中枢神经损伤后GAP-43蛋白对神经再生及轴突导向作用及其机制的研究进展

神经环路的重建是中枢神经损伤修复的关键,这一过程主要涉及2个关键因素：轴突再生的能力及再生轴突的靶向延伸,所以围绕以上两方面具体作用机制的研究大量开展。近年来,一种主要参与轴突生长以及突触重构的关键蛋白--生长相关蛋白43（GAP-43）成为了研究中枢神经损伤修复机制的热点。本文作者就GAP-43蛋白在神经损伤修复领域内的作用进行简要综述。
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神经营养因子在糖尿病心脏神经病变中的研究概述

心脏自主神经病变是糖尿病的严重并发症之一,神经营养因子,如神经生长因子(NGF)、生长相关蛋白43(GAP-43)和睫状神经营养因子(CNTF)等异常表达可造成心脏支配神经的营养和功能障碍,也是糖尿病心脏神经病变的病理机制之一。NGF或CNTF的表达异常可造成交感神经、迷走神经和感觉神经对心脏的支配功能异常,并与糖尿病时心脏自主神经重构有关。而GAP-43表达增加表明心脏神经损伤后出现再生。研究糖尿病时神经营养因子的变化趋势,并对其进行有效干预可以防治糖尿病心脏神经病变,为开发治疗糖尿病心脏神经病变的药物或技术提供新的线索和依据。     

实验性糖尿病大鼠坐骨神经损伤后神经再生微环境变化

目的观察实验性糖尿病大鼠在坐骨神经挤压伤后神经生长相关蛋白的表达水平;探讨神经元分子微环境变化对神经再生修复的重要意义。方法制作实验性糖尿病大鼠模型,在此基础上制作双侧坐骨神经挤压伤模型。观察神经挤压损伤后7、14、21和28d大鼠背根神经节TUNEL标记阳性细胞百分比变化;利用免疫组化和蛋白印迹技术(Western-blot),观察神经生长相关蛋白(GAP-43)和神经生长因子受体(trkA)表达水平变化。结果实验性糖尿病大鼠坐骨神经损伤后,所有时程背根神经节细胞均有较多的TUNEL标记细胞,但以14～21d显著;各时程背根神经节细胞GAP-43和trkA蛋白均有一定水平的表达,但其表达水平低于非糖尿病组。结论实验性糖尿病大鼠坐骨神经背根神经节存在凋亡应激,其神经再生相关基因表达体系不完整,对神经损伤的再生修复能力下降。     

Nav1.7、Nav1.8和交感芽生在大鼠SNI模型神经病理性疼痛形成过程中的作用

目的 探讨部分神经损伤(spared nerve injury,SNI)致神经病理性疼痛过程中背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)内Nav1.7、Nav1.8以及交感神经芽生之间的关系。方法 将实验大鼠随机分为对照组(Control组,n=18)和手术组(SNI组,n=18),于术后第3、7、14、21天测机械痛阈(mechanical withdrawal threshold,MWT),于术后7天和21天取术侧腰段DRG,分别检测Nav1.7、Nav1.8、生长相关蛋白43(growth-associated protein 43,GAP43)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的mRNA表达及蛋白含量,并且进行荧光染色。结果 与对照组相比,SNI组MWT降低,且呈时间依赖性。SNI术后7天DRG中Nav1.7、Nav1.8、GAP43和TH的mRNA表达和蛋白含量同步增加。免疫荧光半定量发现Nav1.7、Nav1.8、GAP43在SNI术后21天中大直径神经元异常表达增多。TH与Nav1.7、Nav1.8阳性神经元周围形成篮状结构。结论 坐骨神经损伤后DRG内中、大型神经元的交感神经芽生及篮状结构与其Nav1.7、Nav1.8同步增加有关。这一现象可能是神经病理性疼痛异常形成的因素之一。     

