大鼠脑皮质微血管内皮细胞的原代培养和鉴定

目的 分离、培养、鉴定大脑皮质微血管内皮细胞(brain microvaseular endothelial cells,BMECs),旨在建立一种可以有效获取较高纯度和产量的BMECs的方法.方法 取出生3～5 dSD大鼠,采用匀浆、二次酶消化、梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于明胶包被的培养板中进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞的形态学特性,细胞免疫荧光化学染色检测血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原的表达,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线.结果 培养6～7 d细胞呈典型的短梭形、多角形和“鹅卵石”样.微血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,纯度达(96.70±1.53)％.细胞在6～8 d达到生长高峰.结论 成功地分离培养出了高纯度的BMECs,为进一步研究BMECs的生物学特性奠定了基础.     

大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法

目的建立一种简便可靠的脑微血管内皮细胞的培养方法.方法新生SD乳鼠脑皮质经匀浆、过滤、消化和差速贴壁等方法对大鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养及传代培养,对培养的细胞进行形态学观察,并用Ⅷ因子相关抗原进行免疫细胞化学鉴定.结果培养的细胞呈单层贴壁生长,约7～9d后呈典型的"铺路石"征象,免疫细胞化学鉴定证实为内皮细胞.结论此种脑微血管内皮细胞培养方法的建立为体外研究脑血管疾病提供了可靠的手段.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

兔脑微血管内皮细胞的培养及鉴定

目的：建立简便、有效的兔脑微血管内皮细胞体外原代培养方法。方法：兔脑皮质通过匀浆、过筛分离处理后接种，原代培养兔脑微血管内皮细胞，并通过Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色和透射电镜观察鉴定。结果：培养的细胞呈典型的“铺路石”状生长，Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性。结论：该方法可方便获取较纯净的脑微血管内皮细胞。     

前列腺毛细血管内皮细胞屏障功能研究

目的 分离培养大鼠前列腺毛细血管内皮细胞,体外研究大鼠前列腺毛细血管内皮细胞的屏障功能.方法 采用细胞生长特性选择法分离培养大鼠前列腺毛细血管内皮细胞,用第Ⅷ因子相关抗原抗体对分离培养的前列腺毛细血管内皮细胞进行免疫学鉴定.免疫组化观察毛细血管内皮细胞之间紧密连接蛋白claudin-1的表达,采用跨膜电阻测量仪检测毛细血管内皮细胞的跨膜电阻,用酚红渗漏实验检测其通透性,以大鼠肺毛细血管内皮细胞、脑毛细血管内皮细胞作为阴性与阳性对照.结果 成功分离大鼠前列腺毛细血管内皮细胞,体外培养可以形成紧密的单层细胞结构,呈铺路石样生长.第Ⅷ因子相关抗原抗体的免疫荧光结果显示:分离培养的大鼠前列腺毛细血管内皮细胞胞浆表达绿色荧光,提示分离的细胞为毛细血管内皮细胞;免疫组化结果显示紧密连接蛋白claudin-1在相邻的毛细血管内皮细胞之间表达;体外培养的大鼠前列腺毛细血管内皮细胞,阴性对照组肺毛细血管内皮细胞,阳性对照组脑毛细血管内皮细胞的跨膜电阻峰值分别可以达到(142.2 ±3.1)、(43.3±3.5)、(248.2±6.2)Ω/cm2,并稳定保持2～3d,三者比较差异有统计学意义(P＜0.05).酚红渗漏实验结果显示前列腺毛细血管内皮细胞、阳性对照组脑毛细血管内皮细胞随着细胞单层跨膜电阻的增加,基底侧的酚红浓度减低,阴性对照组肺毛细血管内皮细胞酚红渗透量随跨膜电阻的改变变化趋势不明显.结论 大鼠前列腺毛细血管内皮细胞与脑毛细血管内皮细胞等屏障内皮相比拥有相似的结构功能,体外培养的大鼠前列腺毛细血管内皮细胞具有屏障特性,可以作为血前列腺屏障研究的体外模型.     

