人神经生物因子在昆虫细胞中的表达

神经生长因子 (ＮＧＦ)在外周及中枢神经系统的发育及存活方面起着重要的作用。它可以促进外周感觉神经元及背根神经节神经元的增生。中枢神经系统中 ,ＮＧＦ主要存在于前脑底部胆碱神经元中 ,其脑中含量的减少与Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病引起的记忆力减退及老年斑沉积呈正相关[1] 。因此ＮＧＦ药用方面的作用已受到人们的重视 ,它可望成为治疗Ａｌｚｈｅｉｍｅ病的新型药物。为了获得大量高比活的ＮＧＦ ,本文利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内表达了具有生物活性的ＮＧＦ。1　材料与方法1 1　细胞和质粒　ＮＧＦ基因由Ｇｅｎｅｔｅｃｈ公司提…     

神经生长因子及其受体在人胚胎结肠神经系统中的表达与分布

目的:研究人胚胎结肠神经系统的发育过程中神经生长因子(NGF)与其两个受体TrkA、P75NTR在结肠神经系统中的分布及与结肠神经系统发育的关系.方法:采用一抗为PGP9.5、NGF、TrkA、P75NTR的免疫组织化学技术,显示结肠神经系统中的神经元.结果:随着胚胎结肠神经系统的发育,P75NTR表达水平不断下降,而NGF、TrkA表达水平不断上升,P75NTR与NGF、TrkA的比例在不断变化.结论:NGF、TrkA、P75NTR参与了结肠神经系统的发育.     

神经生长因子受体TrkA在喉癌中的表达及意义

目的:探讨神经生长因子受体TrkA在人喉鳞状细胞癌(喉癌)中的表达及其临床意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测34例喉癌组织、11例癌旁黏膜、6例喉乳头状瘤及8例正常声带黏膜组织中TrkA的表达.结果:34例喉癌组织中TrkA受体蛋白均有阳性表达,喉癌、癌旁黏膜及喉乳头状瘤中TrkA的表达均高于正常声带黏膜;喉癌伴随颈部淋巴结转移的病例组中TrkA表达的强阳性率明显高于无淋巴结转移组(P＜0.05).结论:TrkA的高表达与喉癌的恶性进展及淋巴结转移有相关性,这为临床诊断及治疗喉癌提供了新的途径.     

重组人MBL在CHO细胞中的表达及检测

[目的]在CHO-K1细胞中表达重组MBL并进行检测。[方法]构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mbl，用阳离子转染试剂Transfast转染CHO-K1细胞，G418筛选稳定转染的细胞。应用RT-PCR、ELISA及免疫荧光检测重组MBL的表达。[结果]RT-PCR从稳定转染pcDNA3.1（＋）-mbl的CHO-K1细胞中检测到mbl基因的表达，夹心ELISA并未从转染细胞上清中检测到重组MBL，免疫荧光表明稳定转染pcDNA3．1（＋）-mbl的CHO-K1细胞能够在胞浆中表达重组人MBL。[结论]成功构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）-mbl并转染CHO-K1细胞，转染的细胞能够表达重组人MBL。     

人β-神经生长因子和神经生长因子基因重组真核表达载体的构建

目的:入神经生长因子包括β-神经生长因子、神经生长因子这两种活性形式,拟分别构建这两种活性形式的基因重组真核表达载体,为进一步的转基因实验作好前期准备。方法:实验于2001～2004年在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①对象:健康志愿者5人,均对本实验知情同意。流产胎儿由青岛大学医学院妇产科提供,产妇均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:根据人β-神经生长因子与神经生长因子的全长基因序列设计合成特异性引物。抽取正常人外周血1.5 mL,提取基因组DNA后克隆出人β-神经生长因子基因片段。取胎儿海马部位脑组织100 mg,采用RT-PCR技术从胎儿脑组织中克隆出人神经生长因子基因片段。分别将纯化的β-神经生长因子产物与神经生长因子产物连接于真核表达载体pcDNA_4上,构建重组真核表达载体。转入JM109大肠杆菌中,扩增后小剂量质粒提取,酶切鉴定及计算机自动测序。结果:β-神经生长因子和神经生长因子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,在预期位置均有阳性条带。酶切鉴定结果及计算机自动测序均证实插入片段为目的基因片断。结论:实验分别从人外周血和胎脑海马组织中成功克隆获得β-神经生长因子与神经生长因子,并顺利构建这两种活性形式的重组真核表达载体pcDNA_4-β-NGF与pcDNA_4-NGF,为进一步将神经生长因子基因转入真核细胞并比较二者表达效率作好准备工作。     

