检测血清p185糖链凝集素酶联免疫吸附试验的建立及初步应用

目的 建立检测血清p185糖链的凝集素酶联免疫吸附试验（ELISA），并初步应用于乳腺癌的临床诊断。方法 用改良过碘酸钠氧化法制备c—erbB-2单克隆抗体-辣根过氧化物酶结合物（A18-HRP），经棋盘滴定确认A18-HRP、生物素化麦胚凝集素（Bio—WGA）及链霉亲和素（SA）的最适浓度（或稀释度），建立了检测p185糖链的凝集素ELISA，用所建立的方法检测血清p185糖链，免疫组化方法检测组织p185蛋白表达。结果 乳腺癌患者血清p185糖链水平明显高于乳腺增生和正常对照（P〈0．01），免疫组化阳性和阴性的乳腺癌患者血清p185糖链水平均高于乳腺增生和正常对照（P〈0．01），乳腺增生患者血清p185糖链与正常对照相比差异无显著性（P〉0．05）。血清p185糖链诊断乳腺癌的敏感度为86．7％，特异度为94，6％，准确度为91．9％。结论 本实验建立的凝集素ELISA检测血清p185糖链诊断乳腺癌与病理学诊断符合率高，临床具有实用价值。     

血清p185糖链检测在乳腺癌诊断中的应用

c-erbB-2是与乳腺癌关系最密切的一种癌基因，p185是其编码的跨膜糖蛋白受体，乳腺癌细胞中某些糖链加工酶基因表达改变，导致p185糖链结构改变，p185的胞外部分从乳腺癌细胞脱落。p185蛋白也可随着肿瘤细胞的崩解而释放入血。因此，检测血清p185糖链对乳腺癌的早期诊断及乳腺癌与乳腺良性增生的鉴别诊断具有重要价值。     

对应用酶联免疫吸附试验检测肝炎病毒血清标志物临界结果报告的探讨

肝炎标志物的检验大多采用免疫定性或半定量的检测方法.目前在国内的临床实验室中最常用的是酶联免疫吸附试验(ELISA).ELISA灵敏度高、特异性强、简便快速、成本低.该方法的结果报告以各商品试剂所设定的判断值(Cutoff值)为依据.由于ELISA有诸多影响检测结果的因素,因此其重复性较差.以乙肝表面抗原(HBsAg)为例,就一个低含量HBsAg标本结果而言,手工操作实验批内精密度(CV)可达15%[1],而实验批间的CV可高达25%～30%[2].仅此原因,有一部分处于Cutoff值附近的标本就会产生假阳性或假阴性的结果,这些结果可能会影响一些人的就业、升学和献血等,还会引发医患之间的纠纷.对这些临界结果的处理和报告,一直是困扰检验人员的一个问题.     

四种酶联免疫吸附试验试剂检测梅毒抗体的比较

目的评价国内常用的4种梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂的有效性,为临床选择梅毒诊断试剂提供依据。方法对180例临床血清分别进行快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）、梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）和4种试剂的ELISA（试剂分别为A、B、C、D）。以TPPA结果为参考对照,分别统计各ELISA试剂的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。结果 180例血清标本中,RPR阳性58例,TPPA阳性84例,两者均阴性95例。TPPA检测阳性率为46.67%（84/180）,A试剂为44.44%（80/180）,B试剂为45.00%（81/180）,C试剂为45.00%（81/180）,D试剂为28.33%（51/180）。D试剂与TPPA及其他3种试剂的检测阳性率差异有统计学意义（P均〈0.01）。D试剂的敏感性最差（57.14%）,而其他几种ELISA试剂的敏感性较好（94.05%~95.24%）。4种ELISA试剂的特异性均较理想（96.88%~100.00%）。结论个别国产ELISA试剂的敏感性差,提示在选择这类试剂时,应以质控血清进行预试验,使用符合要求的试剂。     

细胞酶联免疫吸附试验

免疫细胞表面表达有多种抗原或受体,如各种CD系列分子等,有的可作为临床实验室检定T、B细胞和CD细胞等参与免疫应答反应细胞的特异性标志,或用以研究细胞分子和粘附分子及其相应受体的变化,或用以探讨诸多表面分子参与免疫应答的机制,等等.     

