乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选

目的应用表达谱基因芯片技术，研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子DNA结合蛋白1(SBP1)反式调节基因，阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成SBP1基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增SBP1基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误。提取高质量的mRNA，逆转录为cDNA，进行cDNA芯片分析。在1152个基因容量的表达谱芯片的筛选中，发现有12个基因表达水平显著上调，6个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的：寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白，进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用，阐明其分子作用机制。方法：应用酵母单杂交体系，以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”，对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选，应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果：共获得了12个双阳性克隆，编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白，其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论：这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合，可能是作用于SPⅠ的反式作用因子，但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用，笔者正进行进一步的研究。     

乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(SHBs)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法 以我室构建的SHBs基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-SHBs共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果 pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-SHBs瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-TXNRD1p的7.4倍,是pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-empty共转染的2.5倍.结论 我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的SHBs蛋白可以上调TXNRD1的启动子活性.     

乙型肝炎病毒HBeAg上调S100钙结合蛋白A11基因启动子表达活性的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对S100钙结合蛋白A11(calgizzarin S100A11)启动子转录的激活作用。方法 以我室构建的HBeAg反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果为基础，利用生物信息学技术确定S100A11的启动子区域(S100A11-P)，聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11-P，克隆至真核报告载体PCAT3中，构建pCAT3-S100-p报告载体，以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性，并与pcDNA3．1(-)-HBeAg共转染HepG2细胞系，用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3-S100-P在HepG2细胞中能够指导CAT的表达；共转染实验中pCAT3-S100-P-pcDNA3.1(-)-HBeAg组CAT的表达活性是pCAT3-S100-P组的6．1倍。结论 我室克隆的S100A11启动子有顺式激活下游基因的活性，HBeAg具有对S100A11的反式激活作用。本实验进一步验证了我室利用SSH技术研究HBeAg反式激活作用的结果。     

精氨琥珀酸裂解酶及合成酶在人胃癌组织中表达的意义

目的 探讨精氨琥珀酸裂解酶(ASL)及精氨琥珀酸合成酶(ASS)mRNA在人胃癌组织中的表达.方法 收集胃癌组织15例及相应癌旁正常组织12例,采用RT-PCR方法分别检测其中ASL及ASS mRNA的表达,了解胃癌组织与癌旁正常组织中可能存在的ASS及ASL表达差异.结果 胃癌组织中ASS mRNA的表达低于正常组织,具有统计学差异(P<0.05);但ASL的表达与正常组织相比无显著性差异.结论 胃癌组织中ASS mRNA表达水平下降,提示了精氨酸耗竭原理用于胃癌治疗的可行性.     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白下调诱导型一氧化氮合酶基因启动子的转录活性

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(pre-S2)蛋白对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子转录的调节作用。方法利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域(iNOSp)和3个缺失突变体的基因序列,聚合酶链反应(PCR)分别扩增iNOSp和3个缺失突变体的基因序列,分别克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-iNOSp载体;以构建的这4种报告基因表达载体,分别转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果成功获得iNOS基因启动子和3个缺失突变体的正确克隆,p1-iNOSp、p3-iNOSp启动子和pcDNA3.1 (-)-HBV pre-S2瞬时共转染HepG2细胞时,iNOS启动子的转录活性明显下降,HBV pre-S2蛋白对p1- iNOSp、p3-iNOSp表达活性的抑制率分别是54.7%和79.5%,p2-iNOSp、p4-iNOSp与pcDNA3.1(-)-HBV pre-S2共转染HepG2细胞后,HBV pre-S2蛋白对p2-iNOSp、p4-iNOSp表达活性没有明显的调节作用。重复试验得到了相似的结果。结论HBV pre-S2蛋白在细胞内的表达对iNOS启动子的转录活性具有明显的下调作用。     

乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响

乙型肝炎病毒核心启动子 (ＣＰ)部分缺失变异已证实在几种ＨＢＶ感染的临床现象中存在[1 3 ] 。我们在一组 14例血清抗 ＨＢｅ阳性的无症状携带者中 ,发现有 9例在ｎｔ174 8(或ｎｔ174 7)至ｎｔ176 7间 2 0 (或 2 1)个核苷酸的缺失 ,此 9例中有 5例合并有ｎｔ1896Ｇ→Ａ点变异[4] 。本研究在此基础上 ,拟构建这种ＣＰ 2 0 / 2 1ｂｐ缺失及合并存在Ａ1896点变异的ＨＢＶ全基因重组真核表达载体 ,并转染ＨｅｐＧ2细胞 ,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响。一、材料与方法1 材料 :ＥＢＯ ｐｐｌｐ质粒由美国Ｓｃｒｉｐｐｓ研究所Ｆｒａｎ…     

