恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的 建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法 将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH／pGEX—4T—1转化到宿主菌BL21，该GDH／GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达，经SDS—PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂／去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8mol／L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性，并通过浊度分析、非还原SDS—PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH／GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果 经SDS—PAGE分析表明，GDH／GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25％左右；浊度分析表明：稀释复性法优于其它两种方法，同时20mmol／L，Tris—HCI、1mmoH，EDTA、pH8．5及GSSG／GSH=1：10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件，其复性回收率可达90％以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论 通过稀释复性，二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH／GST融合蛋白。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。     

恶性疟原虫红内期同步化培养的实验观察

本文定时观察培养原虫感染率及环状体、滋养体和裂殖体等各期的比例,对国产山梨醇同步化处理原虫效果的某些影响因素进行了比较研究。结果发现,以去离子才配制的5％山梨醇溶液同步化效果较好,处理时间控制在25min为宜,第一次处理后40h追加处理一次同步化效果比较满意。起始感染率的高低并不影响山梨醇的处理效果。     

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的 探讨跨膜递送短肽--TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用.方法 以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比.结果 腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高.结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素.皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层.结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据.     

TAT蛋白转导结构域介导的BCR/ABL融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的　探讨HIV 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL(TATPTD BCR ABL)融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运和通过血脑屏障作用。方法　在大肠杆菌中表达PTD BCR ABL融合蛋白 ,经Ni NTA树脂亲合层析 ,纯化后的融合蛋白经小鼠尾静脉注射体内 ,用免疫组织化学方法对小鼠组织细胞内的PTD BCR ABL融合蛋白进行检测。结果　①表达和纯化了分子量为 2 3× 10 3的PTD BCR ABL融合蛋白 ;②在接受融合蛋白的小鼠肝、脾、肾及心肌组织的细胞内检测到了PTD BCR ABL融合蛋白 ;③接受融合蛋白的小鼠脑组织细胞中可以检测到融合蛋白的存在。结论　PTD可在体内介导较大分子量的融合蛋白进入组织细胞和通过血脑屏障 ,有望为利用外源性蛋白质进行细胞内治疗和中枢神经系统疾病的治疗提供一种新的工具     

恶性疟原虫红内期体外同步化培养实验观察

本文定时观察了用秋水仙碱处理体外培养恶性疟原虫后的红细胞感染率及环状体、大滋养体和裂殖体各期的比例,并与用山梨醇处理进行了比较。结果发现,秋水仙碱处理后疟原虫可维持2～3个生物周期的同步化发育,并且处理后的红细胞感染率可在14％以上。山梨醇处理后疟原虫可维持2个生物周期的同步化发育,最高红细胞感染率为7.7％。     

恶性疟原虫红内期在体外存活时间的实验观察

目的 观察恶性疟原虫红内期在体外存活时间，分析其培养虫血的感染活力。方法 采用Tragers等常规体外培养方法，待恶性疟原虫体外连续培养的原虫率达到15％～20％时，吸取含虫血于保存液置4℃贮存，以后每天吸取少量虫血培养，24h观察原虫生长情况。结果 恶性疟原虫血4℃贮存2d疟原虫减虫率80．6％，10d几乎为100％；11d已未发现疟原虫。结论 估算体外培养的恶性疟原虫红内期在体外4℃贮存，存活时间不超过11d。     

恶性疟原虫红内期的体外培养及其影响因素

液氮内保存的FCC—1株恶性疟原虫红内期用蜡烛缸—平皿法体外连续培养40天。疟原虫复苏后培养的第3天原虫密度开始上升.第11天达到最高峰,其中一皿的红细胞含虫率高达20.56%。影响恶性疟原虫体外培养的有关因素如RPMI—1640培养液,血清和红细胞,本文进行了讨论。     

恶性疟原虫红内期两个重要候选抗原的相互影响

目的:分析恶性疟原虫红内期2个疫苗候选抗原PfAMA-1(Ⅲ)和PfMSP1-19的相互关系.方法:用ELISA和竞争ELISA检测蛋白和抗体的反应,一些抗体用特定的蛋白进行预吸附.结果:PfMSP1-19蛋白能去除恶性疟疾患者血浆对PfAMA-1(Ⅲ)的反应,这种能力是剂量依赖的,完全去除需要高的蛋白浓度;PfMSP1-19蛋白也能去除兔抗PfCP-2.9血清、兔抗PfAMA-1(Ⅲ)血清、亲和纯化的兔抗PfAMA-1(Ⅲ) IgG对PfAMA-1(Ⅲ)的反应.结论:酵母表达的PfMSP1-19重组蛋白能吸附PfAMA-1(Ⅲ)特异抗体.     

