大鼠脑微血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞在动脉粥样硬化的发病机制中发挥重要作用。本文通过胶原酶消化、密度梯度离心等技术建立一种程序简便、经济、稳定、获得细胞纯度较高的体外分离、长期培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的探索一种简便可行的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcells,BMECs)的培养方法,为研究BMECs在脑血管疾病中的重要作用提供技术支持.方法分离出生后1～4 d内的Wistar大鼠乳鼠大脑皮质,用植块法培养BMECs;用倒置显微镜观察BMECs的形态以及从皮质块细胞迁出的过程;通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光细胞化学法对培养细胞进行鉴定.结果大脑皮质块植块法培养的大鼠BMECs呈单层贴壁生长,细胞形态以长梭形、多角形、三角形、四边形为主,呈典型的"铺路石"样征象,第3代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达95%以上.结论植块法具有经济、简便、要求条件不高,可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞的优点.     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法

目的建立一种简便可靠的脑微血管内皮细胞的培养方法.方法新生SD乳鼠脑皮质经匀浆、过滤、消化和差速贴壁等方法对大鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养及传代培养,对培养的细胞进行形态学观察,并用Ⅷ因子相关抗原进行免疫细胞化学鉴定.结果培养的细胞呈单层贴壁生长,约7～9d后呈典型的"铺路石"征象,免疫细胞化学鉴定证实为内皮细胞.结论此种脑微血管内皮细胞培养方法的建立为体外研究脑血管疾病提供了可靠的手段.     

大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养方法研究

目的探讨大鼠心脏微血管内皮细胞的原代培养技术,以获取纯化的大鼠心脏微血管内皮细胞。方法应用体质量80 g的雄性Wistar大鼠左心室的微血管内皮细胞进行原代培养并传代培养;通过倒置显微镜扫描观察其形态,同时对培养细胞采用免疫组织化学荧光染色法进行内皮表面因子(vWF)鉴定,并用Hoechst染色,于荧光倒置显微镜下观察。结果体外培养的大鼠微血管内皮细胞呈梭形,形成单层后呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列。采用Hoechst染色后,可见90%以上的细胞胞浆和核膜周围被染成红色,细胞核呈蓝色荧光;merge 3染色见细胞胞浆和核膜周围被染成黑色,细胞核呈蓝色;cy-3染色见细胞胞浆和核膜周围被激发出红色光。证明培养细胞为血管内皮细胞。结论通过改进的微血管内皮细胞分离方法培养获得的细胞,生长状态良好、纯度高,且能够稳定地传代培养。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的原代培养和鉴定

目的 分离、培养、鉴定大脑皮质微血管内皮细胞(brain microvaseular endothelial cells,BMECs),旨在建立一种可以有效获取较高纯度和产量的BMECs的方法.方法 取出生3～5 dSD大鼠,采用匀浆、二次酶消化、梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于明胶包被的培养板中进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞的形态学特性,细胞免疫荧光化学染色检测血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原的表达,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线.结果 培养6～7 d细胞呈典型的短梭形、多角形和“鹅卵石”样.微血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性,纯度达(96.70±1.53)％.细胞在6～8 d达到生长高峰.结论 成功地分离培养出了高纯度的BMECs,为进一步研究BMECs的生物学特性奠定了基础.     

体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞的若干问题

目的 建立一种程序简便、经济、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的方法。方法 以SD大鼠为实验材料，采用两步滤过法获得微血管段，胶原酶消化，低分子右旋糖苷密度离心获得BMECs，接种后4h换液使获得的细胞纯化。倒置显微镜下观察细胞的形态，细胞Ⅷ因子相关抗原(ⅦF-Ag)免疫细胞化学法鉴定细胞及其纯度，通过碱性磷酸酶(AKP)的表达来分析BMECs被微动脉和微静脉污染的程度，通过测定BMECs分泌ET-1的量，鉴定培养的BMECs活力。结果 经分离培养获得的BMECs在倒置显微镜下呈多角形或“铺路石”形，单层贴壁生长。培养的细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化试验阳性，细胞纯度为90％。AKP染色阳性细胞百分比为93％，总积分112。原代培养内皮细胞的ET-1含量为388．03pg／ml，传代后为591．75pg／ml。结论 采用两步滤过法获得脑微血管段，胶原酶消化，低分子量右旋糖苷密度离心可分离和培养大鼠BMECs。该方法较其他方法程序简单，获得细胞纯度高。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的培养

目的：培养脑皮质微血管内皮细胞。方法：取1－5d Wistar乳鼠脑皮质，经不同孔径的筛网过滤后，用胶原酶振荡消化获得的血管内皮细胞进行培养，用Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定。结果：培养的细胞呈单层贴壁生长，7－9d呈典型的铺路卵石样征象。结论：建立了一种简便易行的培养脑皮质微血管内皮细胞的方法。     

