新生隐球菌的PCR指纹分析

传统的新生隐球菌的分型主要采用依据荚膜抗原决定簇的血清分型方法。但仅能分成数种血清型,用于菌株间的变异分析显得无能为力。有资料表明相同血清型的新生隐球菌菌株可呈现明显不同的病理、生理反应^[1,2].我们采用PCR指纹技术对新生隐球菌不同分离株进行了DNA多态性分析,现将结果报道如下。一、材料与方法(一)菌株:新生隐球菌参考菌株D48、ATCC64538、ATCC64528为A血清型,RV45981、RV59939、RV60047、RV43185为D血清型,RV52643、RV54135为B血清型,RV52646、RV45978为C血清型,除D48株为WHO赠送外,其余均为比利时热带病研究所赠送。     

红色毛癣菌的基因分型研究

目的 探讨探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌的基因分型并分析其基因型与来源地区的相关性。方法 用溴化十六烷基三甲铵（CTAB）法提取DNA，以皮肤癣菌的特异性引物NS5[5′-AACTAAAGGAATTGACGGAAG-3′]与ITS4[5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′]为引物，以红色毛癣菌的标准菌株为模板，用PCR法扩增出其rDNA部分18S区，ITSI区，5.8S区和ITSⅡ区为探针，用随机引物法将探针标记^32P，用EcoRI酶切基因组DNA，采用DNA印迹的标准流程将酶切的基因组DNA与探针杂交；显示的不同带型，以此作为红色毛癣菌基因分型的依据。结果 所试49株红色毛癣菌（南京21株，大连26株，北京2株）分为20型（A-T型），其中A-C型占48.98%。南京株绝大多数为3条带，大连株大部分为4条带。结论 用ITS区域探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌基因组分型敏感性强，分辨力高；南京与大连两地区红色毛癣菌DNA分型具有明显差异，DNA分型对红色毛癣菌病的流行病学，临床疗效的判定以及指导用药均具有重要价值。     

耐氟康唑白念珠菌两种基因分型方法的比较研究

目的比较钳位均匀电场电泳(CHEF)和限制性核酸内切酶BssHII电泳核型(PFGE-BssHII)分型方法对耐氟康唑白念珠菌基因型的区分能力,探索不同部位、不同地区、不同耐药性菌株DNA核型的差异。方法采用CHEF和PFGE-BssHII分型方法对54株不同来源白念珠菌(氟康唑耐药株16株,剂量依赖型敏感株7株,敏感株31株)进行核型分析。结果54株白念珠菌经CHEF和PFGE-BssHII分别分出20种和37种DNA核型。16株从同一AIDS患者口咽部念珠菌病多次发作中分离的白念珠菌对氟康唑的敏感性发生变化,通过两种方法检测的DNA核型完全相同,显示为同一菌株,且核型不随耐药性的变化而改变。结论PFGE-BssHII方法区分DNA核型的能力高于CHEF。本研究白念珠菌菌株间的基因型具有个体差异,但与分离的部位、不同地区来源及抗真菌药耐药性间差异无显著性。     

脉冲场凝胶电泳及随机扩增多态性DNA对淋球菌的基因分型

目的　评价脉冲场凝胶电泳限制性内切酶分析 (PFGE REA)及随机扩增多态性DNA (RAPD )分析对淋球菌分离株进行基因分型的能力。方法　 3 6株淋球菌分离株基因组DNA以SpeⅠ酶切及脉冲场凝胶电泳。并以随机引物OPA 0 3对 3 6株菌进行RAPD分析。结果　PFGE REA在 3 6株菌中产生 1 2～ 1 9个DNA片段 ( 5～ 6 0 0kb) ,区分出 2 0种PFGE型。以OPA 0 3扩增淋球菌DNA ,获得 1 5个不同的DNA片段( 2 80～ 1 90 0bp)。每株菌有 3～ 9个片段。 3 6株菌呈现 1 8种RAPD型。研究表明 ,PFGE REA与RAPD可区分属相同营养型及抗生素谱的菌株 ,二种方法分型结果总的趋向一致。不同地区的分离株甚至同一地区的某些分离株存在相当大的DNA多态性。具相同或十分相似基因型的菌株为某一特定地区所特有。认为PFGE REA及RAPD是鉴别淋球菌临床分离株有用而敏感的分子技术 ,有助于了解菌株来源、菌株间的克隆相关性及抗生素耐药性的传播。与PFGE REA相比 ,RAPD分析相对快速、简便和经济     