体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞的若干问题

目的 建立一种程序简便、经济、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的方法。方法 以SD大鼠为实验材料，采用两步滤过法获得微血管段，胶原酶消化，低分子右旋糖苷密度离心获得BMECs，接种后4h换液使获得的细胞纯化。倒置显微镜下观察细胞的形态，细胞Ⅷ因子相关抗原(ⅦF-Ag)免疫细胞化学法鉴定细胞及其纯度，通过碱性磷酸酶(AKP)的表达来分析BMECs被微动脉和微静脉污染的程度，通过测定BMECs分泌ET-1的量，鉴定培养的BMECs活力。结果 经分离培养获得的BMECs在倒置显微镜下呈多角形或“铺路石”形，单层贴壁生长。培养的细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化试验阳性，细胞纯度为90％。AKP染色阳性细胞百分比为93％，总积分112。原代培养内皮细胞的ET-1含量为388．03pg／ml，传代后为591．75pg／ml。结论 采用两步滤过法获得脑微血管段，胶原酶消化，低分子量右旋糖苷密度离心可分离和培养大鼠BMECs。该方法较其他方法程序简单，获得细胞纯度高。     

原代大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法优化

目的 探讨大鼠心肌微血管内皮细胞体外培养方法的改良。方法 采用机械剥除,差速游离等措施进行植块法原代培养,胰蛋白酶差速消化和差速贴壁传代以去除杂细胞,并应用倒置相差显微镜和SABC试剂盒对细胞进行形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果 镜下细胞呈短梭形或鹅卵石状生长;Ⅷ因子、CD34相关抗原免疫细胞化学染色鉴定均阳性;该细胞在普通明胶上部分区域可形成管腔样或血管网络状结构。结论 本方法可获得纯度高,结构和功能良好的心肌微血管内皮细胞。     

大鼠骨髓EPC的体外培养和生物学特性鉴定

目的 体外培养、诱导大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC),观察EPC的生长特性,并进行鉴定.方法 冲洗大鼠长骨骨髓,用密度梯度离心法收集单个核细胞层,观察细胞在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导体系下生长情况并与未诱导组比较,对培养细胞进行免疫细胞化学检测.于培养3、7、14天采用流式细胞仪检测CD133 /Flk-1 双标记阳性细胞百分率.结果 贴壁细胞呈现团簇样生长、线样排列特殊形态.免疫细胞化学检测贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、Ⅷ因子(vWF)呈阳性表达.流式细胞检测结果显示,各个时间点诱导组CD133 /Flk-1 双标记阳性细胞百分率明显高于未诱导组(P＜0.01).结论 用密度梯度离心法在bFGF培养体系下可以获得较高纯度的EPC,该细胞具有内皮细胞的特性,经过体外诱导可以分化为内皮细胞.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

组织块法培养大鼠肺微血管内皮细胞的综合鉴定

目的 为组织块法培养的大鼠肺微血管内皮细胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells,RPMVECs)建立合理可靠的多指标综合鉴定方案.方法 采用外周肺组织贴块法培养RPMVECs,抽取组织块进行切片观察,以大鼠肺动脉平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞为对照,对培养细胞进行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定,通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构.结果 组织切片显示组织块源于外周肺组织,CD34免疫细胞化学染色阳性,植物凝集素BSI结合试验阳性,而Ⅷ因子相关抗原染色阴性,透射电镜未见Weibel-Palade小体.结论 Ⅷ因子相关抗原和Weibel-Palade小体并非RPMVECs鉴定的理想指标,联合应用外周肺组织切片、CD34和植物凝集素BSI三指标为组织块法培养的RPMVECs提供了一个简单易行、合理、可靠的综合鉴定方案.     

