蛋白酪氨酸磷酸酶-3对结肠癌细胞表皮生长因子相关信号通路的调节

【摘要】〓目的〓观察蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)在结肠癌LoVo细胞中对表皮生长因子(EGFR)相关信号通路的调节作用。方法〓转染PRL-3的LoVo细胞(以下简称LoVo-P)及对照组LoVo细胞(以下简称LoVo-C)48 h后,通过Western blot检测LoVo细胞PRL-3蛋白表达,并检测EGFR及相关信号MEK-ERK通路蛋白p-MEK1/2,p-Erk1/2,p-Msk1/2的表达。结果〓Western-Blot检测发现高表达PRL-3的LoVo细胞能够激活EGFR磷酸化水平,蛋白灰度分析显示其表达增多72.3%(P<0.01)。并且转染PRL-3后LoVo细胞的MEK-ERK通道被激活。结论〓PRL-3通过激活细胞表皮生长因子磷酸化参与表皮生长因子相关信号通路的调节。     

蛋白酪氨酸磷酸酶-3通过诱导肿瘤性巨噬细胞钙离子依赖性钾离子通道表达增强LoVo细胞侵袭性

目的 观察结肠癌肿瘤微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞(M2)相互作用及对肿瘤细胞功能学的改变.方法 将转入蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)的LoVo细胞和M2细胞模拟肿瘤微环境进行共培养,通过Western blot检测M2细胞钙离子依赖性钾离子通道(KCNN4)蛋白表达,并检测LoVo细胞侵袭性的改变.结果 Western blot检测示PRL-3能通过共培养后诱导M2细胞KCNN4蛋白表达升高,而未作共培养的M2细胞KCNN4蛋白表达未升高.此外,经过共培养后LoVo细胞侵袭性升高(3367±135比1442±89,P＜0.05),而在阻断KCNN4蛋白表达后,LoVo细胞侵袭性降低(1388 ±87比2893±163,P＜0.05).结论 PRL-3在结肠癌肿瘤微环境中通过提高KCNN4表达从而增强LoVo细胞的侵袭性.     

白细胞介素6促胆囊癌细胞增殖、侵袭与JAK/STAT3信号通路的关系

目的:探讨炎症因子白细胞介素6(IL-6)对胆囊癌细胞生物学行为的影响及其与JAK/STAT3信号通路的关系.方法:将胆囊癌细胞株GBC-SD用IL-6或IL-6+AG490(JAK/STAT3通路抑制剂)作用后,分别用MTT法检测增殖情况;Transwell法检测侵袭能力;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)活性;Western blot法检测磷酸化STAT3(p-STAT3)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果:IL-6(10,50,100 ng/mL)作用后,GBC-SD细胞增殖呈浓度依赖性增加(均P＜0.05),AG490能取消IL-6对细胞增殖的促进作用.IL-6作用GBC-SD细胞后,细胞侵袭能力及MMP-9的分泌明显增加(均P＜0.05),细胞p-STAT3和VEGF的表达明显上调,加入AG490后,以上作用均被取消.结论:IL-6能促进胆囊癌细胞的增殖通和侵袭,其作用可能与其活化JAK/STAT3信号通路,从而上调下游的MMP-9和VEGF的表达有关.     

肝再生磷酸酶-3和微小RNA17-92家族成员在结肠癌细胞中异常表达的意义

目的 探讨肝再生磷酸酶-3(PRL-3)和微小RNA17-92 (miR-17-92)家族成员在结肠癌中异常表达的意义.方法 构建稳定转染PRL-3基因和空白对照质粒的结肠癌细胞株LoVo-PRL-3和LoVo-VC,用MicroRNA芯片筛查表达异常的促癌microRNA,从中选取miR-17-92家族成员miR-17、miR-19a行荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)进行验证.在LoVo-PRL-3细胞中对STAT3信号传导与转录激活因子-3(STAT3)进行RNA干扰,检测miR-17、miR-19a的表达,在稳转细胞株中转染miR-17、miR-19a或对其进行敲除,用细胞计数试剂盒(CCK-8)、Tanswell试验对细胞增殖侵袭能力的变化进行研究.在13例患者结肠癌原发灶、转移灶及癌旁正常组织中行免疫组织化学及qRT-PCR检测PRL-3、pSTAT3和miR-17、miR-19a的表达.结果 在结肠癌细胞株LoVo-PRL-3中miR-17、miR-19a的表达明显上调(P＜0.05),干扰STAT3可以抑制miR-17、miR-19a的表达.在LoVo-VC细胞中过表达miR-17、miR-19a促进了细胞的增殖(P＜0.05及P＜0.01)和侵袭(P＜0.01),而在LoVo-PRL-3细胞中敲除miR-17、miR-19a抑制了细胞的增殖侵袭(P＜0.05).在结肠癌组织中PRL-3、pSTAT3和miR-17、miR-19a的表达呈正相关.结论 PRL-3通过上调miR-17、miR-19a的表达在结肠癌细胞增殖侵袭中起到促进作用.     