须癣毛癣菌基因分型的研究

目的探讨ITS区域的探针与DNA印迹杂交法对须癣毛癣菌的基因分型,并分析基因型与来源地区的相关性。方法用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)法提取DNA,以皮肤癣菌的特异性引物NS5[5-′AACTTAAAGGAATT-GACGGAAG-3′]与ITS4[5-′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′]为引物,以须癣毛癣菌的标准菌株为模板,用PCR法扩增rD-NA部分18S区、ITSⅠ区、5.8 s区和ITSⅡ区为探针,随机引物法将探针标记,EcoR1酶切基因组DNA,按ECL试剂盒标准流程将酶切的基因组DNA与探针杂交;根据杂交的不同带型而分型。结果所试35株须癣毛癣菌分为14型(A~N型),A,B,C,D四型占62.86%。南方株以A和C型为主,北方株以B和D型为主。结论用ITS区域探针与DNA印迹杂交法对须癣毛癣菌基因组分型敏感性强、分辨力较高;南北方须癣毛癣菌DNA分型存在一定差异;DNA分型对须癣毛癣菌病的流行病学调查和菌学的生物学研究具有重要价值。     

PCR-RFLP方法检测淋球菌及opa基因分型研究

目的研究聚合酶链反应-限制性长度多态性分析技术进行淋球菌opa基因分型及广西地区淋球菌opa基因分型情况。方法采用质粒PCR对80株淋球菌临床分离株进行检测,后用RFLP方法对其扩增产物进行opa基因分型。结果80株淋球菌经PCR测定后,有效进行分型的有70株淋球菌,这些菌株经opa基因分型后共产生63个独立opa基因型别,其中58个opa基因型各由单一株菌组成,另外5个opa基因型由2株或2株以上的菌株组成。结论聚合酶链反应-限制性长度多态性分析技术可对淋球菌进行检测和opa基因分型。opa基因分型方法是分子流行病学研究的重要工具。     

淋球菌opa基因分型方法的建立与评估

目的 探讨建立淋球菌opa基因分型方法,并对建立的实验室方法进行流行病学资料验证。方法 采用PCR-RFLP建立淋球菌opa基因分型方法,opa基因多态性分析使用特定的Gelcompar软件。选取淋病患者26例,其中有三对患者两两之间具有明确的性关系,而其他患者之间无明确性接触史。研究用收集到的已知流行病学资料验证opa基因分型方法的可靠性。结果 建立PCR-RFLP为基础的opa基因分型方法。26株淋球菌opa基因经过两种限制性内切酶（TaqⅠ与HpaⅡ）分别酶切后,发现两两之间存在明确性联系的3对菌株其opa基因被酶切后具有相同（100％）的长度多态性特性,而无明确性联系的菌株其opa基因被酶切后未发现具有类似相同的长度多态性。结论 实验室结果与患者所提供的性接触信息完全吻合。opa基因分型方法是一种较可靠的性网络调查工具。     

2011-2012年海南地区淋球菌耐药性监测及基因分型研究

【摘要】 目的 探讨海南淋球菌耐药状态及耐药基因分型情况。 方法 用琼脂稀释法测定4种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）,PCR方法鉴定四环素高度耐药菌株（TRNG）并进行TetM基因分型;用纸片酸度法测定β内酰胺酶（PPNG）,PCR方法鉴定β内酰胺酶质粒并进行TEM-1基因分型。 结果 2011—2012年共检测214株淋球菌,环丙沙星中度敏感率7.94 %（17/214）,耐药率为92.06%（197/214）;头孢曲松敏感率24.30%（52/214）,中度敏感率为75.70%（162/214）;未发现耐大观霉素的菌株。多重耐药情况：对四环素和青霉素耐药的菌株39株（18.22%）,对青霉素和环丙沙星耐药菌株66株（30.84%）,对四环素和环丙沙星耐药的菌株 91株（42.52%）,对四环素、青霉素和环丙沙星耐药的菌株 37株（17.29%）。检出TRNG 101株（47.20%）,TetM基因分型结果99株（98.02%）荷兰型, 2 株（1.98%）美国型。检出PPNG 65株（30.37%）,TEM-1基因分型结果55株（84.62%）亚州型,10株（15.38%）非州型,未见多伦多型、里约型。 结论 海南省淋球菌对大观霉素敏感率高,应作为治疗淋病的首选药物;多重耐药菌株应引起重视。PPNG以亚州型为主,非州型次之;TRNG以荷兰型为主,偶见美国型。     

解脲支原体耐药性与血清型关系的研究

用代谢抑制试验法对２０６株解脲支原体（Ｕｕ）同时进行血清分型和药敏试验。结果显示对红霉素耐药的Ｕｕ血清优势型别为２型，对四环素耐药的Ｕｕ血清优势型别为２型和９型，而对两种抗生素同时耐药的Ｕｕ血清优势型别为２型。可见，Ｕｕ耐药性与血清型之间存在联系，２型和９型Ｕｕ菌株的耐药率明显高于其他血清型别。     