激肽释放酶结合蛋白对大鼠视神经不完全损伤后视网膜神经细胞的保护作用及轴突再生的研究

目的 探讨激肽释放酶结合蛋白(KBP)是否对体内视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存在保护和促进其轴突再生的作用.方法 在距SD大鼠视神经球侧端0.5～1.0mm的地方夹持视神经,造成大鼠视神经不完全性损伤;在大鼠视神经损伤的模型中,行玻璃体腔分别注入KBP作为实验组和PBS为对照组;分别于损伤后7d,14d和21d取材,HE染色观察视网膜结构、测量视网膜厚度及RGCs的存活数量;提取术眼视神经行蛋白免疫印迹.根据统计学分析结果,明确KBP是否有视网膜神经节细胞保护和促进其轴突再生作用.结果 ①大鼠不完全视神经损伤模型建立成功.②通过HE染色,我们观察了视网膜各层结构变化,通过双肓法计数RGCs,和视网膜厚度测量,经统计学分析,组间差异具有统计学意义.③对神经再生的标记蛋白GAP-43进行Western-blot,统计学分析,组间GAP-43表达差异具有统计学意义.结论 ①KBP对视神经损伤后的RGCs具有保护作用.②KBP在视神经损伤后可能促进了视神经的轴突再生.     

PSD-95在神经损伤后表达作用的研究进展

神经损伤后严重影响了患者生活质量,神经损伤后的修复问题一直以来都是热点与难点。近年来研究发现N-甲基-D-天冬氨酸受体/突触后致密蛋白95/神经元型一氧化氮合酶(NMDAR/PSD-95/nNOS)复合物在神经损伤后的修复及神经病理性疼痛中扮演着重要的角色。回顾近年来国内外诸多对NMDAR/PSD-95/nNOS在神经修复中的研究,现对其可能存在的机制进行综述。     

Nogo-A基因敲除鼠视神经损伤后修复的实验研究

目的评价Nogo—A基因在视神经损伤后修复机制中的作用。方法Nogo-A基因敲除联合视神经损伤鼠为实验组（20只）,C57BL／6小鼠联合视神经损伤作为对照组（20只）。制备视网膜、视神经冰冻切片,采用免疫荧光技术检测视网膜神经节细胞和视神经中生长相关蛋白（GAP）43的表达。进行视网膜神经节细胞体外培养,进行GAP-43染色,采用图像分析系统计算细胞轴突长度。结果视神经中GAP-43表达：夹伤后1、3、7d对照组中表达少量GAP-43,实验组中GAP-43表达明显高于对照组（t=2．12,3．56、2．63,均P〈0．01）。GAP-43抗体染色可见着色在体外培养RGC轴突,实验组3d有较长轴突生长,对照组3d有较短轴突生长。RGC于培养1、3及7d,经自动图像分析系统处理,得出细胞突起长度,实验组突起长度明显高于对照组（F=41．36、31．23,均P〈0．01）。结论Nogo—A基因在抑制视神经损伤后轴突再生机制中起重要作用。     

麻黄碱促进脑缺血大鼠运动功能康复的细胞及分子机制

目的:研究麻黄碱加速大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型运动功能康复的细胞和分子机制. 方法: 雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组、自然康复组和治疗组. 应用线栓法建立单侧MCAO模型. 术后1,2,3,4 wk电镜检测缺血周围区组织损伤及新生突触形成情况,RT-PCR检测缺血周围区生长相关蛋白(GAP-43), 突触素(SYP)表达的变化. 结果: 治疗组神经损伤程度轻,新生突触较自然康复组多;RT-PCR显示治疗组GAP-43和SYP的表达水平高于自然康复组(P＜0.01). 结论: 增加缺血周围区新生突触形成,在基因水平上促进GAP-43及SYP的表达增高是麻黄碱促进神经康复的机制之一.     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经电生理学以及损伤脊髓GAP-43蛋白表达的变化

目的：研究大鼠脊髓损伤后不同时间点坐骨神经兴奋阈值、动作电位（AP）幅度和传导速度,以及损伤脊髓GAP-43蛋白表达的改变。方法：采用改良的Allen′s重物坠落致大鼠脊髓损伤实验模型、电生理学和免疫组织化学染色。结果：大鼠SCI后1、3、7d时,坐骨神经兴奋阈值升高,AP幅度和传导速度降低,呈时间依赖性改变;SCI后14d,AP产生阈值、幅度和传导速度较SCI第7d有所恢复。正常大鼠脊髓灰质神经元的胞浆和轴突中有少量GAP-43蛋白表达;SCI后第1、3、5、7d时损伤脊髓周围区灰质GAP-43蛋白表达逐渐增强;在SCI后第14d其阳性表达开始减弱。结论：大鼠SCI后能够导致坐骨神经电生理学兴奋性和传导性的降低,以及神经结构重构蛋白GAP-43表达增加。     

