大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力的实验研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力与传代次数的关系。方法:用全骨髓培养法,分离骨髓间充质干细胞,加含有地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1甲基黄嘌呤、吲哚美辛诱导剂的培养液进行诱导,诱导第10天进行细胞形态学观察和油红O染色鉴定,并进行光密度值测定。结果:随着传代次数增加,油红O染色细胞计数值与光密度值均下降。结论:大鼠MSCs成脂能力随传代次数增加而降低。     

成人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

目的研究成人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）体外分化为血管内皮细胞的能力并探讨其诱导条件。方法分离成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs。所获细胞分4组进行诱导：组1、2以5×10^3／cm^2细胞密度接分别接种于含2％和15％胎牛血清的L—DMEM培养基；组3、4以5×10^4／cm^2细胞密度分别接种于上述两种血清浓度的培养基，各组细胞经血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）辅以牛脑提取物的诱导，对照组为正常传代培养的MSCs。在诱导的第14、21天分别测定表面分子CD34、VEGFR-2、CD31和Ⅶ因子相关抗原（factor Ⅷ—related antigen，又称von Willebrand factor，vWF）以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定，同时测定不同诱导条件下的细胞增殖指数（proliferation index，PI）。结果组3细胞经诱导后，内皮系表面分子CD34、VEGFR-2、CD31、vWF于第14天均有不同程度表达，分别为8．5％、12．0％、40．0％、30．0％．其中CD34、VEGFR-2在第21天表达上调，为15．5％、20．0％，余各诱导组细胞未表达上述表面分子；诱导后的组3细胞呈低增殖状态（PI值约为10．4％），在半固体培养基中还可形成血管腔样结构。结论从成人骨髓中分离培养的MSCs，在较高细胞接种密度和低增殖状态下，经VEGF、牛脑垂体提取物诱导后，可分化为血管内皮细胞，可作为治疗性血管生成及组织工程理想的种子细胞。     

诱导兔骨髓间充质干细胞成为内皮细胞

[目的] 研究骨髓间充质干细胞（mensenchymal stemcells，MSCs）向内皮细胞分化的可行性。[方法] 密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞行体外培养和连续传代，获得较纯的MSCs。采用第2代的MSCs，以血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行体外诱导，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，免疫荧光方法鉴定内皮细胞，并通过透射电镜观察内皮细胞特异性WP小体。[结果] 分化后的细胞在光镜下具有内皮细胞的形态学特征；免疫荧光染色证实实验组诱导后的细胞为内皮细胞。透射电镜显示诱导后细胞内出现内皮细胞特异性WP小体。【结论] 成体中的MSCs在一定诱导条件下可以表现内皮细胞样特征，是组织工程血管化理想的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs)分化为肉芽组织中血管内皮细胞的可能性。及其参与创面修复的可能机制。方法：抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离、纯化MSCs，体外培养扩增后，应用溴脱氧尿嘧啶（BrdU)标记技术标记细胞。于已抽取骨髓的小型香猪背部制作全层皮肤缺损创面，即刻以纤维蛋白胶为载体，将已标记的MSC回植到供体动物创面上。术后2、4、6、8、12周切取创面组织，行BrdU和因子Ⅷ（FⅧ）免疫组织化学染色，进行对比观察。结果：BrdU阳性的MSCs多聚集在创面肉芽组织中的小血管周围，且有个别血管内皮细胞也呈现BrdU 阳性。部分BrdU阳性的MSCs胞浆中亦有FⅧ表达。结论：创面愈合过程中，MSCs与肉芽组织中小血管的形成密切相关。在创面微环境下，MSCs可分化为血管内皮细胞，并参与创面修复。     

大鼠SERTOLI细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响

目的探索Sertoli细胞(SCs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂、成骨和成神经诱导分化的影响。方法密度梯度离心法分离BMSCs,二步酶消化法分离SCs;对第3、4代BMSCs进行成脂、成骨及成神经诱导,并与SCs共培养,观察其形态学变化。结果油红O染色显示BMSCs成脂诱导后,胞浆出现折光性强的脂滴,加入SCs后,脂滴明显减少,染色不明显;茜素红S染色显示BMSCs成骨诱导后可显示钙结节,加入SCs后,钙结节更多,结节内红染更明显;成神经诱导在加入SCs前后没有明显差异。结论 SCs可促进BMSCs成骨分化,而抑制其成脂分化,对成神经分化则没有明显影响。     

诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的体外研究

目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1，IGF-1）在诱导骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem ceils，MSCs）向软骨细胞分化过程中的相互作用，并研究细胞密度对MSCs向软骨细胞分化的影响。方法 取健康昆明种小白鼠骨髓，用全骨髓贴壁法筛选获得MSCs，体外培养传代。采用特定的诱导培养使MSCs向软骨细胞分化，按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为：TGF—β1＋IGF-1联合应用组（TGF—β1 10ng／ml、IGF-1 50ng／m1）；TGF—β1单独应用组（TGF—β1 10ng／m1）；IGF-1单独应用组（IGF-1 50ng／m1）；对照组不添加任何生长因子。TGF—β1＋IGF-1联合应用组于诱导14d和21d，分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双染法鉴定；于诱导7、14和21d各组分别提取诱导细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，检测TGF—β1、IGF-1对诱导细胞Ⅱ型胶原表达量的影响；比较MSCs在平板培养及细胞团培养时，Ⅱ型胶原表达量的差异。结果TGF—β1＋IGF-1联合应用组诱导培养14d，诱导软骨细胞甲苯胺蓝染色呈阳性，免疫荧光染色可见诱导软骨细胞的细胞外基质含有Ⅱ型胶原。各组基因扩增产物的凝胶电泳可见，TGF—β1＋IGF-1联合应用组和TGF—β1单独应用组Ⅱ型胶原扩增片段呈阳性；IGF-1单独应用组和对照组，未见Ⅱ型胶原扩增条带；凝胶成像系统灰度扫描示Ⅱ型胶原表达量TGF—β1＋IGF-1联合应用组各时间点均比TGF—β1单独应用组明显增加（P〈0．05）。细胞团培养模式下，诱导细胞表达Ⅱ型胶原比平板培养模式更加显著。结论 MSCs向软骨细胞诱导分化时，IGF-1对TGF—β1有明显的促进作用；细胞培养密度提高有利于MSCs成软骨细胞表型。     

骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞的分化潜能

目的：观察骨髓间充质干细胞在体外分化成淋巴管内皮细胞的可能性。方法：采用密度梯度离心法分离成人骨髓间充质干细胞,体外扩增,流式细胞术检测细胞表面标志。用内皮细胞培养基EGM-2培养,加入VEGF-C（156s）诱导后,相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术检测淋巴管内皮细胞特异性标志物Podoplanin和VEGFR-3,RT-PCR检测相应基因的表达。成管实验检测分化的淋巴管内皮细胞的功能。结果：分离培养的骨髓间充质细胞形态上为纤维样,经流式细胞术测定表达CD90、CD105,其阳性表达率分别为90.03%、97.86%,而CD14、CD34、HLA-DR的阳性阳性率分别为2.00%、2.18%、1.56%。经诱导刺激后,间充质干细胞呈鹅卵石样外观,Podoplanin和VEGFR-3的表达率分别为26.25%和12.70%。RT-PCR结果显示特异性的条带,成管实验显示诱导后的淋巴管内皮细胞具有成管的功能。结论：从骨髓中可以提取到骨髓间充质干细胞,在内皮细胞培养基和VEGF-C（156s）的诱导下骨髓间充质干细胞可以分化为淋巴管内皮细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的研究

目的探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性。方法抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离纯化MSCs，培养扩增后。用含EGF的不同介质诱导，观察细胞形态的变化，免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达。结果免疫组织化学染色显示EGF诱导后3d MSCs角蛋白表达较弱，7d角蛋白表达增强。流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少(3％)，7d表达角蛋白的细胞数量明显增加(13％)。结论MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞。     