10-23脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的在细胞水平上探讨10-23脱氧核酶（10—23DRz）成为新型乙型肝炎基因治疗药物的可能性。方法设计合成针对乙型肝炎病毒（HBV）ayw1亚型前C／C区的2031位点的1023DRz，并对其进行硫代磷酸化修饰，同时针对该位点设计一条未硫代化修饰的10—23DRz，经脂质体转染HePG22．2．15细胞（简称2．2．15细胞）中观察其对HBV基因表达的抑制效应。结果修饰与未修饰的1023DRz作用于2．2．15细胞后均可显著抑制乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）的表达，最高抑制率分别可达93．75％和90．26％，有效抑制持续时间可达96h，修饰后的脱氧核酶在细胞内对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用时间长于未修饰的DRz，其抑制率的最高值低于未修饰的DRz，但两者明显高于作为对照的反义脱氧寡核苷酸。对2．2．15细胞内HBVDNA复制无明显影响，未见明显的细胞毒性作用。结论经过硫代化修饰的1023DRz和未修饰的l023DRz在2．2．15细胞模型中能高效阻断HBVDNA的表达，是一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。     

乙型肝炎表面抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的研究

目的 研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠及其病毒清除作用。方法 将小鼠随机分为8组,分别注射以下质粒:A组pcDNA3.1-S 100μg;B组:pcDNA3.1-GM-CSF-S 100μg;C组:pcDNA3.1-S-GM-CSF 100μg;D组:pcDNA3.1-S 50μg pcDNA3.1-GM-CSF 50μg;E组:pcDNA3.1-GM-CSF 100μg;F组:重组酵母乙型肝炎疫苗1μg;G组:pcDNA3.1 100μg;H组:磷酸盐缓冲液(PBS)100μl。于质粒注射前4d肌肉注射0.25％bupivacaine溶液100μl,诱导骨骼肌细胞变性。以HBsAg和GM-CSF的融合乙型肝炎表达质粒免疫HBV转基因小鼠,检测HBV转基因小鼠血清HBsAg表达水平及肝细胞HBsAg的表达,检测脾细胞白细胞介素(IL)-2、IL-4及γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平及淋巴细胞增殖情况,并进行肝组织学检查。结果 质粒加强免疫4周后血清HBsAg检测结果A组为28.28±15.32、B组为10.77±9.18、C组为44.16±8.30、D组为21.93±13.28、E组48.04±3.60、F组为38.3±11.66、G组为47.03±3.96、H组为51.46±4.70,F=11.262,P<0.01,其中B组血清HBsAg滴度显著低于其余各组。IL-2分泌水平(pg/ml)A组为25.5±7.5、B组为48.5±11.3、C组为4.0±2.5、D组为38.0±8.5、E组为3.7±2.1、F组为6.5±23.     

商陆抗病毒蛋白体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，PAP）是从美洲商陆种子或叶子中提取的一种碱性蛋白，具有抑制流感病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、HIV等多种病毒复制的作用。我们先前的研究发现：天然PAP种子体外直接作用于HepG2．2．15细胞，显示有较强的抗HBV作用，但在高剂量时对细胞有一定毒性。本研究旨在探讨PAP真核表达质粒体外对HBV的抑制作用。[第一段]     

弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究I．pcDNA3-HBsAg—GRA1真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3-HBsAg—GRA1真核表达质粒,为提高弓形虫DNA疫苗保护性做出新的探索,并期望“-／ -苗两用”。方法 采用PCR分别扩增HBsAg、GRA1;经BclI、EcoRⅠ双酶切HBsAg;EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切GRA1;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切载体pcDNA3．0;HBsAg、GRA1、pcDNA3．0双酶切纯化产物与T4DNA连接酶在22℃连接过夜,用双酶切及双脱氧末端终止法测序鉴定重组质粒。结果 成功构建pcDNA3-HBsAg—GRA1真核表达质粒。结论 为进一步研究pcDNA3-HBsAg—GRA1诱导的保护性免疫奠定了基础。     

乙型肝炎病毒感染上调2.2.15细胞系程序性死亡分子配体表达的研究

目的 研究程序性死亡分子配体在HepG2和2.2.15细胞表面的表达及其与HBV感染的关系.方法 2007年3月至7月于北京大学第一医院分别培养HepG2细胞和2.2.15细胞,用荧光素标记的抗程序性细胞死亡分子配体-1、2(PD-L1、PD-L2)特异性抗体标记,行流式细胞仪检测;同时提取细胞核糖核酸(RNA),用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PD-L1和PD-L2 mRNA的表达.结果 PD-L1在2.2.15细胞的表达显著上调;无论是膜蛋白质或是mRNA形式,PD-12在HepG2细胞和2.2.15细胞均不表达.结论 HBV感染导致肝细胞表面程序性死亡分子的配体表达上调,提示与病毒免疫逃避有关.