新疆头癣紫色毛癣菌分离株的PCR-RFLP基因分型

目的 探讨新疆地区紫色毛癣菌的基因特点,为新疆儿童头癣致病菌的分子流行病学研究提供依据。 方法 用5种限制性内切酶HaeIII,Bgl I,MspI,DdeI 及MboI,采用PCR限制性片段长度多态性（RFLP）法对分离于新疆儿童头癣的30株紫色毛癣菌的rDNA非转录间隔（NTS）区进行基因分型,并与北京的9株、台湾的2株紫色毛癣菌做比较。结果 内切酶DdeI将全部41株菌分为12个基因型。新疆的30株菌分为10个基因型,其中17株菌分为D、F、G、H、I、J、K 7个基因型,与北京和台湾菌株间有明显基因差异,其余13株菌分3个基因型,与北京和台湾菌株有基因同源性。结论 新疆地区儿童头癣分离的紫色毛癣菌既有独特基因型,又与北京、台湾菌株有基因同源性,体现了新疆紫色毛癣菌的基因多态性。     

山西太原地区淋球菌NG-MAST基因分型

目的采用淋球菌多抗原序列分型(NG-MAST)进行淋球菌基因分型,了解山西太原地区淋球菌流行株的菌株基因分型。方法收集山西太原地区淋球菌菌株41例,提取所有菌株的DNA,扩增por和tbpB基因片段,进行测序,在NG-MAST基因数据库里进行比对,用MEGA-X对其进行进化树分析。结果研究41株菌的NG-MAST基因分型,发现新的基因分型共15株(36.59%)。NG-MAST进化图显示NG-MAST3305和NG-MAST2083是山西地区的优势菌株。por1132、por2001、por6993是山西地区por的优势基因型,tbpB4是山西地区的优势基因型。por等位基因号90和5692可能为短链上同一来源基因型;淋球菌的tbpB的进化图可以发现tbpB4、1601、1971、907、75、446的等位基因号亲缘关系比较近,它们可能是短链上来源相同的基因型;淋球菌的NG-MAST的进化图可以发现ST4022和ST New4的亲缘关系比较近,它们可能是短链上来源相同的菌株。结论 NG-MAST可以持续监测山西太原地区淋球菌的基因分型,了解本地区淋球菌流行状况。     

中国合肥与日本新两地白念珠菌分离株的生物学特性比较

目的由合肥、新两地 ,分别取白念珠菌分离株32株及36株 ,展开试验。旨在探索不同地区可能出现的差别。方法试验包括形态学(芽管、厚膜孢子)、生理学(碳源同化试验、蛋白酶、磷脂酶)及生物分型试验。结果形态学、生理学试验 ,两地的菌株均无显著性差异 ;但生物分型有区别———两地菌株除了唯一的型别(37734003)为共有外 ,其他8个型别均不相同。结论生物分型可作为流行病学调查工具     

波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌随机扩增DNA多态性分析

目的 了解波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌的基因学特征,研究DNA分型与菌种来源的关系.方法 采用随机扩增多态性DNA分析(RAPD)方法.结果 3种引物可将来自5个国家的13株波氏假阿利什菌和18株尖端赛多孢子菌分为31个基因型.多引物聚类分析所得树状图显示,除来自哥伦比亚土壤的3株波氏假阿利什菌外,其他受试菌株无地域性群集分布特点.但受试菌株中的多数波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌株分别聚集成一群.结论 波氏假阿利什菌和尖端赛多孢子菌存在较大株间差异,致病菌没有明显的地域性分布趋势,RAPD分型聚类分析结果与形态学分类之间具有一定一致性.     

新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

微卫星基因分型法分析生殖器白念珠菌感染的传播特点

目的 建立适用于株间鉴别的白念珠菌快速微卫星基因分型方法,探索生殖器白念珠菌感染特点.方法 采集39例女性和27例男性生殖器念珠菌病患者生殖器、肛管和口腔的白念珠菌分离株.以三色荧光标记引物,PCR扩增白念珠菌保守基因CDC3、EF3和HIS3微卫星序列,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,行微卫星多态性基因分型.结果 三基因联合分析显示,男女生殖器白念珠菌感染者共获18种基因型,主要致病菌株基因型为116:124、122:131、160:200,占感染者的50%以上.3种共有基因型占71%.女性患者中肛管部位菌株基因型与生殖器部位完全一致的占80%,男性则仅占3.8%.女性患者口腔部位的菌株基因型与生殖器部位完全一致的仅占2.7%,男性未见口腔和生殖器一致的菌株基因型.71%的夫妻共患者间生殖器白念珠菌基因型完全相同,其中80%的致病菌株基因型为两性皆感染的主要致病性白念珠菌.结论 改良的白念珠菌微卫星多态性基因分型法能够特异、准确、稳定和快速地进行菌株间鉴别.生殖器白念珠菌感染存在优势基因型.     