体外诱导家猪骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的观察家猪骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)在体外诱导条件下成骨分化的特征及相关基因的表达。方法选取3月龄雌性长白猪6头,无菌条件下于胫骨近端抽取骨髓15ml。采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对MSCs进行分离、纯化,倒置相差显微镜观察原代细胞生长情况,于培养第7天计算MSCs百分比含量及群体倍增值。将第1代细胞置于含1×10-8mmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)、10mmol/Lβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)和82μg/ml抗坏血酸(ascorbic acid,Asc)的成骨诱导培养液中培养21d,作为实验组;DMEM培养液中培养作为对照组。分别行细胞形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)组织化学染色、钙沉积和细胞增殖测定,采用实时定量PCR分析成骨分化的相关基因表达。结果原代MSCs特征:培养第1天,有核细胞大部分由悬浮的圆形血源性细胞组成;第3天换液弃除非贴壁细胞,MSCs克隆开始形成,细胞呈成纤维细胞样生长;第7天,镜下观察到大小不一的克隆。细胞在培养后12～14d基本长满,原代细胞群体倍增值平均为13。MSCs成骨分化:诱导培养14d实验组细胞形态由成纤维细胞样变成立方体样,而对照组细胞始终保持成纤维细胞样。培养5d,对照组细胞计数为11723±4040,实验组为10276±5513,二者差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,实验组诱导培养14d,ALP染色呈强阳性,21d钙沉积明显增加(P<0.01)。实验组MSCs成骨相关基因:核心结合因子α1(corebinding factorα1,Cbfα1)、osterix、ALP、型胶原、骨连接素(osteonectin,ON)、骨钙素(osteocalcin,OC)表达逐渐增强;Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明显;与第7天比较,第21天osterix和OC基因表达明显上调(P<0.05);第14天,型胶原表达也上调(P<0.05)。结论密度梯度离心法分离的猪MSCs,在体外诱导条件下能通过上调分化特异基因表达向成骨细胞分化。     

体外诱导糖尿病鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究

目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力.方法 利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞,体外扩增3代,倒置显微镜观察细胞生长及形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达.取扩增第3代的BMSCs,分为2组,诱导组加入诱导培养剂[含10％胎牛血清、10μg/L血管内皮生长因子(VEGF)、2μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的M199培养基]中诱导分化,对照组则不加任何细胞因子.2周后行细胞形态学观察,免疫细胞化学法检测VEGF受体(VEGFR)-2表达,流式细胞仪测定CD34表达量,紫外线分光光度法测定一氧化碳(NO)含量,电镜观测胞质WeibelPalade小体.结果 STZ腹腔注射可诱导糖尿病大鼠模型.流式细胞仪显示第3代BMSCs表达表面抗原:CD44和CD90阳性细胞表达率分别为(97.8±0.9)％和(96.8±1.4)％,而CD11 b/c和CD34阳性细胞表达率分别为(13.2±0.6)％和(1.2±0.5)％.诱导组大部分细胞形态变化不明显,呈长梭形、杆状、多角形,诱导组VEGFR-2、CD34阳性表达率分别为(97.1±1.0)％和(65.0±3.9)％,而对照组则为(7.0±1.0)％和(0.9±0.3)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);诱导组胞外NO含量(94.14±3.25) μmol/L亦明显高于对照组(70.37±2.10) μmol/L(P ＜0.05);电镜两组均未观察到胞质Weibel Palade小体.结论 经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法可从骨髓中提纯BMSCs.糖尿病鼠BMSCs可在体外诱导向血管内皮样细胞方向分化,BMSCs有望作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的种子细胞.     

PAX6基因过表达促进大鼠骨髓内皮祖细胞向角膜内皮细胞分化

目的 通过研究大鼠骨髓内皮祖细胞转染PAX6基因后角膜内皮细胞相关特征性基因的表达,探讨其作为角膜内皮细胞移植的种子细胞的可能性.方法 采用密度梯度离心法分离出大鼠骨髓单核细胞,接种到纤连蛋白铺层的细胞皿,以EGM-2培养液选择培养,获得大鼠骨髓内皮祖细胞.通过免疫荧光染色检测CD31、CD34、CD133、LDL、U...     

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Form Ectopic Woven Bone In Vivo Through Endochondral Bone Formation

Abstract:  Autologous vascularized bone grafts, allografts, and biocompatible artificial bone substitutes each have their shortcomings. Bones regenerated using recombinant human bone morphogenetic proteins, demineralized bone powder, or combinations of these are generally small and do not meet the need. The current trend is to use tissue engineering approaches with bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to generate bones of a desired size and shape. A suspension of osteogenically induced MSCs (CD11a−, CD29+, CD44+) was added to 2% alginate, gelled by mixing this combination with calcium sulfate (CaSO₄ 0.2 g/mL), and injected into the subcutaneous pocket in the dorsal aspect of nude mice. Cells of various concentrations (0, 10, 50, and 70 million/mL) were used. These implanted constructs were harvested at predetermined times up to 30 weeks for histology. The doubling time of bovine MSCs is 3.75 ± 1.96 days and the proliferation is rapid. Histological evaluation revealed signs of endochondrosis with woven bone deposition. The equilibrium modulus increased with time in vivo, though less than that of normal tissue. Implants seeded with 70 million cells/mL for 6 months resulted in the best formation of equilibrium modulus. This approach has several advantages: (i) obtaining MSCs is associated with low donor morbidity; (ii) MSCs proliferate rapidly in vitro, and a large number of viable cells can be obtained; and (iii) the MSC/alginate constructs can develop into bone-like nodules with high cell viability. Such a system may be useful in large-scale production of bony implants or in the repair of bony defects. The fact that endochondral bone formation led to woven bone suggests its potential feasibility in regional cell therapy.     