肝再生磷酸酶-3上调转化生长因子-beta促进结肠癌LoVo细胞侵袭的机制研究

目的 探讨转化生长因子-beta(TGF-beta)通路在肝再生磷酸酶-3(PRL-3)促进结肠癌细胞侵袭和转移中的作用机制。方法 酶联免疫吸附试验ELISA检测实验组与对照组结肠癌细胞TGF-beta水平表达差异,Transwell侵袭小室法检测Lo Vo细胞侵袭能力变化,Western blot检测相关通路蛋白水平变化。结果 ELISA实验检测结肠癌细胞转染PRL-3后,稳定表达PRL-3的Lo Vo细胞(Lo Vo-P)与对照组(Lo Vo-C)相比,TGF-beta表达明显升高(114±11 pg/m L比56±8 pg/m L,P0.01)。Transwell侵袭实验提示不同浓度的TGF-beta中和抗体(1、10、100 ng/m L)作用Lo Vo-P后其侵袭能力逐渐降低,对照组穿膜细胞数为142.7±11.3个,实验组分别为96.1±8.2、67.3±9.4、48.6±6.4个(P0.05)。蛋白印记实验提示PI3K/AKT信号通路参与了其诱导侵袭的过程,使用PI3K抑制剂LY294002(10 mg/m L)后,Lo Vo-P的AKT磷酸化蛋白的表达水平降低2.5倍(P0.05)。结论 PRL-3能诱导结肠癌Lo Vo细胞分泌TGF-beta,激活PI3K/AKT信号通路进而促进结肠癌Lo Vo细胞侵袭。     

肿瘤相关巨噬细胞对肾癌细胞增殖的影响及其相关机制

目的探讨肿瘤相关巨噬细胞对肾癌细胞增殖的影响及其相关机制。方法通过十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA)、细菌内毒素(LPS)、干扰素-γ(IFN-γ)刺激人单核细胞白血病细胞系THP-1, 建立肿瘤相关巨噬细胞(TAM)模型。TAM模型与肾癌细胞(ACHN、786-O细胞)在体外共培养, 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TAM培养上清液细胞因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的变化;采用MTT法检测TAM上清和TAM上清联合IL-6中和抗体托珠单抗处理后肾癌细胞增殖情况;采用蛋白质印迹法检测肾癌细胞与TAM和TAM联合托珠单抗共培养后乳酸脱氢酶A(LDHA)的表达。使用TAM上清液培养LDHA基因过表达及干扰的肾癌细胞(ACHN、786-O细胞), 采用MTT法检测细胞增殖情况, 并计算相对增殖率。结果 80 ng/ml PMA联合20 ng/ml LPS、20 ng/ml IFN-γ可诱导THP-1细胞分化成TAM, 其细胞表面标志物CD68表达率为(36.2 ± 4.5)%。将TAM与ACHN细胞共培养, ELISA检测结果提示...     

RNA干扰沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因对结直肠癌细胞基质金属蛋白酶2和9表达的影响

目的 探讨促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)基因对结直肠癌细胞侵袭的影响和可能机制.方法 应用PRL-3基凶小干扰RNA(siRNA)转染处理结直肠癌细胞系HCT116后,分别采用实时定量PCR和Western印迹检测PRL-3基因和基质金属蛋白酶家族(MMP)-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平;分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力;其次,将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察其在体内生长情况.结果 体外实验结果显示,PRL-3 siRNA可有效抑制结直肠癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关(P＜0.05,P＜0.01));转染组细胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平明显下调(P＜0.05).体内实验结果显示,对照组裸鼠组织癌细胞侵袭横纹肌和血管,而转染组未见这些现象.结论 采用PRL-3siRNA转染可抑制结直肠癌细胞侵袭,其机制可能与下调MMP表达有关.     