脑源性神经生长因子在恶性肿瘤中的表达及其意义

近年来，很多的资料表明：脑源性神经生长因子（brain—derived neumtmphic factor：BDNF）在某些肿瘤组织中的表迭和相应正常组织中的表达存在差异，可以肯定，这种差异将赋予这类肿瘤细胞以某些特定的细胞生物学功能。深入认识BDNF及其相关细胞生物学功能深远。     

神经生长因子重组反转录病毒载体在神经干细胞中的表达

背景：神经生长因子属于生物大分子,难以透过血脑屏障,而反转录病毒载体能稳定地将外源基因插入并整合到宿主细胞基因组内,适于作为基因治疗的载体。 目的：探讨神经生长因子基因重组反转录病毒表达载体在神经干细胞中的表达情况。 方法：将SD大鼠神经生长因子基因重组反转录病毒表达载体pLEGFP-NGF通过脂质体Lipofectamine 2000转染包装细胞PT67,经G418筛选后,收集阳性克隆病毒上清,用于感染神经干细胞,用ELISA检测神经生长因子基因的表达,并利用 PC12细胞检验神经生长因子的生物学活性,同时观察神经生长因子对神经干细胞存活、分化的影响。 结果与结论：重组了神经生长因子基因的反转录病毒液感染神经干细胞后能表达外源性神经生长因子蛋白,该蛋白能促使PC12细胞数量增多,突起明显变长,并能增加神经干细胞的存活数量,促进神经干细胞分化。结果说明整合了神经生长因子基因的神经干细胞能表达外源性神经生长因子,表达的神经生长因子对神经干细胞的存活及分化均有促进作用。     

Notch信号分子在人淋巴瘤细胞中的表达及意义

本研究探讨Notch信号分子在人淋巴瘤细胞中的表达及其意义。选择人B淋巴瘤细胞系(Raji、Maver、Z138)和T淋巴瘤细胞系Jurkat细胞,利用RT-PCR技术检测Notch信号分子在这些细胞中的表达情况;利用流式细胞术检测γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号后对淋巴瘤细胞凋亡以及细胞周期的影响;利用CCK-8法检测DAPT对淋巴瘤细胞增殖的影响。结果表明:Notch分子在不同淋巴瘤细胞中的表达有所不同,Notch1和Notch2在4种细胞中均有表达,Notch3主要表达于Jurkat细胞,而Notch4仅在Raji细胞中弱表达;另外,Notch下游靶基因Hes1仅表达于Raji和Jurkat细胞。DAPT对Jurkat和Raji细胞的增殖抑制以及凋亡诱导作用比较明显,并将细胞周期阻滞在G1期,但是对Maver和Z138细胞的作用较弱。DAPT可以通过抑制Notch下游靶基因Hes1的表达而发挥作用。结论:Notch信号的异常表达与活化对淋巴瘤细胞的增殖起着重要作用,Notch信号有望成为淋巴瘤治疗的一个新靶点。     

FLT3配基基因在人骨髓基质细胞中的表达

目的 构建人FLT3配基（FL）逆转录病毒载体，并观察其在人骨髓基质细胞中的表达。方法 用基因重组技术，将FLcDNA插入逆转录病毒载体pLXIN，获得重组载体pLFIN。采用脂质体法将重组质粒pLFIN转染包装细胞PA317，G418筛选抗性克隆，用抗性克隆上清液感染人骨髓基质细胞，RT-PCR和基因组DNA-PCR检测外源基因mRNA的转录及染色体的整合，ELISA法和小鼠CFU-GM集落形成法检测FL蛋白表达量和生物学活性。结果 酶切鉴定表明成功构重组逆转录病毒载体pLFIN；染色体基因组中整合有外源基因FL和Neo；在mRNA和蛋白质水平均可检测到FL表达；24hFL蛋白表达量为4.35ng/ml，活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论 逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞中获得表达，并具有良好的生物学活性，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响提供了实验依据。     

