丙型肝炎病毒非编码区ABC程序酶切分型研究

目的为进一步了解中国是否存在HCV 3b基因及1a、2b和6a基因型感染，建立HCV 5′端非编码区(5′ NCR)不同基因型的基因库。方法分型方法按ABC程序进行，A应用BHH′(BsrBⅠ、HaeⅡ、HinfⅠ)复介内切酶消化5′NCR cDNA，可将不同基因型划分为5组：1a、1b，6a，2a、2b，3a，3b、4a。B应用BstU Ⅰ内切酶鉴别1a、1b。C应用Hae Ⅲ内切酶鉴别2a、2b、3b、4a及6a。电泳检测片段大小。结果(1)la、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a 8种基因型参比品的ABC分型结果表明，该8种基因型获得良好的分型效果。(2)93份HCV RNA阳性患者ABC分型结果表明，1b型感染率占66．67％，2a型18．28％，1b／2b型、3b型及2b型均为3．23％，2a／2b型和1b／2a型各为2．15％，1a型1．08％。结论结果表明应用HCV 5′-NCR ABC分型技术既保证了HCV RNA检测的灵敏度，又能完成1a-6a型中的8种基因型的鉴别。     

中国大陆新发现丙型肝炎病毒3'非编码区终止密码子变异

目的获得全长中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3'非编码区(3'UTR)cDNA,并分析一级结构的变异,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制和开发新的抗HCV药物奠定基础.方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400bp的cDNA片段,克隆测序.结果获得的全长1b型HCV 3'端序列,由高变区、Poly(u)区、Poly(u/c)区及98碱基区4部分组成;首次发现终止密码子突变由TGA突变为TGG,可导致NS5B的翻译不能及时终止.结论半套式RT-PCR法可有效获得病毒基因组的全长末端序列;首次报道终止密码子突变导致NS5B区延长,3'UTR缩短.该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义.     

中国大陆新发现丙型肝炎病毒3′非编码区终止密码子变异

目的获得全长中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3′非编码区(3′UTR)cDNA,并分析一级结构的变异,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制和开发新的抗HCV药物奠定基础。方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400bp的cDNA片段,克隆测序。结果获得的全长1b型HCV3′端序列,由高变区、Poly(u)区、Poly(u/c)区及98碱基区4部分组成;首次发现终止密码子突变由TGA突变为TGG,可导致NS5B的翻译不能及时终止。结论半套式RT-PCR法可有效获得病毒基因组的全长末端序列;首次报道终止密码子突变导致NS5B区延长,3′UTR缩短。该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义。     

HCV基因分型试剂临床应用评价

目的运用直接测序法和丙型肝炎病毒(HCV)基因分型试剂盒两种方法,诊断HCV基因型并比对它们的结果,以评价HCV基因分型试剂盒的临床使用效果。方法选取购买的2套商业HCV基因型血清盘和收集的45份HCV核糖核酸(RNA)阳性临床样本,用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增HCV CORE区、NS5B区,对扩增的序列进行测序以确定基因型别;再通过HCV基因分型试剂盒检测样本以确定基因型,对所得结果进行统计分析。结果 HCV NS5B区、CORE区检测商业HCV基因型血清盘,分别检测出16例(16/19)、15例(15/19);对于HCV基因分型试剂盒检测中国常见的五种型别1b、2a、3a、3b、6a的样本,HCV基因分型试剂盒的准确性为7/7。45份HCV RNA阳性的临床样本中,所检测出的基因型有1a(4份)、1b(6份)、2a(5份)、3a(5份)、3b(14份)、6a(7份)、6n(4份),测序法结果属于五种亚型(1b、2a、3a、3b、6a)的有37份标本,试剂盒检测的结果与测序法一致的有29份,8份标本未检出,一致率为29/37。五种亚型以外的8份标本,测序法与试剂盒检测结果均不一致。结论通过此次对比结果可以看出,所用HCV基因分型试剂盒能够准确检测出国内常见的基因型,并且该方法操作简便,检测时间短,具有较大的临床应用价值。     

