通过体内表达重组融合蛋白,特异性杀伤高表达CD28 T细胞,阻断B7∶CD28/CTLA4共刺激信号途径诱导免疫耐受的可能性.方法:以原核表达载体pRSETA-B7-2-PE40KDEL质粒为模板,采用PCR及酶切连接的方法构建真核表达载体pcDNA3.1/Zeo( )-B7-2-PE40KDEL.利用RT-PCR、Western 印迹及ELISA法从mRNA、蛋白质水平检测了B7-2-PE40KDEL在RPE-CHO真核细胞中的表达情况.采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28 T细胞的生物活性进行测定.结果:成功构建了pcDNA3.1/Zeo( )-B7-2-PE40KDEL真核表达载体,转染入RPE-CHO细胞后可转录翻译为重组融合毒素蛋白,相对分子质量约为71×103,平均106个转染细胞24 h表达0.23 μg/L.活性测定显示真核载体所表达的B7-2-PE40KDEL可特异性地抑制高表达CD28的人T淋巴细胞系,而对CD28阴性的人白血病细胞系的抑制率较低.结论:真核载体表达的B7-2-PE40KDEL具有良好的靶向性免疫抑制活性,为进一步开展其体内特异性防治移植排斥反应及自身免疫性疾病奠定了基础.     

甲状腺功能试验指南

本文的内容是论述目前使用的甲状腺功能试验,并指出其各自的优点和应用限度。 一、常用的甲状腺试验: (一)总T_4试验(TT_4): 1.特异T_4(T_4):①T_4-CPB(竞争性蛋白结合法)。测定血清甲状腺素总浓度。②T_4-RIA(放射免疫测定)。测定血清甲状腺素总浓度。 2.PBI,PEI,T_4柱测量被认为是甲状腺素的碘的含量(蛋白结合碘),因为常被有机碘污染,故这些试验现已被T_4-CPB和T_4-RIA试验所代替。 (二)树脂摄取试验(RT_3U):此试验是间接地测定未饱和的或游离的甲状腺素结合蛋白位点的试验。它的用途是参与估计游离甲状腺素指数。此试验并不能测定血清T_3,因此不能把它与T_3测定试验相混同。     

鼻咽癌组织~(18)F-FDG摄取与Glut-1和VEGF表达关系研究

目的: 探讨鼻咽癌的18F-FDG摄取与肿瘤组织葡萄糖易化扩散转运蛋白及血管内皮细胞生长因子表达的关系.材料和方法:对40例鼻咽癌患者进行正电子发射体层显像(PET)检查,测定肿瘤最大摄取值(SUVmax);应用标准链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶亲和(SP)免疫组化法检测40例患者肿瘤组织葡萄糖易化扩散转运蛋白1(Glut-1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达.结果:40例鼻咽癌组织的SUVmax为9.45±1.87;40例鼻咽癌组织Glut-1阳性细胞率为45.18%,VEGF染色阳性细胞率为60.8%;鼻咽癌组织18F-FDG摄取(SUVmax)与Glut-1表达阳性率分级相关(r=0.369,P=0.019),鼻咽癌组织18F-FDG摄取(SUVmax)与VEGF表达阳性率分级相关(r=0.460,P=0.03).结论:鼻咽癌组织18F-FDG摄取与Glut-1和VEGF过度表达相关.