细胞因子诱导的杀伤细胞体外逆转K562/ADR细胞株多药耐药性观察

目的：研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）体外逆转K562／ADR细胞株多药耐药（MDR）的可行性。方法：在含细胞因子（人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人重组白细胞介素-1、人重组白细胞介素-4和人重组肿瘤坏死因子-α）的RPMI1640完全培养液中诱导K562细胞株、K562／ADR耐药细胞株分化成树突状细胞（DC）。正常人外周血单个核细胞（PBMC）在上述细胞因子诱导下培养成CIK，与成熟的DC共培养成CIK＋K562／ADR-DC。应用流式细胞术检测CIK及CIK＋K562／ADR—DC的细胞表型。MTT法测定CIK和K562／ADR-DC对K562／ADR的细胞毒作用，流式细胞仪检测CIK组和CIK＋K562／ADR-DC组细胞中糖蛋白（P-gP）、阿霉素（ADR）的含量，RT-PCR检测mdr-1基因表达。结果：C1K、C1K＋K562／ADR-DC细胞经流式细胞仪检测，均具有自己独特的表型。PBMC诱导培养4d后，CIK开始增殖，第7—9天细胞数量明显增多。K562／ADR来源的DC和CIK共培养后，细胞增殖速度明显加快，9d以后与C1K相比2组细胞的增殖速度呈现明显差异。CIK＋K562／ADR．DC细胞对K562／ADR的细胞毒作用在效靶比20：1范围内明显高于CIK细胞（P〈0．05）。CIK组和CIK＋K562／ADR-DC组细胞的P-gP和Mdr-1与对照组相比显著降低（P〈0．05），ADR表达明显升高。结论：CIK＋K562／ADR．DC对高表达P-gP的K562／ADR耐药细胞株表现出了特异性细胞毒作用，有效提高了细胞内ADR的含量，下调了P-gP蛋白和mdr-1基因的表达。从而使免疫效应细胞体外逆转MDR的效果得以显现。     

DC-CIK细胞对K562/ADR细胞多药耐药的逆转作用

目的 探讨共培养树突状细胞(dendritic cell,DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK),即DC-CIK逆转白血病细胞多药耐药的作用及相关机制.方法 采用RT-PCR方法检测DC-CIK处理后的耐药细胞株(K562/ADR细胞)中多药耐药基因(mdr1基因)的表达;利用MTT法检测DC-CIK细胞处理后的耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化.结果 经DC-CIK作用后的K562/ADR细胞mdr1表达明显低于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞组(P<0.05),而且其对阿霉素的敏感性也明显高于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞(P<0.05).结论 DC-CIK可逆转耐药细胞的多药耐药,其作用机制可能与下调耐药细胞中mdr1的表达有关.     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/A02耐药的机制

目的:研究汉防己甲素（TTD）对白血病细胞株K562/A02多药耐药(MDR)逆转的机理。方法：以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为TTD作用的靶细胞。细胞水平检测实验分5组（K562组、K562/A02组、K562+ADM组、K562/A02+ADM组和K562/A02+TTD+ADM组）,采用MTT法检测TTD对K562和K562/A02细胞的非细胞毒性剂量,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADM)的浓度,基因、酶学、蛋白水平检测实验分3组（K562组、K562/A02组和K562/A02+TTD组）,采用RT-PCR法检测mdr1 mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）和拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）的表达水平,Western-blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）和bcl-2表达。结果：1.562 5 mg•L^-1的TTD处理K562/A02细胞后,细胞内ADM的浓度较单用ADM组明显提高（P<0.01）;与空白对照组比较,K562/A02细胞内mdr1 mRNA/P-gp的表达量减少（P<0.01）;GST-π和TopoⅡ表达无明显变化;凋亡抑制基因bcl-2的表达量减少（P<0.01）。结论:TTD主要通过增加细胞内ADM浓度,下调mdr1/P-gp和bcl-2表达逆转耐药。     