神经生长因子在大鼠骨折部位的表达

目的：用免疫组织化学方法来观察神经生长因子在大鼠骨折和非骨折部位的定位，分析神经生长因子在促进骨折修复中的可能作用。 方法：实验于2005-06／11在大连大学附属中山医院骨科实验室完成。①取SD大鼠24只随机分为实验组18只，对照组6只。另取1只大鼠取其下颌下腺作为免疫组织化学的阳性对照。②实验组SD大鼠在第6肋距脊柱1cm处剪断肋骨建立肋骨骨折模型，对照组只暴露肋骨不切断。③实验组分别于术后1。3，6周各取6只大鼠在麻醉状态下取骨折部位1／6肋骨，对照组每次取2只，方法、部位同实验组，进行免疫组织化学染色检测神经生长因子。 结果：25只全部进入结果分析。①对照组（非骨折部位）的肋骨，只有骨膜的间质细胞及骨骼肌纤维显示神经生长因子轻度着色。②实验组第1，3周，骨折部位的骨母细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞染色阳性，大多数软骨细胞和骨痂也被染色。在骨折后6周，骨膜骨母细胞染色阳性。在非骨折肋骨，骨膜骨母细胞染色阳性。骨折部位，骨母细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞、某些软骨细胞、骨膜基质细胞和骨骼肌细胞染色阳性。 结论：①神经生长因子对正常骨组织的神经维持有重要作用。②神经生长因子对骨的新陈代谢和骨折的修复通过神经系统起促进作用。③神经生长因子对骨修复可能有直接的作用。     

成牙本质细胞中成纤维细胞生长因子18的表达

目的:观察成牙本质细胞中是否表达成纤维细胞生长因子18。方法:实验于2005-02/04在解放军第四军医大学口腔医院口腔内科实验室完成。①小鼠成牙本质样细胞系MDPC-23培养:细胞培养在含体积分数为0.1的胎牛血清α-MEM、青霉素l00IU/mL、链霉素l00mg/L和谷氨酰胺50mg/L的完全培养液中,同时附加50mg/L抗坏血酸。②免疫组织化学染色:一抗用1∶100稀释的成纤维细胞生长因子18多克隆抗体,4℃湿盒过夜,最后滴加二氨基联苯胺液显色。以磷酸盐缓冲液代替一抗设为阴性对照。成纤维细胞生长因子18阳性表达细胞胞浆呈棕黄色。③免疫荧光染色:一抗用1∶50稀释的羊抗小鼠成纤维细胞生长因子18多克隆抗体,4℃湿盒过夜后滴加按1∶500稀释的FITC标记的兔抗羊二抗。阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗进行染色。成纤维细胞生长因子18阳性表达细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。结果:免疫荧光和免疫组织化学法均表明成纤维细胞生长因子18在MDPC-23细胞浆呈阳性表达。结论:从蛋白水平证实了成牙本质样细胞MDPC-23表达成纤维细胞生长因子18,提示成纤维细胞生长因子18可能是影响成牙本质细胞分化的胞内信号转导分子。     

成牙本质细胞中成纤维细胞生长因子18的表达

目的：观察成牙本质细胞中是否表达成纤维细胞生长因子18。 方法：实验于2005—02／04在解放军第四军医大学口腔医院口腔内科实验室完成。①小鼠成牙本质样细胞系MDPC-23培养：细胞培养在含体积分数为0．1的胎牛血清α—MEM、青霉素100IU／mL、链霉素100mg／L和谷氨酰胺50mg／L的完全培养液中，同时附加50mg／L抗坏血酸。②免疫组织化学染色：一抗用1：100稀释的成纤维细胞生长因子18多克隆抗体，4℃湿盒过夜，最后滴加二氨基联苯胺液显色。以磷酸盐缓冲液代替一抗设为阴性对照。成纤维细胞生长因子18阳性表达细胞胞浆呈棕黄色。③免疫荧光染色：一抗用1：50稀释的羊抗小鼠成纤维细胞生长因子18多克隆抗体，4℃湿盒过夜后滴加按1：500稀释的FITC标记的兔抗羊二抗。阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗进行染色。成纤维细胞生长因子18阳性表达细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。 结果：免疫荧光和免疫组织化学法均表明成纤维细胞生长因子18在MDPC-23细胞浆呈阳性表达。 结论：从蛋白水平证实了成牙本质样细胞MDPC-23表达成纤维细胞生长因子18，提示成纤维细胞生长因子18可能是影响成牙本质细胞分化的胞内信号转导分子。     

Expression of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor in human bladder cancer.