硫化氢对糖尿病大鼠心肌纤维化及基质金属蛋白酶7 和缝隙连接蛋白43 表达的影响

目的 探讨硫化氢（H2S）对糖尿病大鼠心肌纤维化及基质金属蛋白酶7（MMP-7）和缝隙连接蛋白43（Cx43) 表达的影响。方法 将52 只SD 大鼠随机分为4 组,每组13 只：糖尿病模型组（STZ组）,硫化氢干预模型组（STZ+H2S 组）,硫化氢干预正常组（H2S 组）,正常对照组（Control 组）。予以链脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）处理STZ 组和STZ+H2S,复制糖尿病大鼠模型,复制成功后,每天予以硫氢化钠NaHS 溶液（100μmol/kg）处理STZ+H2S 组与H2S 组,予以等量生理盐水对Control 组行腹腔注射,8 周后将大鼠处死。VG 染色观察4 组大鼠心肌组织病理学改变,Western blot 检测IV 型胶原蛋白、MMP-7、Cx43蛋白的表达。结果 STZ 组与Control 组相比,STZ 大鼠心肌细胞排列紊乱明显,细胞间胶原沉积增加,心室肌组织中Ⅳ型胶原蛋白及MMP-7 蛋白表达增加（P <0.05）,而Cx43 蛋白表达降低（P <0.05）;STZ+H2S 组与STZ 组相比,STZ+H2S 组心肌细胞排列紊乱有所改善,细胞间胶原沉积减少,心室肌组织中Ⅳ型胶原蛋白及MMP-7 蛋白表达也减少（P <0.05）,Cx43 蛋白表达上调（P <0.05）。结论 H2S 可改善糖尿病大鼠心肌纤维化,其机制可能与通过调控MMP-7 上调Cx43 蛋白表达有关。     

Cx43基因启动子甲基化下调乳腺癌Cx43的表达

目的：探讨乳腺癌细胞中Cx43蛋白的表达与基因启动子甲基化的关系。方法：免疫组化检测乳腺标本中Cx43蛋白的表达,甲基化PCR检测Cx43启动子甲基化的频度。5-氮杂脱氧胞苷培养乳腺癌MD-MBA-231细胞后,RT-PCR乳腺癌细胞中Cx43 mRNA,免疫组化、Western Blot检测Cx43蛋白表达,甲基化PCR检测启动子甲基化的变化。结果：与正常乳腺组织相比,乳腺癌中Cx43蛋白的表达下调,启动子甲基化频度高。在应用5-Aza-dC处理前,MD-MBA-231 Cx43基因呈甲基化状态,经4.0μmol/L的5-Aza-dC作用48h后,乳腺癌细胞Cx43基因甲基化逆转,Cx43基因mRNA及蛋白表达增加。结论：Cx43在乳腺癌组织中表达下调可能与启动子甲基化有关。5-Aza-dC能逆转乳腺癌细胞MD-MBA-231的Cx43基因异常甲基化,促进Cx43基因的再表达。     

坐骨神经损伤对局部淋巴结形态学影响的研究

目的:通过研究坐骨神经损伤对局部淋巴结组织形态学的影响,探讨周围神经损伤对局部免疫反应的作用。方法:建立小鼠右侧坐骨神经损伤模型,在术后1、2、4、8周观察坐骨神经损伤后下肢腘窝淋巴结组织的形态学变化;荧光显微镜检测局部淋巴结组织IgG表达变化;透射电子显微镜观察其超微结构变化。结果:神经损伤后各组局部淋巴结组织中淋巴窦内出现较多的浆细胞;免疫组化结果表明局部淋巴结IgG阳性细胞明显增加,其数量在第2、4周与正常组和假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05);神经损伤后各组局部淋巴结的超微结构中出现较多巨噬细胞与树突状细胞,可见浆细胞成堆出现,胞浆内粗面内质网增生并呈囊样扩张,以术后1周最明显。结论:周围神经损伤后可以引发局部淋巴器官的形态学改变。     