地西他滨逆转K562/ADR细胞株多药耐药性机理初步探讨

目的探讨地西他滨（Decitabine,DCA）体外逆转耐阿霉素（ADR）的K562细胞株（K562/ADR）多药耐药性（Multi-drug resistance,MDR）的机理。方法设实验组为不同浓度的DCA与不同浓度的ADR联合作用于K562/ADR细胞;同时设对照组1为不同浓度的DCA作用的K562/ADR细胞组,对照组2为不同浓度的ADR作用的K562/ADR细胞组。检测各组对K562/ADR细胞杀伤活性、细胞膜P-糖蛋白（P-glycoproteins,P-gp）含量以及靶细胞凋亡情况等。结果实验组对K562/ADR细胞杀伤活性高于两个对照组（P〈0.05）;且随DCA浓度增大,杀伤活性增大（P〈0.05）;随所加入的ADR浓度增大,杀伤活性差异无统计学意义（P〉0.05）。实验组和仅经DCA作用对照组1的P-gp含量均下降,P-gp含量随DCA浓度增大,下降明显（P〈0.05）;而随所加入的ADR浓度增大,下降无统计学意义（P〉0.05）。流式细胞仪凋亡实验提示DCA诱导靶细胞的凋亡;DCA与ADR联合应用,部分靶细胞凋亡同时可见部分靶细胞死亡。结论通过DCA与ADR的联合应用,降低了K562/ADR细胞的胞内P-gp表达、增强了ADR对靶细胞的杀伤活性,为解决白血病MDR和联合化疗提供理论依据。     

细胞因子诱导的杀伤细胞降低乳腺癌耐药细胞系对阿霉素的耐受效应

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced k iller, CIK)与化疗药物对多药耐药(multidrug resistance, MDR)肿瘤细胞产生协同杀伤效应的机制.方法:用细胞培养法加细胞因子在体外诱导并扩增CIK细胞,应用MTT法测定CIK细胞、阿霉素及二者联合对靶细胞的杀伤活性,用流式细胞术检测靶细胞上P糖蛋白(P-gp) 的表达和细胞内药物积累,用细胞免疫组化方法检测P-gp在MDR靶细胞MCF7adr内的分布.结果:CIK细胞可使MCF7adr细胞P-gp的表达活性下降82.5%,耐药靶细胞内阿霉素积累增加3 .2倍,使联合杀伤率比单纯加阿霉素(同等剂量)组增加7.8倍,比单纯加CIK细胞(相同效靶比)组增加1.3倍.结论:CIK细胞可明显抑制MCF7adr肿瘤细胞系的P-gp表达,可协同阿霉素提高对MCF7adr肿瘤细胞系的杀伤活性.     

PDTC逆转K562/AO2细胞多药耐药性机制研究

目的研究核因子κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）逆转K562/AO2细胞耐药效应及其机制。方法采用MTT比色法分别检测K562/AO2细胞的耐药性、PDTC对K562/AO2细胞增殖的影响以及非细胞毒剂量PDTC、维拉帕米（Ver）预作用后K562/AO2细胞药物敏感性的变化,采用免疫细胞组织化学法、RT-PCR检测K562、K562/AO2细胞NF-κB、mdr-1 mRNA表达水平以及PDTC作用一定时间对其影响。结果①K562/AO2细胞对阿霉素（ADM）的耐药性是K562细胞的59倍;非细胞毒剂量PDTC预作用后,ADM对K562/AO2细胞的半数抑制浓度（IC50）显著降低,相对逆转耐药效率为93.03%,强于经典耐药逆转剂Ver的作用81.07%（P〈0.01）;②K562/AO2细胞NF-κB表达水平高于K562细胞（P〈0.01）;PDTC可有效抑制K562/AO2细胞NF-κB表达,伴随mdr-1 mRNA表达减少,呈时间依赖性。结论抑制NF-κB异常活化可部分逆转K562/AO细胞耐药性,其机制与mdr-1 mRNA转录表达减少有关。     

青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素耐药性机理的研究

目的:研究青蒿琥酯逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性及其作用机制。方法:以对阿霉素敏感的K562细胞作为对照,用MTT法观察在有或无阿霉素存在条件下青蒿琥酯对培养的K562/A02细胞干预48 h后的生长抑制情况,流式细胞仪检测100μg.m l-1青蒿琥酯作用48 h前后K562/A02细胞P糖蛋白(P-gp)平均荧光强度(MFI)的强弱,生化方法检测100μg.m l-1青蒿琥酯作用48 h前后K562/A02细胞内谷胱甘肽(GSH)的含量。结果:(1)在不含阿霉素情况下,青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞的IC50分别为13.80μg.m l-1和13.62μg.m l-1(P>0.05),在阿霉素存在情况下,青蒿琥酯对K562/A02细胞抑制作用明显增加(P<0.01);(2)与K562细胞P-gp的表达相比,K562/A02细胞P-gp高表达,青蒿琥酯处理前后K562/A02细胞的MFI无差别(P>0.05);(3)青蒿琥酯处理后K562/A02细胞内GSH含量较处理前明显下降(P<0.05)。结论:青蒿琥酯对K562及K562/A02细胞具有细胞毒作用,且可逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药,其机制可能是通过干扰细胞内GSH-GSH-s-转移酶系统功能的发挥,而非对P-gp表达的影响。     