人腹膜微血管内皮细胞的原代培养

目的 分离和培养人腹膜微血管内皮细胞.方法 取非炎症且非转移性肿瘤患者施行腹部外科手术的大网膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化,两次筛网过滤、离心等步骤获取人微血管段,接种24 h待内皮细胞从微血管段爬出贴壁后,去除微血管段获得内皮细胞进行传代培养.组织形态学观察及免疫组化法鉴定所培养的细胞.结果 运用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染被减至最少;组织形态学观察显示内皮细胞呈铺路石样生长,免疫组化鉴定表明Ⅷ因子阳性;证实所培养的细胞为人腹膜微血管内皮细胞,其纯度较高,生长状态良好.结论 实验成功分离和培养了人腹膜微血管内皮细胞,为体外研究腹膜透析的病理生理学改变,提供了细胞来源.     

人腹膜微血管内皮细胞的原代培养

目的分离和培养人腹膜微血管内皮细胞。方法取非炎症且非转移性肿瘤患者施行腹部外科手术的大网膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化,两次筛网过滤、离心等步骤获取人微血管段,接种24 h待内皮细胞从微血管段爬出贴壁后,去除微血管段获得内皮细胞进行传代培养。组织形态学观察及免疫组化法鉴定所培养的细胞。结果运用此法进行的原代培养,血细胞在换液和传代过程中被去除,成纤维细胞污染被减至最少;组织形态学观察显示内皮细胞呈铺路石样生长,免疫组化鉴定表明Ⅷ因子阳性;证实所培养的细胞为人腹膜微血管内皮细胞,其纯度较高,生长状态良好。结论实验成功分离和培养了人腹膜微血管内皮细胞,为体外研究腹膜透析的病理生理学改变,提供了细胞来源。     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

原代大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法优化

目的 探讨大鼠心肌微血管内皮细胞体外培养方法的改良。方法 采用机械剥除,差速游离等措施进行植块法原代培养,胰蛋白酶差速消化和差速贴壁传代以去除杂细胞,并应用倒置相差显微镜和SABC试剂盒对细胞进行形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果 镜下细胞呈短梭形或鹅卵石状生长;Ⅷ因子、CD34相关抗原免疫细胞化学染色鉴定均阳性;该细胞在普通明胶上部分区域可形成管腔样或血管网络状结构。结论 本方法可获得纯度高,结构和功能良好的心肌微血管内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。     

肺微血管内皮细胞培养的改进方法

将大鼠肺边缘 2mm组织剪下并剪成 1mm× 1mm× 1mm大小的组织块 ,使其紧紧贴附于玻片上 ,而后用含有 2 0 %新生牛血清、RPMI 16 40、H EPES、2 巯基乙醇、丙酮酸钠、谷氨酰胺、卡那霉素、碳酸氢钠培养液培养。结果 2 4h肺微血管内皮细胞游出 ,72h左右游出的内皮细胞可融合成片状并紧紧贴附于玻片上 ,经Ⅷ因子相关抗体间接免疫荧光染色呈阳性。该方法具有快速简单、经济、重复性好等优点。     

大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养及不同纯化方法的比较

目的 对脑微血管内皮细胞分离、培养方法进行探索性研究,并对目前常用的纯化方法进行比较.方法 首先采用两次酶消化、两次梯度离心法对大鼠脑血管内皮原代细胞进行分离,然后分别采用免疫磁珠和Thy1.1抗体杀伤法分别进行纯化.结果 采用两次酶消化、两次梯度离心法可以成功分离到脑微血管内皮细胞,磁珠纯化法可得到纯度高但是数量较少的细胞,Thy1.1抗体杀伤法可得到纯度及得率均较高的内皮细胞.结论 我们所摸索的方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养.     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的 改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法 从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITCBSI结合试验）。结果 倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论 改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITC-BSI结合试验）。结果倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

家兔脑微血管内皮细胞的原代培养及鉴定

目的：建立一种简便高效的家兔脑微血管内皮细胞原代培养方法,为开展脑血管疾病及相关研究提供重要的载体和工具细胞。方法：无菌条件下取家兔大脑皮质,经剪碎、过细胞筛网、牛血清白蛋白密度梯度离心、Ⅱ型胶原酶消化后接种培养;通过细胞形态学观察及血管形成实验鉴定所培养的细胞。结果：原代培养48 h后,有少量短梭形的内皮细胞从血管段周围爬出;72 h后,细胞以血管段为中心形成“岛屿样”“团簇状”的集落;4～5 d后细胞集落间相互融合成片,铺满皿底,呈典型的单层、鹅卵石样、镶嵌式排列。血管形成实验观察到所培养的目的细胞能够形成管腔样结构,结果显示为阳性。结论：该方法可成功分离培养出原代家兔脑微血管内皮细胞。