丙型肝炎病毒1b型NS3基因扩增方案的改进

目的优化扩增武汉地区HCV1b型患者HCV非结构蛋白3(NS3)的cDNA,并进行测序。方法从患者血清中提取HCVRNA,采用型特异性引物扩增分型法检测HCV患者基因分型。设计3对外侧引物和3对内侧引物,采用套式PCR技术(方案一)分别扩增HCV1b型患者的HCVNS33个区段,然后用3对内侧引物进行测序。为了优化NS3扩增和测序效果和减少操作繁琐,对引物进行改进,设计1对外侧引物和1对内侧引物,采用改进的套式PCR技术(方案二)直接扩增HCV1b型患者的HCVNS3区,然后用3个正向引物和1个逆向引物进行测序。结果改进的套式PCR技术(方案二)与套式PCR技术(方案一)相比,操作较为简单,而且扩增效率增高,扩增效果较好。结论采用改进的套式PCR技术(方案二)扩增和测序HCVNS3区更迅速、有效、实用。     

抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13 蛋白的上调基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5ATP13蛋白反式激活靶基因。方法 以HCV NS5ATP13表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5ATPl3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HCV-NS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个白色克隆，进行菌落PCR分析，其中96个均得到100～1000bp插入片段。挑取40个插入片段测序分析，其中2个cDNA片段为未知序列，通过生物信息学分析获得其全长序列，已被GenBank收录，另有34个为已知功能序列。结论成功筛选出2个新的cDNA序列，并获得其全长序列，可能为HCV NS5ATPl3蛋白反式激活相关靶基因。     

肝炎病毒诊断分型寡核苷酸芯片的制备与应用

目的研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸（Oligo）芯片，并进行系列优化及临床应用性研究。方法从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列，HDV及HCV4个基因型全长cDNA序列，根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列，以作为设计Oligo探针的备选序列。用Array designer 3．0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针。Oligo探针合成和纯化后，用芯片打印仪固定在玻片上。为便于研究，先后制备了2种芯片，包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片。采用限制性显示PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4．0的探针，选取高特异的探针制备了HBV、HDV、HCV联合诊断分型芯片。结果从杂交效果来看，研制的Oligo芯片特异性较高，可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型。为了适应临床诊断的要求，对芯片进行了实验条件摸索和一些优化，均取得较好的效果。结论制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳，具有较为广阔的应用前景，为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备。     

太原地区丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义

目的了解本地区HCV基因型分布,探讨HCV基因分型的临床意义。方法用RT-nested-PCR方法扩增62例丙型肝炎患者血清HCV5’ UTR区,限制性内切酶HaeⅢ、Bsh1236Ⅰ进行双酶切得到不同长度基因片段,分析结果,确定基因型。结果62例丙型肝炎患者中,其中1b型43例,2a型9例,1b/2a混合型5例,1a型1例,3a型1例,未分型3例。基因1b型患者肝功能、肝脏脂肪变性均较非1b型严重。结论本地区丙型肝炎以基因1b型为主,且该型患者临床病情较其它型严重。     

长春地区出入境人员感染丙型肝炎病毒的基因分型研究

目的研究长春地区出入境人员感染丙型肝炎病毒(HCV)的基因型分布。方法收集42例丙型肝炎阳性者的血清标本,采用基因测序法进行HCV基因型检测和分析。结果 42份HCV阳性血清基因分型分别为1b、1a、2a,其中基因1型21份(占50%),1b亚型13份(占30.95%),1a亚型8份,2a亚型9份。HCV基因型性别、年龄分布差异无统计学意义(P0.05)。结论长春地区出入境人员感染的HCV以1b型为主,2a型次之。     