不同浓度不溶性镍化物与人肺癌A549细胞内Cap43、HIF-1α关系的研究

目的 探讨不同浓度不溶性镍化物对人肺癌A549细胞内钙激活蛋白43(Cap43)、缺氧诱导因子lα(HIF-1α)的影响.方法 用不同浓度的水不溶性二硫化三镍(Ni3S2)处理人肺癌A549细胞,24 h后用间接免疫荧光法观察染毒后细胞内Cap43与HIF-1α蛋白表达的变化.结果 通过细胞免疫荧光法发现,随着处理物浓度的增加,细胞内Cap43、HIF-1α蛋白含量均增加.结论 不溶性镍化物可以诱导人肺癌A549细胞内Cap43、HIF-1α蛋白含量的增加.     

缝隙连接蛋白43在急性局灶性脑缺血大鼠心室肌中的表达

目的检测缝隙连接蛋白43（Connexin43,Cx43）在大鼠急性局灶性脑缺血模型心室肌中的表达,以探讨其与脑缺血后心律失常的关系。方法用线栓法建立大鼠右侧局灶性脑缺血模型,检测心电,观察心肌细胞电镜下的亚显微结构,用Western blot的方法,检测心室肌中Cx43表达的改变。结果电镜结果显示脑缺血后,心肌组织闰盘内桥粒和缝隙连接结构及分布改变。Western blot结果显示,缺血后2 h心室肌中Cx43的表达明显降低,分布紊乱。缺血后24 h,1 w心室肌中Cx43的表达随时间延长而增加,且均高于正常对照组。结论大鼠右侧局灶性脑缺血所引起的心律失常可能与心室肌Cx43蛋白表达和分布异常有关。     

维甲酸对睾丸癌细胞缝隙连接蛋白Cx43表达及其功能的影响

目的 探讨维甲酸对睾丸癌细胞缝隙连接蛋白（Cx43）表达及其功能的影响。方法 体外培养的睾丸癌I-10细胞分别予2.5、5.0、10.0 μmol/L维甲酸处理24 h,Western blot法检测I-10细胞Cx43蛋白表达,细胞免疫荧光法观察细胞膜表面Cx43蛋白分布的改变,细胞接种荧光示踪法检测细胞荧光传递功能的变化。结果 Western blot结果显示,与对照组比较,维甲酸2.5、5.0、10.0 μmol/L可增加I-10细胞中Cx43蛋白表达(P<0.05),其增强率分别为43.14%±2.1%、58.09%±1.8%、143.13%±1.6%;细胞免疫荧光法结果显示,维甲酸2.5、5.0、10.0 μmol/L可显著增加I-10细胞膜表面Cx43蛋白的表达;细胞接种荧光示踪法结果显示,与对照组比较,维甲酸2.5、5.0、10.0 μmol/L可增强I-10细胞间荧光传递功能(P<0.01),增强率分别为26.1%±2.3%、63.3%±1.6%、140.5%±3.4%。结论 维甲酸可通过增加I-10细胞Cx43蛋白的表达来增强细胞间的缝隙连接功能。     

管内段视神经损伤后视网膜的形态学改变

目的 观察管内段视神经损伤后视网膜的病理变化,比较视神经管减压术和激素对管内段视神经损伤的作用。方法 建立兔管内段视神经损伤的动物模型,利用免疫组织化学、图像分析等技术,观察神经损伤后,经视神经管减压术、地塞米松、视神经管减压术＋地塞米松治疗14d后,视网膜的形态学改变及GAP-43的表达。结果 视神经损伤1d后,RGCs平均记数轻度下降;损伤3,5,7d时,RGCs数分别为对照组的84.48%,72.23%,57.46%;14d时,节细胞仅有15.43%存活。损伤后3d,视网膜切片中可见GAP-43表达阳性的细胞;伤后5d阳性细胞增多;伤后7d阳性细胞数和积分光密度值达最高峰;伤后14d阳性细胞数下降。经手术减压、激素治疗、激素＋手术治疗后,RGCs存活率分别为36.01%,32.78%,56.98%.结论 管内段视神经损伤后RGCs出现渐进性退变,数量逐渐减少;视神经管减压术和激素对管内段视神经损伤有一定的治疗作用,其疗效明显优于采用单一方法。     

