细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）加反相杂交技术在细菌ＤＮＡ检测中的应用。方法以１６ＳｒＲＮＡ基因为靶序列，设计引物及寡核苷酸探针，采用ＰＣＲ法加反相杂交检测标准菌株及临床标本的细菌ＤＮＡ。结果对２４株不同标准菌株进行ＰＣＲ扩增，均出现３７１ｂｐ长度的ＤＮＡ片段，敏感性试验可检测出１０－１２ｇ的细菌ＤＮＡ，与人类基因组ＤＮＡ、真菌及病毒无交叉反应；２２例血培养阳性标本及４例脑脊液培养阳性标本均扩增出３７１ｂｐ长度ＤＮＡ条带，反相杂交法区分革兰阳性／阴性细菌与培养结果相符。结论１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ加反相杂交技术检测细菌ＤＮＡ，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为细菌感染的临床诊断提供了科学的依据     

多重PCR在幽门螺杆菌检测及分型中的应用

应用多重ＰＣＲ同时扩增１６ＳｒＲＮＡ和ｃａｇＡ基因来检测幽门螺杆菌感染及其分型。ＰＣＲ产物经ＤＮＡ序列测定证实为转异性扩增，敏感度为１０＾２ＣＦＵ／ｍｌ。４８株Ｈｐ菌株中，Ｉ型菌株（ｃａｇＡ＋）２６株（５４．２％）；５５０份胃粘液标本，Ｈｐ阳性（１６ＳｒＲＮＡ基因＋）２１６份（４７．５％），其中Ｉ型Ｈｐ１３９份（５３．３％）。     

聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以１６ＳｒＤＮＡ为靶序列,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－反向斑点杂交检测２５种分枝杆菌１１种分枝杆菌标准株、１２０株分枝杆菌临床分离株和２６份痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经ＤＮＡ扩增,分枝杆菌均出现５７８ｂｐＤＮＡ片段,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出１００ｆｇ结核分枝杆菌ＤＮ     

多重聚合酶链反应检测耐甲氧西林葡萄球菌

目的应用一种敏感快速的多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）,检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）和凝固酶阴性葡萄球菌（ＭＲＣＮＳ）。方法临床分离的北京地区金黄色葡萄球菌１２３株,ＭＲＣＮＳ１２２株,用溶壁素和蛋白酶Ｋ制备模板ＤＮＡ,设计葡萄球菌甲氧西林耐药的决定基因,金黄色葡萄球菌独有的一个辅助基因和细菌中均有的１６ＳｒＲＮＡ基因引物,通过多重ＰＣＲ技术对标本进行扩增。结果１２３株金黄色葡萄球菌的ｆｅｍＡ基因１００％（１２３／１２３）阳性,ｍｅｃＡ基因阳性的占１８．７％（２３／１２３）,１２２株ＭＲＣＮＳ的ｆｅｍＡ１００％（１２２／１２２）阴性,ｍｅｃＡ阳性的占２４．６％（３０／１２２）。１６ＳｒＲＮＡ基因片断在多重ＰＣＲ中作为内部参照避免了假阴性结果的出现。结论建立的多重ＰＣＲ技术检测ＭＲＳＡ和ＭＲＣＮＳ具有敏感、快速、特异的特点,是一种可靠的实验诊断手段。     

套式PCR快速诊断新生儿巨细胞病毒感染

套式ＰＣＲ用于检测新生儿及随访ＣＩＤ患儿白细胞及尿中ＨＣＭＶＤＮＡ。两对引物序列取自ＨＣＭＶＩＥＡ基因区，第一对引物扩增７２１ｂｐ片段，第二对引物扩增１６７ｂｐ片段，后者穴居于前者之中，结果３３例可疑新生患儿检出ＣＭＶ感染２１例，７例随访患儿中４例尿或血中仍有ＣＭＶＤＮＡ存在。ＰＣＲ与病毒分离相比，既快速又敏感，尿标本用于ＰＣＲ检测ＣＭＶＤＮＡ较之血本具有检出率高，标本采取及处理均简便的优点。     

聚合酶链反应-微孔板杂交技术用于结核分枝杆菌的检测

目的建立结核分枝杆菌的ＰＣＲ酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）方法，使ＰＣＲ结果判定更加客观。方法我们使用玻璃粉吸附提纯模板ＤＮＡ，将ＰＣＲ引物５′端标记生物素，用ＰＣＲ产物与微孔板中预先包被的克隆靶基因杂交，然后用酶标链霉亲和素与杂交体中的生物素结合，最后用酶底物与所标记酶进行显色反应，通过测定其吸光度来判断结果。结果所建立的ＰＣＲＥＬＩＳＡ检测法可提高检测的灵敏度和特异性。对５０份来自结核病人高度怀疑有结核分枝杆菌的标本检测表明，ＰＣＲＥＬＩＳＡ检出２２份阳性，比抗酸染色法（７／５０）、培养法（１３／５０）和ＰＣＲ电泳法（１８／５０）检出率高，而２０份证实无结核分枝杆菌的标本，几种方法检查均为阴性。结论该法可敏感、特异和客观地检测临床标本中的结核分枝杆菌。     

恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法,为快速、准确地定量检测恶性疟原虫奠定基础。方法 根据恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。将ＰＣＲ扩增的恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板用于标准曲线的制定和样品检测。结果 应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与反浓度具有良好的线性关系,相关系数为０．９９８。检测恶性疟血样     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

PCR检测外周血细胞中结核分枝杆菌核酸

ＰＣＲ检测外周血细胞中结核分枝杆菌核酸杨朝国陈川①张明清②（四川省卫生管理干部学院，成都６１００４１）关键词结核分枝杆菌核酸外周血聚合酶链反应检测结核分枝杆菌核酸的几种ＰＣＲ方法特异性和灵敏度均不相同〔１～３〕，用痰样品制备ＤＮＡ较麻烦，且常常是ＰＣ...     

两种DNA探针杂交检测结核分枝杆菌的研究

我们比较了结核分枝杆菌 (结核菌 )基因组ＤＮＡ及其聚合酶链反应 (ＰＣＲ)产物的灵敏度与特异性 ,并对结核病人痰标本进行了检测。一、材料和方法1 菌种来源 :2 4种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所 ,11种非分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。2 标本收集 :90份痰标本来自本院结核科住院病人 ,经Ｘ线检查、临床表现确诊。 30份非结核病人痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北京大学第三医院呼吸科住院病人。3 标本ＤＮＡ提取 :采用本室研制的标本前处理试剂盒。4 引物 :引物ａ :根据文献 [1]报道设计。扩增产物为35 0ｂｐ ,5′ ＧＡＡ…     

多重聚合酶链反应检测耐甲氧西林葡萄球菌

目的 应用一种敏感快速的多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）,检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）和凝固酶阴性葡萄球菌（ＭＲＣＮＳ）。方法 临床分离的北京地区金黄色葡萄球菌１２３株,ＭＲＣＮＳ１２２株,用溶壁素和蛋白酶Ｋ制备模板ＤＮＡ,设计葡萄球菌甲氧西林耐药的决定基因,金黄色葡萄球菌独有一个辅助基因和细菌中均为有１６ＳｒＲＮＡ基在引物,通过多重ＰＣＲ技术对标本进行放增。结果 １２３株金黄色葡萄球菌的     

应用限制性内切酶分析PCR产物快速诊断Hb CS基因突变

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）选择性扩增包括ＨｂＣＳ突变（ＴＡＡ→ＣＡＡ）位点在内的ａ２珠蛋白基因片段，利用与该点突变密切相关的天然Ｔｒｕ９１位点和由ＰＣＲ引物介导出和人工ＨｉｎｆＩ位点的变化可识别ＨｂＣＳ突变等位基因和野生型等位基因。ＰＣＲ产物直接经Ｔｒｕ９１或ＨｉｎｆＩ消化及电泳分析后即可对样品ＤＮＡ中是否存在ＨｂＣＳ空变及其基因型作出诊断。此法简便、省时，可用于基因筛查和产前诊断。     

在HeLa细胞中表达人βIVS-Ⅱ-nt 654C→T突变基因

目的：建立一个能表达人βＩＶＳ－Ⅱ－ｎｔ６５４Ｃ→Ｔ突变基因（β６５４基因）的ＨｅＬａ细胞模型。方法：应用长片段多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术从一例β６５４突变基因纯合子的基因组ＤＮＡ中扩增出β６５４基因全长片段，重组进ｐｃＤＮＡ３．１真核表达载体质粒中。经ＤＮＡ测序证明序列中确实含有β６５４突变后，将重组表达质粒用脂质体方法转化ＨｅＬａ细胞，用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测β６５４突变基因在转染细胞中表达的ｍＲＮＡ。结果：该重组表达质粒能在ＨｅＬａ细胞中转录β６５４突变基因，并剪接成正常和异常两种ｍＲＮＡ（对应于１８３ｂｐ和２５６ｂｐ两种ＲＴ－ＰＣＲ产物），而对照组无扩增条带出现。结论：重组表达质粒转化的ＨｅＬａ细胞能表达β６５４基因。     

O139霍乱弧菌的分子流行病学特征

利用ｃｔｘＡ，Ｚｏｔ，Ａｃｅ，ＲＳ１，ｓｔ和ｉｇａ等基因探针检测５７８株霍乱弧菌，发现其中１株埃尔托型霍乱弧菌和６株Ｏ１３９霍乱弧菌不含ｃｔｘＡ，进一步分析证明这７个菌株中，除１株含ＲＳ１序列外，其他毒力基因检测均为阴性，这为菌苗候选株的筛选提供了依据。用１６ＳｒＲＮＡ基因探针检测不同地区分离的６２株Ｏ１３９菌株和Ｏ－１群埃尔托型菌株，将其分为９个１６ＳｒＲＮＡ基因型。结合ｃｔｘＡ探针检测结果，认为我国流行的Ｏ１３９霍乱弧菌有两种类型，与印度、孟加拉国分离的菌株不尽相同。本文首次报导，通过１６ＳｒＲＮＡ基因检测，可区分Ｏ－１群埃尔托型霍乱弧菌与Ｏ１３９霍乱弧菌，并建议将ｃｔｘＡ、１６ＳｒＲＮＡ两个基因作为确定Ｏ１３９霍乱弧菌分子流行病学特征的指标。     