NF-κB抑制剂对前列腺癌PC-3细胞STAT3核转位的影响

目的:观察IL-6刺激后的前列腺癌PC-3细胞STAT3和NF-κB的表达情况;验证NF-κB抑制剂咖啡酸苯乙基酯(CAPE)对PC-3细胞IL-6和STAT3表达的影响。方法:20 ng/ml IL-6分别作用于PC-3细胞0、5、10、20、30、45 min后,Western印迹和实时荧光定量PCR检测STAT3和NF-κB蛋白和mRNA水平的表达差异;流式细胞技术检测细胞周期。采用TNF-α或TNF-α联合CAPE作用于PC-3细胞,收集培养液上清,ELISA检测IL-6的表达;同时用Western印迹检测p-STAT3的表达。结果:IL-6刺激PC-3细胞后,p-STAT3蛋白的表达明显上调,细胞增殖指数明显增高。TNF-α作用于PC-3细胞后,培养液中IL-6的表达上调,同时p-STAT3蛋白的表达亦上调(P<0.05)。CAPE联合TNF-α作用于PC-3细胞后,培养液中IL-6的表达及p-STAT3蛋白的表达均明显低于TNF-α作用后的表达水平(P<0.05)。结论:CAPE能抑制TNF-α引起的IL-6的分泌,从而抑制IL-6引起的STAT3核转位;通过CAPE抑制NF-κB表达,继而影响STAT3等相关细胞信号传导途径,可能成为前列腺癌治疗的一条新途径。     

甲壳素衍生物调控瘢痕疙瘩中TSG-6/PI3K/AKT通路表达的临床研究

目的：甲壳素衍生物调控瘢痕疙瘩中肿瘤坏死因子α刺激基因6(TSG-6)/磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/丝苏氨酸蛋白激酶-B(AKT)通路表达的作用。方法：选择2020年1月-2021年10月笔者医院接受手术切除的76例瘢痕疙瘩患者为研究对象，根据术前是否使用甲壳素衍生物分为甲壳素组（n=41）和对照组（n=35）。手术后，收集瘢痕疙瘩组织，采用免疫组化法检测增殖细胞核抗原（PCNA）的阳性表达率；采用TUNEL法检测细胞凋亡率；采用western?blot检测TSG-6、p-PI3K、p-AKT、鼠双微基因2(MDM2)、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、裂解型caspase-3(Cleaved?caspase-3)的表达水平；采用酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6的含量。结果：甲壳素组瘢痕疙瘩组织中PCNA阳性表达率、p-PI3K、p-AKT、MDM2、Bcl-2的表达水平、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量低于对照组（P<0.05），细胞凋亡率、TSG-6及Cleaved?caspase-3的表达水平高于对照组（P<0.05）...     

沉默PRL-3基因表达抑制胃癌生长研究

目的 探究miRNA干扰沉默PRL-4基因表达对胃癌生长的作用.方法 构建表达人工PRL-3 miRNA的慢病毒载体,转染SGC7901细胞并沉默其PRL-3表达;噻唑蓝(MTT)试验评价PRL-3在SGC7901细胞增殖中的作用;移植瘤生长试验评估其在胃癌生长中的作用.结果 与转染空载体组比较,转染PRL-3 miRNA的慢病毒载体可抑制SGC7901细胞的增殖.荷瘤动物实验表明,转染PRL-3组肿瘤大小为(1.92±0.18)cm3,转染空载体组为(4.74±0.39)cm3,两组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 沉默PRL-3表达可抑制胃癌SGC7901细胞的增殖,并抑制移植瘤的生长,可作为一种有潜力的抗肿瘤靶点.     

人外周血单个核细胞分泌细胞因子对α-1，3-半乳糖基转移酶基因敲除猪肝细胞的作用

目的研究异种肝细胞或肝移植中，活化的人外周血单个核细胞(h-PBMC)分泌的细胞因子对α-1，3-半乳糖基转移酶基因敲除猪肝细胞(GalT-KO-hep)的作用。 方法利用永生化GalT-KO-hep，与经脂多糖＋聚肌胞苷酸激活的h-PBMC共培养。生化分析检测共培养上清中白蛋白、ALT、AST和尿素水平，采用流式细胞术检测GalT-KO-hep凋亡，采用蛋白质印迹法检测GalT-KO-hep中Caspase-3剪切体表达以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)、核因子κB(NF-κB)、P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、信号传导与活化转录因子3(STAT3)和蛋白激酶B(AKT)通路相关分子的表达变化。采用方差分析比较不同刺激时间h-PBMC分泌的细胞因子mRNA相对表达量、共培养模型不同时间点上清液生化指标含量、GalT-KO-hep中Caspase 3剪切体表达量和细胞凋亡率，进一步两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。 结果GalT-KO-hep与活化h-PBMC共培养6 h组上清液中ALT含量高于共培养24 h和48 h组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；共培养48 h组AST含量高于共培养6 h和24 h组(P均<0.05)；共培养24 h和48 h组尿素含量均高于共培养6 h组(P均<0.05)。GalT-KO-hep与活化h-PBMC共培养24 h和48 h后，细胞中Caspase 3剪切体表达增加，细胞凋亡程度逐渐增加。与活化h-PBMC共培养0.5、1、6和12 h后，GalT-KO-hep磷酸化蛋白p-STAT3、p-JNK、p-IκBα、p-P38 MAPK、p-AKT和p-ERK(1/2)均被不同程度激活。 结论h-PBMC释放的细胞因子可诱导GalT-KO-hep损伤和凋亡，并促进炎症相关分子通路的激活。     