一种基于HIV-1 TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

目的 探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因，建立高效的细胞内转导系统。方法 通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列，在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列，将经酶切、DNA测序鉴定正确的pETl4b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coli BL21（DE3）。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确，再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中，用荧光显微镜观察。结果 重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论 成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体，正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体，His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达。并具有明确的细胞内转导活性。     

CCK-8法检测疟原虫HGXPRT蛋白刺激对淋巴细胞的增殖作用

目的检测疟原虫HGXPRT蛋白刺激淋巴细胞的增殖效果. 方法以HGXPRT蛋白免疫小鼠后制备淋巴细胞,与相应刺激物共同培养后采用CCK-8法检测淋巴细胞的增殖情况. 结果不同浓度的HGXPRT对淋巴细胞的刺激效果不同,以5μg/ml时刺激增殖效果最好. 结论 HGXPRT对淋巴细胞具有增殖作用.     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠中的免疫特性

目的:探讨恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9在不同品系小鼠(BALB/ca、C57BL/6J、C3H/He、DBA/2J及昆明种)中的免疫原性和免疫反应特性.方法:以ISA720为佐剂,PfCP-2.9抗原皮下免疫5种品系小鼠3次,间隔3周.以ELISA检测免疫血清中特异性抗体的动态变化、IgG抗体亚型及对融合抗原各组分的抗体水平,以间接荧光抗体实验分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况.结果:5种品系小鼠均能产生针对PfCP-2.9的免疫应答,3次免疫后血清中特异性抗体滴度达105以上.PfCP-2.9所诱生的免疫血清不但能识别MSP1-19和AMA-1(Ⅲ)两个主要片段,而且能识别恶性疟原虫天然抗原.所诱导的4种IgG抗体亚型中,IgG1和IgG2a是免疫血清中主要的抗体类型.但特异性抗体水平及抗体亚型分布因遗传背景不同而异.结论:融合蛋白PfCP-2.9在5种不同品系小鼠中具有强的免疫原性,其抗体能识别疟原虫天然蛋白.     

Dynamin like protein 1 participated in the hemoglobin uptake pathway of Plasmodium falciparum

Background During the blood stage of malaria infection, parasites internalize in the host red blood cells and degrade massive amounts of hemoglobin for their development. Although the morphology of the parasite＇s hemoglobin uptake pathway has been clearly observed, little has been known about its molecular mechanisms. Methods The recombinant proteins from Plasmodium falciparum, dynamin like protein 1 （PfDYN1） and 2 （PfDYN2） GTPase domain, were expressed in E .coil and showed GTPase activity. By using a dynamin inhibitor, dynasore, we demonstrated the involvement of PfDYN1 in the hemoglobin uptake pathway. Results The GTPase activity of the two recombinant proteins was inhibited by dynasore in vitro. Treatment of parasite cultures with 80 μmol/L dynasore at the ring and early trophozoite stage resulted in substantial inhibition of parasite growth and in an obvious decline of hemoglobin quantum. Furthermore, reduced intracellular hemozoin accumulation and decreased uptake of the FITC-dextran were also observed, together with distinctive changes in the ultrastructure of parasites after the dynasore treatment. Conclusions Our results show that PfDYN1 plays an important role in the hemoglobin uptake pathway of P. falciparum and suggest its possibility of being a novel target for malaria chemotherapy.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟危重病例抢救治疗1例

在非洲加纳感染恶性疟病例回国后发病,患者以全身黄疸表现为主,就诊24h后出现意识障碍,几天的体温观察中均在37.8℃左右,血内原虫密度不高,血小板数值降低。经用青蒿琥酯注射液抢救治疗12h后患者清醒,24h后血内未查见疟原虫,血小板数值恢复正常。     

Sequence analysis and genotypes of glutamate rich protein of Plasmodium falciparum isolates from different malaria endemic areas in China

To sequence the gene encoding glutamate rich protein (GLURP) and identify the genotypes of geographically different Plasmodium falciparum (P. f ) isolates from China. Methods The gene of R2 repeat region of GLURP was amplified by nested polymerase chain reaction and cloned into T-vector. The nucleotide sequence of GLURP gene was determined by automatic sequencer (Dideoxy termination method) and analyzed by DNA Star software. Results At least 7different GLURPgenotypesranging from 600 bp to 1 500 bp were found in Yunnan and Hainan provinces. R2 region of GLURP gene consisted of several repeat units. Each repeat unit was composed of 19-20 residues which were shown to be highly conserved. GLURP gene was also size polymorphic due to differences in the number of repeat units, whereas the repeat sequence was conserved. Sequence analysis showed that DNA sequences and deduced amino acid sequences were highly homologous among the geographically dispersed isolates or various isolates from the same geographical region. No obvious differences were found in the GLURP gene sequences among geographically different isolates. Conclusion GLURP gene is highly structure conserved and size polymorphic, and so is useful in searching for malaria vaccine candidate antigen and developing a genotyping method for malaria research.     

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

目的：建立恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）基因转染伯氏疟原虫的模型．方法：将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm. DB./AB. AF. DB．用Bgl Ⅰ酶切线性化．伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测．结果：PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因．结论：成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础．     

恶性疟原虫PfRh5F2片段pTGub21b表达载体的构建及融合蛋白表达鉴定

目的克隆表达恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5(PfRh5)F2片段,并评价其抗原性。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pTGub21b中,构建PfRh5F2/pTGub21b原核表达载体。IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PfRh5F2/pTGub21b原核表达系统,并在大肠杆菌中可溶性高效表达,表达产物能被恶性疟患者血清识别,而重组抗原免疫鼠血清也能识别恶性疟患者血样中的相应抗原。结论恶性疟原虫PfRh5 F2片段在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。     

恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备

目的 通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8（PfAtg8）基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8（PfAtg8）的多克隆抗体,并验证其效价。 方法 体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行效价验证。 结果 PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100 000。结论 成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。