环孢素A对K562/DOX细胞药物积累和外排的影响

目的 研究环孢素A(cyclosporin A,CsA)对K562/DOX细胞多药耐药的逆转作用.方法 以 CsA作为耐药逆转剂,用MTT法和流式细胞仪观察CsA对多药耐药白血病细胞株K562/DOX的药物敏感性、细胞内药物积聚和外排的影响.结果 CsA能剂量相关性地增加阿霉素(doxorubicin,DOX)K562/DOX细胞内的累积,明显抑制P-gp介导的DOX外排,显著增强阿霉素对K562/DOX细胞的细胞毒作用.但对K562细胞药物敏感性、细胞内药物外排和积聚均无影响.结论 CsA能有效地减慢K562/DOX细胞内DOX外排速度,增加细胞内DOX积聚.     

选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398下调K562/ADM细胞MDR1/P-gp表达

目的 探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对白血病多药耐药K562/ADM细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法 以细胞K562/ADM为NS-398作用的靶细胞,MTT法检测细胞增殖活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因(MDRl)mRNA的表达;流式细胞仪(FCM)测定P-gp蛋白表达水平.结果 NS-398显著抑制K562/ADM细胞增殖,呈时间、剂量正相关效应;下调K562/ADM细胞MDRl基因表达并抑制P-gp合成,呈明显的剂量依赖关系.结论 COX-2抑制剂NS-398可在一定时间和剂量范围抑制白血病多药耐药K562/ADM细胞MDRl/P-gp表达,并能抑制K562/ADM多药耐药细胞增值.     

甲孕酮联合苦参碱对耐药细胞株K562/AO2多药耐药逆转作用的研究

目的应用甲孕酮(MPA)联合苦参碱(MAT)逆转人白血病细胞株K562/AO2对阿霉素的耐药性,观察联合用药逆转耐药的疗效。方法用MTT法检测MPA与MAT的细胞毒性,荧光分光光度法检测各组细胞内药物(ADM)浓度的改变,流式细胞仪测定细胞凋亡的情况,流式细胞术检测细胞的p-gp表达情况。结果(1)确定了甲孕酮及苦参碱对K562/AO2细胞的非细胞毒性剂量和低细胞毒性剂量,确定了非细胞毒性剂量的两药联合应用后未出现毒性叠加。(2)在与ADM合用时,K562/AO2+甲孕酮及K562/AO2+苦参碱组,细胞凋亡百分率均高于K562/AO2耐药组(P<0.05,P<0.01),但均低于K562/AO2+甲孕酮+苦参碱组(P<0.01,P<0.05)。(3)与K562比较,K562/AO2细胞中P-gP呈高表达;与K562/AO2耐药组比较,K562/AO2十苦参碱组及K562/AO2+甲孕酮组P-gp表达量降低(P<0.01),但当两者联合应用时作用大于两者单独作用。(4)与ADM组比较苦参碱、甲孕酮均能提高K562/AO2细胞内ADM浓度,P均<0.01,两者联合应用时作用大于两者单独作用。结论非细胞毒性剂量的...     

DCIK细胞特异性抗肿瘤生物学活性研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)分别与两种冻融抗原致敏DC细胞共培养后获得的DC细胞诱导的特异性肿瘤杀伤细胞(dendritic cell induced killer.DCIK)的增殖活性及其对K562、Namalwa细胞株的杀伤活性。方法采集健康供者的外周血单个核细胞(PMNC),先诱导培养CIK细胞及两组DC细胞(K562-DC和Namalwa-DC),然后将两组DC细胞分别和CIK细胞按1∶10的比例分别混合培养,并以CIK细胞单独培养组为对照。计数细胞扩增倍数,并于共培养6d MTT法测定各组细胞对K562、Namalwa细胞杀伤活性。结果两组DCIK细胞增殖速度明显快于单纯CIK细胞组(P0.05);共培养6d,相同的效靶比情况下,两组DCIK细胞对两种肿瘤细胞的杀伤活性都比单纯CIK细胞明显增强,而用相应肿瘤抗原致敏得到的DCIK细胞对该种肿瘤细胞的杀伤活性最强。结论 DCIK细胞的增殖能力、抗肿瘤活性均高于CIK细胞,致敏的DCIK细胞对相同肿瘤靶细胞有杀伤特异性。     