混合样品中微量SRY基因的毛细管电泳检测

目的建立一种灵敏度高、重现性好的检测混合样品中微量目的基因的方法。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增混合样品中微量男性ＤＮＡ的ＳＲＹ序列，分别通过琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳检测ＰＣＲ扩增产物，比较二者的检测灵敏度。结果毛细管电泳可检测到２０ｐｇ男性模板ＤＮＡ（相当于３～４个细胞中的ＤＮＡ含量）ＰＣＲ扩增产物总量的１／６００，琼脂糖凝胶电泳可检测到７４ｐｇ男性模板ＤＮＡ（相当于１３个细胞中的ＤＮＡ含量）ＰＣＲ扩增产物总量的１／３。毛细管电泳检测微量目的基因扩增产物的综合灵敏度是琼脂糖凝胶电泳的７５０倍。结论毛细管电泳灵敏度高、重现性好，与ＰＣＲ技术结合可广泛用于各种混合样品中微量核酸分子的检测。     

深红沙雷菌染色体DNA分子生物学特性研究

院内感染流行病学调查方法已由生物学迈进到分子生物学领域。选用ＨｉｎｄⅢ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇｌ Ｉ和Ｘｂａ Ⅰ限制性核酸内切酶，对某院心外科６名患者术后感染和呼吸机三通接头分离的深红沙雷菌（ＳＲ），分别进行染色体ＤＮＡ酶切图谱（ＲＥＡ）分析，并应用ＰＣＲ技术，从Ｅ．ｃｏｌｉ中分别扩增出１６ｓ、２３ｓ核糖体核糖核酸（ｒＤＮＡ）基因。以［α＾３２Ｐ］ｄＡＴＰ经缺口平移法标记探针ｒＤＮＡ为广     

16S rRNA基因在脑脊液细菌鉴定中的应用

脑脊液 (ＣＳＦ)病原菌的检测鉴定主要是通过培养和免疫学方法 ,但都存在明显的不足[1,2 ] 。目前 ,大多数致病菌的16ＳｒＲＮＡ基因都已测序完成 ,采用ＰＣＲ技术扩增 16ＳｒＲＮＡ基因 ,用于细菌的鉴别和分类 ,在脑脊液病原菌检测鉴定中的应用研究越来越多。本文就其近年来的应用作一综述。1　 16Ｓ　ｒＲＮＡ编码基因及其特点细菌中编码ｒＲＮＡ的基因是按 5′ 16Ｓ 2 3Ｓ 5Ｓ 3′方式排列的 ,由两个非编码的间隔区序列 (ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｓ ,ＩＴＳ)所分开 ,5ＳｒＲＮＡ、16ＳｒＲＮＡ、2 3ＳｒＲＮ…     

复合定量PCR检测谷胱苷肽—S转移酶和多药耐药相关基因mRNA表？…

用β－肌动蛋白（β－ａｃｔｉｎ）作内参照，设计不同扩增片段的谷胱苷肽－Ｓ转移酶（ＧＳＴ－π）和多药耐药基因（ＭＤＲ１）引物，建立同时定量检测ＧＳＴ－π和ＭＤＲ１ｍＲＮＡ表达水平的复合定量ＰＣＲ法。扩增条带光密度值用凝胶成像系统检测，基因相对表达水平用目的基因和β－ａｃｔｉｎ光密度比值计算。本法灵敏度高、重复性好，能作批量分析。室内Ｘ控制图可有效控制定量ＰＣＲ扩增和电泳质量，保证本法能检测出小于２倍     

人白细胞介素—10基因探针的制备及应用

本文应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出人ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ６１０ｂｐ基因片段，将此片段插入ｐＵＣ１８质粒中，经电泳检测和序列分析证实，扩增片段和发表序列一致酶切电泳回收纯化片段，地高辛随机引物标记，制备了ｈＩＬ－１０基因探针，应用斑点杂交检测了探针的灵敏度和特异性，结果表明该基因探针具有特异性强，灵敏度高，应用方便等特点，初步用于细胞系及ＥＢ病毒阳性的淋巴瘤组织中ｈＩＬ－１０ｍＲＮＡ表达的检测，所得结果     

通用引物聚合酶链反应一次检测4种疱疹病毒DNA

为了能一次分型检测４种疱疹病毒ＤＮＡ，防止漏诊，故采用在疱疹病毒高度同源序列ＤＮＡ聚合酶基因中设计一对通用引物的方法，对４种疱疹病毒（单纯疱疹病毒Ｉ型，ＩＩ型，爱泼斯坦巴尔病毒，人巨细胞病毒）ＤＮＡ进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切ＢａｍＨＩ或ＳｍａＩ酶切扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述４种病毒的聚合酶链反应（ＰＣＲ）法，敏感性和特异性试验表明，灵敏度可测到ｉｆｇＤＮＡ相当于６个病毒