细胞-酶联免疫吸附试验及其应用

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)问世数十年来,广泛应用于检测各种体液中的可溶性抗原或抗体.在传统的ELISA中,微孔板上包被的是可溶性的抗体或抗原,然而在免疫学研究和临床检测时,需要了解免疫活性细胞表面表达的特定分子以对细胞特性进行认定和分类,亦需测定抗某种细胞的抗体或评价某种细胞的功能,因而传统的ELISA中的包被物或受检物就要被替代,检测模式有所改变.1971年,Avrameas等[1]首次用酶标记抗体定量测定细胞表面的免疫球蛋白,又经数年的发展,形成了以细胞包被酶标板测定细胞表面特定分子的细胞-ELISA.近年来细胞-ELISA衍生出多种模式(方法),并筛选出适合细胞-ELISA的标记酶.目前已有多种成熟的细胞-ELISA的模式,并在检验医学中得到应用.     

酶联免疫吸附试验影响因素的分析

ELISA法以微孔板条为固相的测定模式,操作非常简单,其技术条件要点包括:试剂的制备,反应条件的选择和操作标准化.影响因素一般涉及到样本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面,其中任一步骤的不当都会影响测定结果,现分述如下.     

酶联免疫吸附试验检测假阳性结果分析

ELISA法对IgG IgM都有很好的检测能力，因其灵敏度高、价格低廉、操作方便、结果客观，在国内广泛应用。但在工作中遇到的最大问题是出现假阳性的问题，而大多数是由弱阳性反应引起的，这给医疗工作带来麻烦，甚至引起医疗纠纷。为避免假阳性结果的出现现将产生假阳性的原因分析如下。     

颗粒溶素酶联免疫吸附测定法的建立及临床初步应用

颗粒溶素（granulysin，GNLY）是脂结合蛋白-皂素样蛋白（saposin-like protein，SAPLIP）家族成员之一，具有广谱细胞毒活性，在抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。因此，对GNLY血清表达水平准确定量具有重要意义。本中心建立GNLY血清水平酶联免疫吸附测定（ELISA）法，并检测30名正常人及30例传染性单核细胞增多症（IM）患者血清GNLY水平，以进行不同疾病期比较分析，并探讨GNLY在感染性疾病诊断和临床实时监测中的应用价值。     

微阵列酶联免疫吸附试验在临床输血检测中的应用

目的探讨微阵列酶联免疫吸附试验（Array-ELISA）的临床应用价值。方法用ELISA和Array-ELISA同时检测150例样本的人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）、梅毒螺旋体抗体（抗-TP）和HBsAg,观察对比两种检测方法的结果。结果两种方法对150例样本的检测结果经卡方检验证明差异无统计学意义。除了HBsAg检测结果的总符合率为96.7%,其余指标检测结果的总符合率均为100.0%。结论Array-ELISA与ELISA试剂盒有极高的符合率,初步证明其可以满足临床输血前检测的要求。     

血清粗纤维调节素ELISA的建立及初步应用

以提纯的人胎盘粗纤维调节素 (Un)及兔抗人Un IgG ,建立血清Un的竞争抑制ELISA标准曲线 ,并检测了 6 0名正常人和 12 4例肝病患者。结果采用棋盘试验确定包被Un及其抗体的浓度 ,表明该法灵敏度为 5 μg/L ,回收率为 96 6 %～10 8 3% ,批内 CV为 7 5 % ,批间CV 为 7 9%。 6 0名正常成人血清Un含量为 71 14± 2 9 6 0 μg/L ,参考值范围为 11～ 130μg/L,慢性肝病患者Un含量显著高于正常人。提示此法稳定、可靠、特异 ,基本符合临床使用要求 ,可用于慢性肝病的诊断。     