2018-2019年红河州HIV/HCV合并感染者HCV基因型分析

目的 了解红河州HIV/HCV合并感染者中HCV的基因型分布。方法 收集2018-2019年红河州HIV/HCV抗体阳性的血浆246份,进行HCV病毒载量检测,对有病毒载量的样品E1E2区和N55B区采用巢氏PCR扩增,扩增产物经基因序列测定,所得序列通过构建系统进化树确定HCV的分子亚型。结果 结合2个基因片段,最终120份样品获得了分型结果。3b为主要亚型,占30.8%(37/120),其他亚型按照比例依次为3a(21.7%,26/120)、6a(17.5%,21/120)、6n(16.7%,20/120)、其他亚型（13.3%,16/120）。各HCV亚型在民族分布上的差异有统计学意义（P<0.05）。分别计算各亚型在E1E2区和NS5B区的基因距离,结果显示在3a、3b、6a、1b、6n这5种亚型中,3a的基因距离最大,且3a、6a、1b、6n的基因距离均与3b的基因距离有显著性差异（P<0.05）。结论 在红河州HIV/HCV合并感染者中,3b是主要流行亚型,且在该人群中有较长的流行时间。     

HCV和HIV-1合并感染标本中HCV基因分型

目的了解丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）和人类免疫缺陷病毒Ｉ型（ＨＩＶ－１）混合感染标本中ＨＣＶ基因型情况。方法采用了根据ＨＣＶ５′端非转译区基因组所设计的反相探针杂交测定方法（ＩＮＮＯＬｉＰＡ，ＨＣＶⅡ），对来自六个地区的１７份抗－ＨＣＶ和抗－ＨＩＶ－１双阳性标本进行ＨＣＶ基因型分型研究。结果在１７份标本中，７份（４１．１８％）为Ｉ（１ｂ）型病毒，５份（２９．４１％）为Ⅱ（２ａ／２ｃ）型病毒，５份（２９．４１％）为Ｉ型（１ｂ）和Ⅱ（２ａ／２ｃ）混合型病毒。结论发现ＨＣＶ与ＨＩＶ－１合并感染标本中存在Ｉ（１ｂ）型、Ⅱ（２ａ／２ｃ）型以及Ｉ（１ｂ）型与Ⅱ（２ａ／２ｃ）型混合型ＨＣＶ。值得注意的是对α－干扰素治疗不敏感并且较易趋于导致严重的慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的Ⅱ型ＨＣＶ感染的比率占７０．５８％（１２／１７）。     

丙型肝炎病毒与其合并人类免疫缺陷病毒感染者的病毒基因型差异

HCV与HIV具有相似的传播途径,都可以通过使用污染的血制品、注射用具、性接触及母婴传播,因此,HIV与HCV混合感染较常见.HIV感染改变HCV的自然病程,加速肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌的进程已达成共识;HCV基因型对肝病的进程和预后亦起到重要作用.那么HCV基因型的分布在HⅣ/HCV混合感染与HCV单纯感染之间是否存在差异?各自的感染途径有何不同?值得我们作进一步的探讨.我们对昆明市第三人民医院收治的昆明地区85例HCV感染住院患者采用PCR等分子生物学方法研究了HIV/HCV感染与HCV单纯感染患者HCV基因型分布的差异.     

特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒的体外消化作用

目的研究特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒（HCV）的体外消化作用。方法设计3个分别作用于HCV RNA 5＇非编码区（5＇ NCR）上157、168、173位点的脱氧核酶（DRz），分别命名为DRz1，DRz2,DRz3，均以5＇GGCTAGCTACAACGA-3’为脱氧核酶的催化活性中心，用内切酶XbaⅠ将含有HCV病毒序列的质粒pCMV/T7 NCRC,△Luc消化成线性，以此为模板体外转录出用α-^32PIUTP进行标记的靶HCV RNA。在37℃,PH7.5，Mg^2 10mmol/L等条件下，将HCV RNA（10nmol/L）与3个脱氧核酶（1μmol/L）分别混合进行切割反应，并进一步比较不同Mg^2浓度下DRz3的切割反应效率，反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影，应用凝胶成像分析仪评价脱氧核酶的切割效率。结果在设定反应条件下，3个脱氧核酶对HCV病毒均有切割活性，随着Mg^2浓度的增加，DRz3的切割活性增强，结论特异性脱氧核酶可有效切割HCV RNA 5＇NCR的RNA，且切割效率与Mg^2浓度呈正相关。     

HCV core-antigen assay as an alternative to HCV RNA quantification: A correlation study for the assessment of HCV viremia

Introduction

Detection of hepatitis C virus (HCV) RNA and the HCV core antigen assay (HCV-Ag) are reliable techniques for the diagnosis of active and chronic HCV infection. Our aim was to evaluate the HCV-Ag assay as an alternative to quantification of HVC RNA.

