Cyclin D3正、反义表达质粒在淋巴瘤细胞系Raji中的转染与鉴定

目的 :构建人类cyclinD3正义和反义真核表达质粒 ,分别转染到淋巴瘤细胞系Raji细胞中 ,为探讨cyclinD3基因对淋巴瘤细胞生物学行为的影响提供研究基础。方法 :以Raji细胞总RNA为模板 ,通过RT -PCR获取cyclinD3全长cDNA ,克隆入 pGEM -T载体 ,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3 .1中 ,构成含cyclinD3的表达质粒 pcD NA3 -cyclinD3。再运用DNA重组技术将cyclinD3基因反向克隆到pcDNA3 .1中 ,构建成cyclinD3反义表达质粒pcDNA3 -ascyclinD3。用脂质体介导的基因转染方法 ,将cyclinD3正、反义表达质粒和空质粒分别导入Raji细胞 ,经G418筛选建立稳定转染细胞株 ,用WesternBlot方法鉴定cyclinD3基因的表达。结果 :酶切鉴定和测序分析证实 ,实验成功构建了cyclinD3正、反义表达质粒。与转染cyclinD3正义表达质粒和空质粒的细胞相比 ,转染cyclinD3反义表达质粒的Raji细胞中cyclinD3表达水平下降。 结论 :正、反义cyclinD3在淋巴瘤细胞中的转染和表达 ,为进一步研究cyclinD3在淋巴瘤细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡中的作用奠定了基础     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能，构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞，采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2，并成功转染入SHG-44细胞，为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3-hsp70的构建及鉴定

目的：构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3—hsp70。方法：用基因释放刑提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增、获得hsp70目的基因后，与pcDNA3载体进行连接重组。结果：pcDNA3—hsp70真核表达质粒构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论：pcDNA3—hsp70真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3—hsp70DNA疫苗奠定了基础。     

人类S期激酶相关蛋白2表达质粒的构建

目的:克隆人类S期激酶相关蛋白2(Skp2)基因,构建其表达质粒,为今后进一步研究Skp2的生物学功能提供基础。方法:采用RT-PCR技术扩增人类Skp2 eDNA全长序列,运用DNA重组技术将其重组于pcDNA3.1/myc- His A质粒,构建Skp2表达质粒。结果:通过酶切电泳分析及DNA测序分析证实,实验成功构建了Skp2表达质粒。结论:Skp2表达质粒pcDNA3.1/mye-His A-Skp2构建成功,为进一步研究Skp2的生物学功能及其在肿瘤发生、发展、诊断和预后中的作用奠定了基础。     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.     

细胞周期素D1shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建针对细胞周期素D1(cyclinD1,由CCND1基因编码)的shRNA表达载体,筛选出有效序列,观察其对肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 设计针对cyclin D1基因编码区的3条寡核苷酸链,体外退火后克隆入干扰栽体Pgenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.以脂质体法将空载体Pgenesil-1-K和3个重组质粒Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13分别导人549肺腺癌细胞,48 h后用Real time PCK和Western blotting技术检测各实验组肺腺癌细胞内cycli D1 mRNA及蛋白的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期观察构建的载体对A549细胞增殖的影响.结果 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的 基因片断.转染cyclin D1-shRNA的A549细胞48 h后测定cyclin D1 mRNA和蛋白含量.以Pgenesil-1-CCND13抑制cyclin D1 mRNA及蛋白表达效果最为有效.其抑制率分别为62%和60%,而且它能抑制A549细胞的增殖.结论 成功构建了针对cyclin D1的RNA干扰表达载体Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13,Pgenesil-1-CCND13能有效抑制cyclin D1在A549细胞中的表达,并抑制A549的增殖,为进一步应用于肺腺癌的治疗实验研究奠定了基础.     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的：构建人NKG2D重组真核表达载体，并研究其在COS-7细胞中的表达。方法：应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA，应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后，构建含目的基因的真核细胞表达质粒，并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞．用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果：重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论：成功地构建了重组表达栽体pcDNA3．1-NKG2D，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

Effect of Antisense MBD1 Gene Eukaryotic Expression Plasmid on Expression of MBD1 Gene in Human Biliary Tract Carcinoma Cells

DNAmethylationhasavarietyofimportantfunctionsintheregulationofgeneexpression[1].ManystudiesdemonstratedthatthepathogenesisofbiliarytractcarcinomawascloselyassociatedwiththeaberrantDNAmethylationstatusoftumorrelatedgenes.TheaberrantstatusofDNAmethylationincludedthehypomethylationofonco genesandthehypermethylationoftumorsuppres sorgenes(TSG).IncreasingtheexpressionofTSGandimprovingthefunctionofTSGbyelimi natingitshypermethylationstatusmaybeanewwaytotreatbiliarytractcarcinoma.Toexplorether…     

反义细胞周期素D1基因对肝癌细胞的作用

目的研究反义基因封闭技术体外抑制细胞周期素D1（cyclin D1）表达后对肝癌细胞增殖的影响。方法肝癌HepG2细胞被转染表达cyclinD1反义互补脱氧核苷酸（AScDNA）的质粒后，观察其cyclinD1表达及体外增殖活性的改变。结果cyclinD1反义cDNA可特异性地抑制肝癌细胞，cyclinD1蛋白的表达。从而调控细胞周期，抑制肝癌细胞增殖。结论利用cyclin D1反义cDNA进行细胞周期干预对肝癌的治疗具有潜在的意义。     

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的：研究反义封闭ppGalNAc-T2基因表达对胃癌细胞GC7901细胞增殖以及肿瘤细胞生物学行为的影响,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901。方法：在对几种肿瘤细胞的ppGalNAc-T2基因的表达水平分析后,以高表达ppGalNAc-T2的人胃癌细胞GC7901的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增两段不同长度ppGalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞GC7901细胞pp-GaINAc-T2基因表达的亚细胞克隆。通过荧光显微镜、RT-PCR技术手段检测封闭反义ppGalNAc-T2基因RNA表达。结果：ppGalNAc-T2反义表达质粒载体pEGFP-FDT2和pEGFP-FXT2经限制性酶切及部分序列分析证明基因已正确插入载体中,荧光显微镜及RT-PCR显示转染成功。结论：成功构建了ppGalNAc-T2反义表达质粒载体,反义封闭pp-GaINAc-T2基因表达后,胃癌细胞GC7901ppGalNAc-T2的含量明显降低,为进一步研究ppGalNAc-T2奠定了基础。     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因真核表达载体,探讨bFGF基因转移治疗视网膜病变的方法.方法:将bFGF和GFP基因克隆到真核表达载体pcDNA3中.结果:酶切及琼脂糖电泳分析 pcFG中含有bFGF和GFP基因.结论:成功的构建了含有绿色荧光蛋白的人碱性成纤维细胞生长因子基因的真核表达载体.     

腺病毒介导的反义c-myc选择性诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡的研究

目的 构建介导反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞的细胞周期,增殖和凋亡的影响。方法 将ｃ－ｍｙｃ基因反向克隆于穿梭质粒载体ｐＡｄＣＭＶ中,通过脂质体与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,经同源重组产生编码反义ｃ－ｍｙｃ的重组腺病毒。体外观察和检测重组腺病毒感染人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２和ＳＰＣ－Ａ－１以及人胚肺二倍体细胞２ＢＳ后,细胞周期的改变,凋亡的发生和相关基因表达的变化;体内观察对肿瘤