表皮生长因子ELISA检测方法的建立及其在肿瘤临床的初步应用

目的建立表皮生长因子(EGF)酶联免疫检测方法,探讨其在临床常见肿瘤患者血清中含量的变化规律。方法采用EGF单克隆抗体包被酶标板、兔抗EGF多抗为二抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为酶标抗体,建立夹心法ELISA,检测临床常见肿瘤患者及健康体检人群的血清EGF含量。结果建立的EGF酶联免疫吸附法最小检测限为15.6ng/L,批内精密度8.7%,批间精密度11.6%,平均回收率94.7%,符合临床检测要求。血清EGF含量在31名正常人为(1.305±0.382)ng/ml;24例乳腺癌患者术前为(0.729±0.347)ng/ml,术后为(0.711±0.332)ng/ml;17例结直肠癌患者术前为(0.678±0.311)ng/ml,术后为(0.658±0.298)ng/ml;19例胃癌患者术前为(0.598±0.224)ng/ml,术后为(0.614±0.257)ng/ml。各肿瘤组患者血清EGF水平较健康对照组明显降低(P<0.01)。结论建立了适用于临床检测EGF的ELISA法,肿瘤患者血清中EGF含量较健康对照组明显下降,为进一步探讨肿瘤的发病机制提供了有效手段。     

荧光定量PCR检测血清微小RNA-21方法的建立及对乳腺癌诊断的初步应用

目的 建立一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,并初步探讨其对乳腺癌诊断的应用价值.方法 用Trizol试剂提取血清总RNA.用茎环引物将miR-16(作为miR-21内参基因)与miR-21分别逆转录成相应cDNA.再用SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR对cDNA进行扩增、检测.然后,通过信噪比(signal to noise ratio,SNR)分析试验的准确性;通过熔解曲线评价试验的特异性;通过标准曲线的R2评估试验的精确性;通过批内和批间差异计算试验的稳定性.另外,用自建方法检测33例乳腺癌患者、18例乳腺良性疾病和49名健康人群血清miR-21和miR-16水平,并根据乳腺癌组与健康对照组中miR-21相对表达量确定临界值,以评价其对乳腺癌诊断的敏感度、特异度.结果 通过PCR退火与延伸在温度和时间上的优化,本试验所建立方法SNR≥99.36％;熔解曲线为单峰;标准曲线R3=0.994 8;批内CV＜ 1.5％,批间CV＜ 4％.以miR-16为内参,用自建SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乳腺癌组、良性疾病组与健康对照组血清miR-21的相对表达量分别为20.83±18.18、20.86±10.11和9.33±4.44,经Kruskal Wallis检验,3组间表达量差异有统计学意义(x2=16.92,P＜0.001),且健康对照组与乳腺癌组、健康对照组与良性疾病组间的差异均有统计学意义(Z值分别为-2.58、-4.42,P均≤0.01),而乳腺癌组与良性疾病组血清miR-21表达量差异无统计学意义(Z=-0.51,P=0.608).以miR-21相对表达量18.32为临界值,其对乳腺癌诊断的敏感度为51.5％(17/33),特异度为93.9％(46/49).结论 建立了一种较敏感、特异、稳定的SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR检测血清miR-21方法,该方法对乳腺癌的诊断可能有一定价值.     

EB病毒感染实验室诊断方法探讨

目的探讨EB病毒(EBV)感染的实验室诊断方法。方法设计针对EBV基因组的引物和荧光标记探针,利用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测70例外周血标本。其中17例是确诊EBV感染及传染性单核细胞增多症患儿,27例是临床高度怀疑EBV感染患儿,26例是临床非EBV感染的患儿,并与检测EBV抗体VCA-IgM的酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较。结果确诊组、疑似组和对照组患儿FQ-PCR检测EBV的阳性率分别为100.00%、81.48%和0.00%。与此对应VCA-IgM的阳性率分别为100.00%、25.93%和0.00%。确诊组EBV DNA的平均拷贝数为1.15×105/m l,疑似组为4.38×104/m l,均明显高于对照组(P<0.05)。结论与VCA-IgM检测方法相比,FQ-PCR检测到EBV感染的阳性率更高,EBV DNA的定量检测可帮助诊断儿科活动性EBV感染,尤其是可疑患儿的临床诊断。     