人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞体外共培养的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs）与脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）体外共培养对hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影响。方法分离鉴定hBMSCs和hUVECs,将hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培养,倒置相差显微镜观察细胞的生长特性和细胞相容性,Matrigel实验观察共培养对hUVECs体外血管形成能力的影响。将hBMSCs成骨诱导7 d后,茜素红染色观察共培养对其成骨分化能力的影响。结果 hBMSCs与hUVECs体外共培养细胞相容性良好,Matrigel实验显示共培养组形成的毛细血管状结构较单一细胞组多。成骨诱导的hBMSCs中,共培养组茜素红染色阳性,单一细胞组茜素红染色阴性。结论 hBMSCs与hUVECs具有良好的细胞相容性,在共培养体系中,未诱导的hBMSCs能促进形成毛细血管状结构,已成骨诱导的hBMSCs成骨矿化能力增强。     

大鼠MSCs体外分离培养及骨向分化的实验研究

目的:建立骨髓MSCs体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导,以证实其多向分化潜能,为骨髓MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法:用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,并能够向成骨细胞分化。     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

猪骨髓间质干细胞分离培养及向成软骨细胞表型诱导分化的实验研究

目的建立猪骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外分离培养和在特定诱导液作用下向成软骨细胞表型转化,为其作为组织工程化软骨的种子细胞提供实验基础。方法取猪的胸骨骨髓6~8ml,经密度梯度离心法得到骨髓单个核细胞,在低糖改良Eagle's细胞培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)培养2周,将其分为两组,对照组应用高糖DMEM无血清完全培养基培养;实验组在对照组培养基基础上加入转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),在显微镜下观察细胞形态,第7,14d时用免疫组织化学法检测型胶原分泌。结果诱导早期两组细胞形态变化不明显,3d后实验组MSCs由纤维样梭形逐渐向多角形、多边形转变;实验组第7,14d型胶原免疫组织化学阳性,对照组为阴性。结论体外培养猪的BMMSCs生长稳定,传代后仍保持未分化状态,具有分化为软骨的潜能,为基础研究和组织工程提供了一个理想的种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为血管平滑肌样细胞的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为构建小口径血管种子细胞的可行性及其诱导机制。方法取体重100 g左右雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并用免疫荧光及流式细胞仪检测CD34、CD90、CD105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。将BMSCs分为实验组和对照组：实验组使用含全反式维甲酸及二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）的低糖基本培养基（DMEM-LG）培养;对照组采用普通的DMEM-LG培养。观察诱导后细胞形态,检测诱导后第5代细胞平滑肌α-肌动蛋白（SM--αactin）、钙结合蛋白（calponin）、平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）的表达情况。结果原代培养所获取的细胞经过多次传代培养后呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,检测CD34阴性,CD90、CD105阳性。实验组经诱导后的BMSCs生长较缓慢,略呈椭圆形,检测SM--αactin、calponin、SMMHC显著表达;对照组的细胞形态及生长速度和实验组BMSCs相似,但不表达SM--αactin、calponin和SMMHC。结论 BMSCs在全反式维甲酸的诱导下可向血管平滑肌样细胞表型分化,可为组织工程构建小口径血管提供平滑肌种子细胞。     

大黄素诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究

目的:探讨大黄素对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的影响.方法:体外分离、培养及扩增入骨髓MSCs,用流式细胞仪检测人骨髓MSCs表面抗原的表达,用倒置光学显微镜、透射电镜、四甲基偶氮唑盐比色、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定等研究人骨髓MSCs增殖和分化规律.采用不同方法诱导第3代人骨髓MSCs向成骨细胞分化.结果:入骨髓MSCs贴壁生长,呈成纤维细胞外观.流式细胞仪检测显示CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45、HLA-DR表达为阴性.大黄素对入骨髓MSCs增殖的影响:对照组和DXM(地塞米松)组与大黄素 DXM组比较均具有显著差异(P＜0.05).大黄素对人骨髓MSCs分化的影响:对照组和DXM组与大黄素 DXM组比较均具有显著差异(P＜0.01).结论:大黄素能促进入骨髓MSCs向成骨细胞方向分化.