广东省珠海地区淋球菌多抗原序列分型研究

 目的:了解广东省珠海地区淋球菌基因型的分布,为淋病的防控提供实验室依据。方法：采用淋球菌多抗原序列分型法（NG-MAST）对2018-2019年珠海市淋病监测网络收集的172株淋球菌菌株进行基因分型,并构建系统进化树。结果：172株淋球菌中,porB基因型82种,tbpB基因型44种;porB和tbpB基因型别前三位分别为por2978（13株）、por1135（11株）、por3215(9株) 和tbp10（37株）、tbp21（26株）、tbp110（13株）。NG MAST型别79种,未知基因型占33.7%,优势基因型为ST9659（9株）、ST5308（6株）、ST8140（6株）,系统进化树显示菌株具有高度多态性。结论：本地区NG MAST型别具有多样性,新基因型菌株较多。     

32株孢子丝菌临床株两种基因分型方法比较

目的 确定哪种孢子丝菌基因分型的方法分辨力更高,所分基因型与临床表现及地域分布相关性更好。方法 以32株不同地区及临床类型的孢子丝菌菌株为研究样本,分别进行mtDNA RFLP分型,基因组DNA RAPD分型和rDNA RFLP-Southern blotting杂交分型,并进行比较。结果 mtDNA-RFLP方法将受试菌株分为5型,分别对应Ishizaki等命名的1,4,6,7,20五种基因型;RAPD方法将受试菌株分为7种基因型（I-VII型）; rDNA RFLP-Southern blotting杂交方法将受试菌株分为15种基因型（A-O型）,且其所分基因型与菌株的南北方分布及临床表现有一定相关性。结论 三种孢子丝菌基因分型方法中,rDNA RFLP-Southern blotting杂交方法分辨力较高,所分基因型与临床表现及地域分布相关性更好。     

阿萨希毛孢子菌胞外分泌酶水平的比较

目的探索阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶的种类与活性。方法采用卵黄琼脂培养基、BSA-琼脂培养基和AIP-ZYM试剂盒，观察11株阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶的种类及酶活性。结果11株阿萨希毛孢子菌中9株磷脂酶活性较强，2株酶活性弱；均未测得酸性蛋白酶分泌。AIP—ZYM试剂盒显示11株菌有共性分泌酶，也有部分菌株有特异性分泌酶。结论阿萨希毛孢子菌细胞外分泌酶种类多样，不同来源菌株产酶种类及酶活性亦不相同。     

性伴间淋球菌的opa分型及Ng-MAST基因分型

目的 评价淋球菌opa分型及Ng-MAST对淋球菌分离株进行基因分型的能力，分析性伴分离淋球菌基因型别之间的关系。方法 本研究中24株淋球菌野生株于2006年2月至2007年8月从华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科门诊分离获得，经Thayer Martin（T-M）培养基选择分离培养后通过革兰染色和氧化酶试验等方法确证。PCR扩增其opa基因以HpaⅡ酶切及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色分析，并用NG-MAST方法从分子水平上进行基因分型。结果 24株野生株淋球菌中，Ng-MAST区分出 10 种ST型，而使用opa分型则呈现 12 种OT型；新发现的ST（217-86%同源178）是国内特有的流行株。结论 淋病患者-性伴组除了45/46之外，每对菌株的ST型及OT型均相同，表明患者与性伴相互接触传染。淋球菌opa分型能力高于Ng-MAST，ST型别可进一步的分成opa-types （OT）亚型。     

南京地区1999-2004年四环素高度耐药淋球菌tetM基因分型及流行研究

目的 了解南京地区四环素高度耐药淋球菌(TRNG)tetM基因的分子流行病学情况.方法 采用琼脂稀释法检测菌株是否为TRNG,采用纸片酸度定量法测定菌株是否产β-内酰胺酶.采用单管PCR方法对TRNG阳性菌株作tetM基因分型.结果 1999-2004年间南京地区804株淋球菌中共检出136株(16.92%)TRNG,β-内酰胺酶阳性的淋球菌(PPNG)为290株,所有TRNG中69.85%(95/136)为PPNG/TRNG,TRNG的阳性率逐年增高.tetM基因分型结果显示,荷兰变型为135株,美国变型仅1株.结论 南京地区流行的TRNG以荷兰型tetM基因为主(99.26%),美国型仅为偶发.