Effects of HCV proteins in current HCV transgenic models

Hepatits C virus (HCV) is an enveloped virus with positive‐sense single‐stranded RNA genome that causes both acute and persistent infections associated with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma, which needs fully functional human hepatocytes for its development. Due to the strict human tropism of HCV, only human and higher primates such as chimpanzees have been receptive to HCV infection and development, cognition about pathophysiololgy and host immune responses of HCV infection is limited by lacking of simple laboratory models of infection for a long time. During the past decade, gene transfer approaches have been helpful to the understanding of the molecular basis of human disease. Transgenic cell lines, chimeric and transgenic animal models were developed and had been demonstrated their invaluable benefits. This review focuses on the existing HCV transgenic models and summarize the relative results about probable pathophysical changes induced by HCV proteins.     

Seroprevalence of HBV/HCV coinfection among patients with HCV screened during the national campaign for HCV eradication in Egypt

Background and study aimsLittle is known about the true prevalence of hepatitis B virus (HBV) coinfection in patients with hepatitis C virus (HCV). This multicenter nationwide study aimed to assess the seroprevalence of HBV among Egyptian patients with HCV and its possible risk factors.Patients and methodsThis is a cross-sectional, multicenter, nationwide study. Data were extracted from the National Network of Viral Hepatitis Treatment Centers database. Baseline data of patients proved to be viremic during the national campaign for HCV eradication (October 2018–April 2019) were retrieved. Data included demographics, laboratory tests (HBsAg, CBC, liver biochemical profile, creatinine, AFP, HbA1c, and viral load), FIB-4 score calculation, and abdominal ultrasound results.ResultsResults of 297,965 patients showed that HBsAg was positive in 2,347 (0.8%) patients. Patients with HBV/HCV were 57% females and had a mean age of 51 ± 13 years. Patients with positive HBsAg showed significantly more tobacco consumption, intravenous drug abuse, hypertension, and diabetes. No significant difference was noted in HCV viremia between patients with HCV and those with HBV/HCV. Only 14% of patients with HBV/HCV had cirrhosis compared with the 9% of those with HCV; two of them had HCC.ConclusionAlthough Egypt has a heavy HCV burden, the overall prevalence of HBV is low among patients with HCV infection. Comorbid conditions seem to favor coinfection.     

中国东北丙型肝炎病毒感染基因特征及人群易感性分析

采用微板核酸杂交-ELISA法及基因芯片技术对5 79例HCV感染者的HCV基因型以及30例HCV感染者以及30例健康人HLA -DRB1等位基因分布情况进行分析,探讨中国东北丙型肝炎病毒(HCV)感染基因型特征及丙型肝炎病毒感染的人群易感性。5. 79例患者中Ⅳ/ 2b型HCV感染率最高,为5 1 .12 % ;约34 .72 %的HCV感染者ALT持续正常;Ⅱ/ 1b型和混合型HCV感染在ALT反复升高组中的感染率明显高于ALT持续正常组(P <0 .0 5 )。Ⅰ型和Ⅲ型HCV合并HBV感染的发生率较高,混合型HCV合并HBV感染的发生率较低,与单独感染比较差异显著(P <0 .0 5 ) ;混合型HCV感染主要见于有2次或2次以上输血史者。HLA -DRB1 0 4和DRB1 13在HCV感染者中的出现频率较高,与健康对照组相比差异显著(P <0. 0 5 )。因此,中国东北地区HCV感染以Ⅳ/ 2b型为主,约34 72 %的HCV感染者不表现出肝炎的症状,可能成为重要的传染源。Ⅱ/ 1b型和混合型HCV感染更容易导致肝细胞损伤。Ⅰ/ 1a型和Ⅲ/ 2a型HCV可能更易于同HBV共存,两种或两种以上基因型共存的HCV则不易于同HBV合并感染。反复接受血液或血制品可能是出现混合型HCV感染的主要原因。HLA -DRB1 0 4和DRB1 13等位基因可能与HCV的人群易感性有关。