We analysed the expression of epidermal growth factor receptor (EGFr) and transforming growth factor alpha (TGF-alpha) in human bladder tumours. Tumour biopsies were obtained from 54 patients with primary bladder cancer (18 stage T1 and 36 stage T2-4). The protein and mRNA expression of EGFr and TGF-alpha were quantified by ELISA and competitive RT-PCR, respectively. The EGFr protein level was significantly increased in T2-4 tumours (0.44 x 10(-11); 0.0-27.5 x 10(-11) mol/g) compared with T1 tumours (0.0; 0.0-2.0 x 10(-11) mol/g) (median; range; 2p<0.01). The EGFr protein and mRNA level correlated (Spearman r=0.45, 2p<0.005, n=40). Co-expression of TGF-alpha protein and EGFr protein was significantly associated with muscle invasive tumours (T2-4) (chi-squared=7.9, df=3, p<0.05) and the TGF-alpha protein level correlated significantly with EGFr protein expression (Spearman r=0.56, 2p<0.0001, n=54). While tumour stage correlated with survival, no correlation was observed between survival and the expression of EGFr and/or TGF-alpha. In conclusion, human bladder tumours express both EGFr and TGF-alpha. The expression of EGFr and TGF-alpha are closely correlated, and the expression of EGFr and co-expression of EGFr and TGF-alpha correlate with tumour stage.     

重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子促进人角膜上皮细胞的增殖

背景：重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的制剂临床上已经用于眼表创伤的修复,但是对于使用何种浓度的生长因子就能够最大程度的促进愈合以及两种生长因子促进创面愈合的效果比较一直存在争议。 目的：初步观察重组人表皮生长因子、碱性成纤维生长因子对培养的人角膜上皮细胞克隆的影响。 方法：用不同浓度的重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子作用于体外培养的人角膜上皮细胞,应用四甲基偶氮唑盐比色法分别在不同浓度的生长因子作用人角膜上皮细胞3,5,7 d后检测人角膜上皮细胞的增殖能力;平板克隆形成实验法观察细胞克隆形态及计算细胞克隆形成率。 结果与结论：不同质量浓度的重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子分别对人角膜上皮细胞干预5d后,重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在10μg/L质量浓度时MTT值最大;质量浓度10μg/L重组人表皮生长因子促进人角膜上皮细胞克隆形成率高于质量浓度10μg/L碱性成纤维生长因子（P=0.02）。结果证实,重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子均能促进人角膜上皮细胞增殖并增加其克隆形成能力。质量浓度10μg/L 重组人表皮生长因子干预5 d促进人角膜上皮细胞克隆形成效果最好。     