抗瓜氨酸化聚合兔IgG抗体ELISA法的建立及初步应用

目的建立检测血清抗瓜氨酸化聚合兔IgG(citrullinated aggregated rabbit IgG,Cit-AgRIgG)抗体的ELISA方法,探讨其对类风湿关节炎(RA)的诊断价值。方法将兔IgG于62℃加热聚合变性,用肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD)将内含精氨酸催化生成瓜氨酸,制成瓜氨酸化聚合兔IgG(Cit-AgRIgG)。以此作为抗原,包被反应板微孔,建立检测抗Cit-AgRIgG抗体的ELISA方法。经方法学考核后,检测临床标本并对结果进行评价。结果 Cit-AgRIgG显示出与抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体有较高的结合活性。以其为包被抗原建立的检测抗Cit-AgRIgG抗体的ELISA法批内和批间平均变异系数分别为4.5%和9.5%。特异性阻断试验显示,Cit-AgRIgG、AgRIgG与CCP抗原对该抗体的最高抑制率分别为80.0%、65.9%和25.0%。抗Cit-AgRIgG与抗AgRIgG抗体的cut off值分别为0.565和0.459,此时RA患者抗Cit-AgRIgG抗体阳性率显著高于其他疾病和健康人对照组(P均0.01),其诊断RA的敏感性为79.3%,特异性为96.5%,阳性、阴性预测值分别为84.7%和95.1%,阳性、阴性似然比分别为22.66、0.215,Youden指数为0.758,ROC曲线下面积(AUCROC)为0.890。对RA和健康人对照者检查结果显示,抗CitAgRIgG与抗AgRIgG抗体(RF)总符合率97.7%,与抗CCP抗体总符合率91.7%。结论建立的检测抗Cit-AgRIgG抗体的ELISA法有良好的稳定性和特异性。抗Cit-AgRIgG抗体兼具RF与抗CCP抗体的双重特性,有可能发展成为RA疾病诊断和病情监测的一种新的参考指标。     

ELISA联合检测方法的建立及应用

目的在微孔板平台上建立多指标联合检测的方法,为急诊、门诊及基层等多种医疗机构提供1种新的血清学检测手段。方法本研究根据酶联免疫吸附法(ELISA法)原理,以卵泡刺激素(FSH)、泌乳素(PRL)、黄体生成素(LH)、生长激素(GH)为检测靶标,在自行设计的聚苯乙烯板孔上完成反应体系的优化,包括FSH、PRL、LH、GH包被抗体浓度及酶标抗体浓度,建立1种并行分析样品中多种指标的方法。结果成功确定4种垂体激素联合检测的条件,包括4种激素抗体包被浓度、酶标抗体浓度等,并成功应用于临床样本的检测。结论本研究首次建立了1种简单、特异性高、成本低、并行分析4种垂体激素的联合检测方法,提高了常规ELISA法的检测效率。     

血清精氨酸代琥珀酸裂解酶速率测定法的建立及初步临床应用

目的 建立适用于自动生化分析仪的血清精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)活性速率测定法,并进行方法学评价和初步临床研究.方法 根据ASL催化的化学反应,以及自动生化分析仪工作特点,建立特异性的偶联酶促反应体系,并对建立的方法进行方法学评价.共测定309例肝病患者、269例非肝病患者和40名健康人血清ASL和传统的肝病酶学指标ALT、AST活性.结果 建立了一种新的可在全自动生化分析仪上测定血清ASL活性的动力学方法.方法 学评价研究表明,本法的批内变异系数均值为4.0%,天间变异系数均值为5.9%,平均回收率是100.5%,在0～167.7 U/L间有良好的线性范围,最低检测限为0 U/L.干扰试验提示:胆红素<342 μmoL/L、常用抗凝剂在抗凝浓度内不会产生干扰,Hb>0.06 g/L时产生明显干扰.初步临床分析显示非肝病患者血清ASL水平与对照组间差异无统计学意义(q=0.027,P=0.979),而与ATL和AST间差异均有统计学意义(ALT:q=6.461,P=0.000;AST:q=6.481,P=0.000).结论 成功建立了适用于自动生化分析仪完成的ASL活性速率测定法,其有可能是一个较好的肝病实验诊断指标.     

生物素-链霉亲和素ELISA检测血清CTGF方法的建立及其初步应用

目的 建立生物素-链霉亲和素ELISA检测血清CTGF的方法(简称“系统ELISA血清CTGF法”),初步评估CTGF在诊断慢性肝炎(CHB)患者肝纤维化的临床价值.方法 用生物素化抗CTGF单克隆抗体和多克隆抗体建立生物素-链霉亲和素ELISA方法,测定CHB患者血清CTGF水平.264例CHB患者根据肝穿刺病理诊断...