脉冲磁场对多药耐药细胞K562/ADR的逆转作用

目的:研究脉冲磁场(PMF)对多药耐药(MDR)肿瘤细胞K562/ADR的逆转作用及机制。方法:MTT法测定敏感株K562/S和耐药株K562/ADR对多柔比星(ADR)的IC50,观察PMF对肿瘤细胞增殖的影响。测定不同频率PMF照射的K562/ADR耐药细胞株对ADR的IC50,分析PMF的逆转效果。用流式细胞术(FCM)检测细胞内ADR的浓度。结果:K562/ADR细胞的耐药倍数为29.36,PMF对耐药株肿瘤细胞增殖无影响。相同磁场强度、不同频率的PMF对耐药株K562/ADR的IC50影响不同,在相同的时间里,70 Hz的PMF影响作用最明显。70 HzPMF处理的K562/ADR细胞中药物浓度高于对照组。结论:PMF可通过提高细胞内的药物浓度,对肿瘤细胞K562/ADR的MDR具有逆转作用;逆转作用的大小与脉冲磁场的频率有关,低频率的PMF比高频率的PMF的逆转效果更明显。     

DC-CIK与CIK体外抗肿瘤作用的实验研究

目的探讨树突状细胞（Dc）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养后对白血病细胞株K562、淋巴瘤细胞株Raji、肺癌细胞株A549、胃癌细胞株BOG-803的杀伤作用。方法采集健康志愿者外周血50mL,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,分别用不同的细胞因子诱导,培养D0细胞与CIK细胞。然后将成熟的DC和CIK细胞混合培养,用流式细胞仪检测两组细胞中。D3＋CD56＋、CD3＋CD8＋T细胞的比例;用MTT法检测其对K562、P-ajj、A549、BCG-803细胞株的杀伤活性。结果DC-CIK组较CIK组具有较高的CD3＋CD56＋、CD3＋CD8＋T细胞比例（p〈0．05）;DC—GIK、GIK对K562、Pajj、A549、BCG-803细胞株均具有较强的杀伤作用,且随着效靶比的增加,杀伤活性逐渐增加;DC—CIK的杀伤活性较CIK明显增高（P〈0．05）。结论DC—CIK共培养体外可增强对肿瘤细胞的杀伤作用,为肿瘤的临床治疗提供了理论和实验依据。     

人参皂苷Rg1联合阿霉素对K562/ADR细胞增殖及耐药的影响

目的 探究人参皂苷Rg1对人慢性髓细胞白血病耐阿霉素(adriamycin, ADR)细胞K562/ADR增殖的影响及其对K562/ADR细胞的耐药逆转作用。方法 CCK-8法检测不同浓度的人参皂苷Rg1对K562/ADR细胞增殖的影响;CCK-8法检测人参皂苷Rg1与ADR联用对K562/ADR细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC₅₀)和逆转倍数;集落形成实验检测人参皂苷Rg1联合ADR对K562/ADR细胞集落形成能力的影响;流式细胞术检测人参皂苷Rg1联合ADR对K562/ADR细胞周期的影响。结果 与对照组相比,各浓度和作用时间的人参皂苷Rg1均可抑制K562/ADR细胞增殖(P<0.001),当人参皂苷Rg1浓度为120μg/mL,作用时间为48 h时,细胞增殖抑制率最高(P<0.05);与单用ADR相比,人参皂苷Rg1联合ADR作用48 h后,K562/ADR细胞IC₅₀值明显下降(P<0.05),人参皂苷Rg1对K562/ADR细胞的耐药逆转倍数为2.34;与对照组和ADR或人参皂苷Rg1单药作用相比,人参皂...     