脂多糖诱导体外培养骨骼肌卫星细胞表达肝细胞生长因子的变化

目的:研究证实,在众多生长因子中,肝细胞生长因子无论在体外还是体内都可以激活静止状态的肌卫星细胞,修复受损肌肉。采用脂多糖刺激体外培养的骨骼肌卫星细胞,观察肌卫星细胞产生肝细胞生长因子以及肌卫星细胞增殖分化的变化。方法:实验于2006-07/2007-05在华中科技大学同济医学院同济医院创伤外科实验室完成。①实验材料:健康SD成年雄性大鼠,体质量150～200g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合实验动物伦理学标准。②实验方法:分离SD大鼠后肢部分股四头肌肉进行骨骼肌卫星细胞的培养。取第2代细胞爬片,待细胞增殖到80%密度时,丙酮固定细胞,常规处理后进行α-sarcometricactin细胞免疫化学染色鉴定,以成纤维细胞作为阴性对照。取第3代骨骼肌卫星细胞,应用0,5,10,20mg/L脂多糖刺激体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞,采用ELISA方法测细胞培养液中的肝细胞生长因子的浓度。取第4代骨骼肌卫星细胞,用含体积分数为0.10胎牛血清的培养基配制成单个细胞悬液,调整浓度为5×107L-1,分成两组,一组加入10mg/L脂多糖,另一组不加任何干预。采用噻唑蓝(MTT)法测定卫星细胞的增殖率。结果:①以未经脂多糖处理的无血清培养基培养的肌肉卫星细胞培养液为对照,将对照组和5,10,20mg/L脂多糖处理组比较,各实验组肝细胞生长因子浓度明显高于对照组(P<0.05)。②5,10,20mg/L脂多糖刺激骨骼肌卫星细胞分泌的肝细胞生长因子水平差异无显著性。③肝细胞生长因子在脂多糖刺激后36h分泌浓度最高。④脂多糖刺激肌卫星细胞的增殖分化明显高于未经刺激的肌卫星细胞。结论:①脂多糖可诱导骨骼肌卫星细胞自分泌肝细胞生长因子。②不同质量浓度脂多糖培养基中肝细胞生长因子水平差异无统计学意义。③脂多糖具有促进骨骼肌卫星细胞增殖分化的效应。     

血管内皮生长因子mRNA表达及ARPE-19细胞增生与缺氧的诱导效应

目的:研究缺氧对人视网膜色素上皮细胞-19(ARPE-19)的增生和血管内皮细胞生长因子表达的诱导作用。方法:实验于2004-10/2005-12于南京医科大学生理学实验室完成。实验材料:ARPE-19细胞购自美国American Type Culture Collection。实验方法及分组:ARPE-19细胞被暴露在含体积分数为0.05的CO2和0.95的N2的缺氧培养缸中培养为缺氧组。同代同一培养瓶中传代的细胞在常氧情况下培养,作为正常对照组。实验评估:2,12,24,36h后,光镜下观察ARPE-19细胞形态学变化,采用四甲基偶氮唑盐法检测两组ARPE-19细胞增殖的情况;用半定量反转录聚合酶链反应检测两组ARPE-19细胞血管内皮细胞生长因子mRNA的表达。结果:①缺氧对ARPE-19细胞增殖的影响:ARPE-19细胞缺氧组2,12,24,36hA值均比正常组明显增高,除缺氧2h外,其他各时间点均能明显诱导ARPE-19细胞增殖(P<0.05)。②缺氧对血管内皮生长因子mRNA表达的影响:缺氧组血管内皮生长因子mRNA表达明显增高,缺氧2,12,24,36h血管内皮生长因子mRNA表达均高于正常对照组(1.567±0.080,1.868±0.176,5.061±0.407,1.748±0.277,0.603±0.017,P<0.05,n=8),并且呈时间依赖性,在24h达到表达最高峰。结论:缺氧可以促进ARPE-19细胞增殖和血管内皮生长因子mRNA表达增加,为研究缺血缺氧性视网膜疾病提供了一个新的思路,即控制缺氧造成的视网膜色素上皮细胞增殖和血管内皮细胞增殖对治疗缺血缺氧性视网膜疾病是绝对必要的。     

血管内皮细胞生长因子在兔骨髓基质干细胞内的表达及影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子pcDNA3/hVEGF165真核表达载体,并用脂质体法转染骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),观察血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)转染后对骨髓MSCs的生长、转化的影响。方法:采用贴壁法分离骨髓MSCs,脂质体法转染。100g/L胎牛血清DMEM培养MSCs,计数法绘制生长曲线,特殊染色观察MSCs的转化,免疫组织化学法观察转染后VEGF的表达。结果:转染了pcDNA3/hVEGF165的骨髓MSCs胞浆内出现VEGF阳性颗粒,而转染了pcDNA3组及未转染组中未出现阳性颗粒,生长曲线在3组中无明显差别。特殊染色出现的时间亦无明显差别。而且,注射有转染了pcDNA3/hVEGF165的MSCs的大白兔局部皮下血管数量增加,其他两组未发现。结论:本实验成功构建了pcDNA3/hVEGF165真核表达载体并能够在MSCs细胞内表达VEGF,其表达产物具有血管内皮增殖刺激活性。