Primary Culture of Mouse Cerebral Micovascular Endothelial Cell and its Biological Behaviour Study

目的 建立一种简捷易行的小鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,并观察其在IL-1β刺激下PGE2分泌情况.方法 通过对以往文献报道方法的改进,使用“二次过筛法”成功培养小鼠脑微血管内皮细胞,并用免疫细胞化学法检测其Ⅷ因子相关抗原的表达情况,鉴定血管内皮细胞的纯度.使用ELISA法检测其在IL-1β刺激下PGE2的分泌情况.结果 该法培养的细胞具备小鼠脑微血管内皮细胞的形态,可见细胞融合,95％以上的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性.且其PGE2的分泌与IL-1β的刺激呈现良好的时效、量效线性关系.结论 该法能简捷地培养小鼠脑微血管内皮细胞,所培养细胞保留有分泌PGE2的生物学行为,可用于脑血管疾病相关研究.     

人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性

目的:体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞,研究其基本生物学特性.方法:利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞,再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞,观察细胞生长特性,通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定.结果:原代培养后细胞贴壁生长,7～10 d形成集落或融合呈卵石形,免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR-2, Ⅷ/vWF 阳性,透射电镜显示细胞内具有特征性的W-P小体.结论:用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞,该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征,可以进一步分化为血管内皮细胞,是理想的组织工程种子细胞.     

一种简易稳定的乳小鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法

目的 寻找一种简单并稳定的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法.方法 采用两次酶消化法及4℃梯度离心法获得细胞,光镜和电镜下观察细胞形态,用检测Ⅷ因子相关抗原等方法鉴定细胞.结果 光镜下细胞呈多角形或短梭形,岛屿样聚集,随细胞生长及不断融合而出现"漩涡状"、"铺路石"样排列.电镜下观察可见紧密连接结构.Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色阳性.结论 上述方法可获得纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞,为其原代培养提供了一种经济、简易、重复性好的操作方法,也为进一步的生理、生化、药理及体外血脑屏障或共培养等方面的研究提供了材料来源.     

豚鼠内耳微血管内皮细胞的跨细胞电阻

目的　研究豚鼠内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小。方法　①胶原酶消化法分离培养豚鼠内耳及脑微血管内皮细胞 ,免疫组化法进行鉴定 ;②建立起内皮细胞通透性的体外模型 ,研究该模型下内耳内皮细胞的跨细胞电阻 ,并与脑及肺内皮细胞进行比较。结果　①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,与肺内皮细胞株的形态一致 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应 ;②三种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻值呈动态变化过程 ,以 5× 10 4 cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,内耳、脑及肺三种内皮细胞的跨细胞电阻峰值大小分别为 (118 9± 18 5 )Ω cm2 ,(2 44 7± 46 9)Ω cm2 ,(4 6 6± 5 9)Ω cm( n =6) ,三者相差非常显著 (P <0 0 0 1)。结论　内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻峰值小于脑内皮而大于肺内皮细胞 ,证明了三者通透性的差别。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITC-BSI结合试验）。结果倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的 改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法 从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITCBSI结合试验）。结果 倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论 改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

培养人脐动脉内皮细胞的组织化学和免疫细胞化学的研究

用细胞化学方法研究了体外培养人脐动脉内皮细胞的Ｍｇ－ＡＴＰ酶及碱性磷酸酶活性，并与人脐带切片中血管内皮以及大鼠脑、心、肾及肝等切片中血管内皮有关酶相比较。同时，用免疫细胞化学方法检查了培养脐动脉内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原。结果显示∶（１）培养４８及７２ｈ的脐动脉内皮细胞、人脐带血管及大鼠脑、心、肾、肝血管内皮都呈Ｍｇ－ＡＴＰ酶阳性。（２）碱性磷酸酶在上述各标本的血管内皮均呈阴性反应。（３）培养的人脐动脉内皮细胞呈Ⅷ因子相关抗原阳性。以上结果提示∶（１）体外培养人脐动脉内皮细胞和体内重要器官血管内皮的功能有相似性，是一种较为理想的研究人类动脉血管内皮生理功能和疾病的细胞模型。（２）Ｍｇ－ＡＴＰ酶可作为脐血管内皮以及脑、心、肾、肝等器官血管内皮的标志酶之一。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。