槲皮素逆转柔红霉素在耐药细胞株K562/ADR内的异常分布

目的 研究槲皮素处理前后柔红霉素(DNR)在耐药细胞株K562／ADR亚细胞结构的不同分布。方法 利用蒽环类抗生素固有的荧光，通过共聚焦激光扫描显微镜观察槲皮素作用后DNR在耐药细胞株K562／ADR内亚细胞结构分布的改变。结果 与DNR在敏感细胞株K562／S细胞核、胞浆均匀分布不同，在K562/ADR细胞，DNR主要集中在核周及周边胞浆，核内DNR荧光很少；经槲皮素处理后，可恢复DNR在K562／ADR内细胞核、胞浆中的弥漫分布。结论 DNR在耐药细胞中的异常分布与肿瘤细胞耐药的形成有关，槲皮素能逆转DNR的这种异常分布。     

Expression of histone H2AX phosphorylation and its potential to modulate adriamycin resistance in K562/A02 cell line

DNA repair processes play a role in the development of drug resistance which represents a huge obstacle to leukemia chemotherapy. Histone H2AX phosphorylation (ser139) (γH2AX) occurs rapidly at the onset of DNA double strand break (DSB) and is critical to the regulation of DSB repair. If DNA repair is successful, cells exposed to anti-neoplastic drugs will keep entering the cycle and develop resistance to the drugs. In this study, we investigated whether γH2AX can be used as an indicator of tumor chemosensitivity and a potential target for enhancing chemotherapy. K562 and multi-drug resistant cell line K562/A02 were exposed to adriamycin (ADR) and γH2AX formed. Flow cytometry revealed that percentage of cells expressing γH2AX was increased in a dose-dependent manner and the percentage of K562/A02 cells was lower than that of K562 cells when treated with the same concentration of ADR. In order to test the potential of γH2AX to reverse drug resistance, K562/A02 cells were treated with PI3K inhibitor LY294002. It was found that LY249002 decreased ADR-induced γH2AX expression and increased the sensitivity of K562/A02 cells to ADR. Additionally, the single-cell gel electrophoresis assay and the Western blotting showed that LY249002 enhanced DSBs and decreased the expression of repair factor BRCA1. These results illustrate chemosensitivity can partly be measured by detecting γH2AX and drug resistance can be reversed by inhibiting γH2AX.     

细胞因子诱导杀伤细胞与抗原特异性细胞因子诱导杀伤细胞杀伤肿瘤效应比较的实验研究

目的：制备具有抗原特异杀伤活性的效应细胞。方法：反复冻融法提取肿瘤可溶性抗原，甲基噻唑基四唑（methyl thiazoly terrazolium,MTT)法检测效应细胞杀伤活性。结果：经树突状细胞（dendritic cell,DC)摄取肿瘤细胞抗原，并提呈给细胞因子诱导杀伤（cytokine induced killer,CIK)细胞所获得的DC－A－CIK细胞对同一种肿瘤靶细胞的杀伤活性，较CIK细胞、未摄取抗原的DC－CIK细胞及摄取不相同肿瘤抗原的DC－A不相同－CIK细胞具有更高的杀伤活性。结论：摄取肿瘤可溶性抗原的DC细胞可明显提高CIK细胞对相同肿瘤靶细胞的杀伤特性性和杀伤活性。     

冬凌草甲素诱导多药耐药细胞系K562／A02凋亡,逆转耐药性？…

目的：探讨冬凌草甲素诱导多药耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２凋亡、逆转耐药性的作用。方法：以不同浓度的冬凌草甲素处理Ｋ５６２／Ａ０２及敏感株Ｋ５６２／Ｓ细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色法检测半数抑制率（ＩＣ５０）,分析冬凌草甲素对两种细胞柔红霉素（ＤＮＲ）、高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）敏感性的影响,流式细胞仪检测冬凌草甲素对两种细胞内ＤＮＲ浓度的影响。结果：冬凌草甲素可诱导两种细胞     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL杀伤K562细胞体外实验研究

目的 研究体外负载K562细胞冻融抗原的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的特异性杀伤作用。方法 联合应用细胞因子从外周血单个核细胞（PBMC）诱导培养出DC,在体外负载K562细胞冻融抗原。采用乳酸脱氢酶释放法,对比K562冻融抗原致敏DC组、未致敏DC组、淋巴细胞组、前列腺癌PC3冻融抗原致敏DC组分别激活的CTL对K562细胞的杀伤作用。结果 培养出具有典型特征的DC;在效靶比为10：1及20：1时。K562冻融抗原致敏DC组诱导的CTL对K562细胞的杀伤率分别为55．9％土22．0％、90．2％＋24．8％,均高于其他3组（p,0．05）。结论 K562细胞冻融抗原致敏DC可诱导激活CTL,具有明显杀伤K562细胞作用。并具有特异性。