Connexin43蛋白对耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬的抑制作用

目的探讨缝隙连接蛋白（Cx43）蛋白对耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬的作用。方法免疫印迹法检测Cx43蛋白在睾 丸癌I-10细胞与耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞中的表达水平;实验分为转染试剂对照组（Mock 组）、阴性对照组（NC组）、过表达 组（mCx43 组）,过表达（mCx43）Cx43 基因后,通过免疫印迹法检测Cx43 蛋白确定转染效率,自噬相关蛋白LC3 和p62 水平。 mCherry-GFP-LC3B转染法和透射电镜分析Cx43基因过表达后耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬水平。结果与I-10细胞相 比,I-10/DDP细胞中Cx43的表达量明显降低（P<0.01）;过表达Cx43基因后,与NC组相比,mCx43组中自噬相关蛋白LC3-II表 达降低（P<0.01）,p62表达升高（P<0.05）。使用mCherry-GFP-LC3B转染法和透射电镜观察自噬水平,与NC组相比,mCx43组 中细胞自噬体数量降低。结论Cx43抑制耐顺铂睾丸癌I-10/DDP细胞自噬。     

磁刺激对小鼠原代海马神经元突触素、生长相关蛋白及脑源性神经营养因子表达的影响

目的观察磁刺激对原代海马神经元形态及突触素(SYN)、生长相关蛋白43(GAP43)、脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响,探讨磁刺激对突触可塑性的影响及可能机制。方法原代海马神经元随机分为对照组、假刺激组及40%(1Hz,0.76T)、60%(1Hz,1.14T)、80%(1Hz,1.52T)最大磁刺激输出强度组,各刺激组自细胞接种后第2～6天接受磁刺激,连续5d;假刺激组置于相同磁场装置环境,但不接受磁刺激。各组细胞于第7天相同时间取材。采用扫描电镜、细胞免疫荧光法、蛋白质印迹及RT-PCR等方法观察神经元形态变化及SYN、GAP43与BDNF蛋白、mRNA的表达。结果 40%强度组神经元突起长度增长、胞间神经联系增多,SYN免疫反应性、BDNF免疫反应性及蛋白表达均高于对照组(P<0.05,P<0.01),GAP43免疫反应性及蛋白水平未见明显升高,SYN、GAP43与BDNF mRNA表达量高于对照组(P<0.05);60%强度组突起长度与数量增加(P<0.01)、交织成密集网络,SYN、GAP43与BDNF免疫反应性、蛋白及mRNA表达量均高于对照组(P<0.01);80%强度组突起数目、长度增加,同时有细胞损伤现象,GAP43免疫反应性、BDNF免疫反应性及蛋白水平高于对照组(P<0.05,P<0.01),SYN免疫反应性及蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义,SYN、GAP43及BDNF mRNA表达增加(P<0.05,P<0.01)。结论磁刺激通过促进原代海马神经元BDNF的合成或分泌,上调SYN、GAP43的表达,影响神经元形态,可能在调控突触可塑性、促进神经网络构建方面发挥重要作用;不同磁刺激参数刺激效果不同。     

GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

目的 构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pull down方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用.方法 以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌B.21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用.结果 酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMPI融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMPI融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用.结论 获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用.     

四肢被渔船网绳绞扎致伤的诊治

目的：探讨四肢被渔船网绳绞扎伤的特点及诊治方法。方法：对86例四肢被渔船网绳绞扎伤的患者进行诊治，其中无血管，神经损伤43例；有血管、神经损伤43例。结果：86例中，1例死亡，9例Ⅰ期截肢，1例Ⅱ型截肢，85例经处理后伤口愈合出院。结论：四肢被渔船网绳绞扎伤，血管、神经损伤发生率高，血管，神经损伤平面与绞扎伤平面不一致，截肢率高。