JAK2信号通路介导人恶性黑素瘤A375细胞的自噬和凋亡机制研究

目的:探讨JAK2/STAT3信号通路介导人恶性黑素瘤A375细胞的自噬和凋亡活性,为黑素瘤的发生机制和潜在干预靶点提供理论依据。方法:人恶性黑素瘤A375细胞经复苏和传代后随机分为对照组和JAK2抑制剂干预组,比较两组细胞培养12h、24h、48h和72h的增殖率(采用MTT定量法)及凋亡率(采用流式细胞术),培养72h的细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、LC3B和p-STAT3蛋白相对表达量(采用Western blot法),检测IL-6和TNF-α水平(采用ELISA法),检测Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量[采用反转录PCR(RT-PCR)法]。结果:两组培养12h、24h、48h和72h的细胞增殖率比较,干预组各时间点均明显小于对照组,而凋亡率明显大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。干预组培养72h的细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量、IL-6和TNF-α水平明显低于对照组,但LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:JAK2/STAT3信号通路异常激活可能是人黑素瘤A375细胞恶性增殖的重要通路之一,靶向干预JAK2/STAT3信号通路可以促进细胞自噬和凋亡活性上调,有望成为临床干预的重要靶点。     

IL-6/STAT3通路在冷缺血-再灌注损伤后胆管上皮细胞再生中的意义

目的 探讨白介素6/信号转导及转录激活因子3(IL-6/STAT3)通路在冷缺血-再灌注损伤诱导的胆管上皮细胞(BEC)再生过程中的意义.方法 将大鼠随机分为4组:对照组、CP 1 h组、CP12 h组(供肝分别冷保存1、12 h后行原位肝移植术)和anti-IL-6组(CP12 h组术前1 h给予抗IL-6中和抗体0.5 ms/kg,术后每日给予相同剂量直至观察结束).术后1、3、7、14 d,分别采用ELISA法、免疫组织化学法测定肝组织IL-6浓度及BEC再生情况;实时荧光定量PER法、Western blot法检测各组BEC内IL-6 mRNA以及磷酸化STAT3(p-STAT3)、细胞周期蛋白(cyclin)D1表达水平,测定血清碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)浓度,并进行肝脏组织学检查.结果 与对照组相比,CP1 h组术后IL-6、p-STAT3及cyclin D1表达水平略增加,血清GGT、ALP仅有轻度、短暂的升高,BEC损伤及再生均不明显.CP 12 h组术后BEC损伤严重,血清GGT、AIP明显升高,至术后14 d恢复正常,肝组织及BEC内IL-6含量增加、BEC内p-STA13和cyclin D1蛋白表达上调,BEC再生明显.经anti-IL-6中和抗体处理后,CP 12 h组IL-6以及p-STAT3和cyelin D1表达降低,BEG再生明显抑制,术后14 d仍可见细胞损伤及ALP、GGT的升高.结论 IL-6/STAT3信号转导通路可能参与缺血-再灌注损伤后胆管上皮细胞的再生过程,对肝移植术后的胆道功能恢复有利.     

中药复方鹿角胶丸通过PI3-K/AKT信号通路调节破骨细胞凋亡

目的探索中药复方鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡机制的实验研究。方法 RAW264.7细胞培养并传代,RANKL+MCSF诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化;MTS检测不同浓度的鹿角胶丸对破骨细胞增殖活性影响;倒置相差显微镜观察鹿角胶丸对破骨细胞形态学的影响;流式细胞仪检测鹿角胶丸及加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002后对破骨细胞凋亡的影响;Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3,Cleaved-Caspase-3、p-AKT、T-AKT的蛋白表达情况,以及检测加入LY294002后对凋亡通路蛋白的影响。结果 MTS显示各个浓度的鹿角胶丸(LJJW高、中、低)均能抑制破骨细胞的增殖活性,其中以LJJW(中浓度)作用24 h后具有明显的增殖活性抑制作用。加入鹿角胶丸后,破骨细胞透光度下降,凋亡的细胞皱缩,漂浮于培养基中。流式细胞仪检测结果显示鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡,预处理LY294002后,鹿角胶丸的促破骨细胞凋亡作用受到抑制。免疫印迹结果显示,鹿角胶丸促进线粒体Bax表达,抑制Bcl-2的表达,同时促进Caspase-3的裂解。鹿角胶丸促进AKT磷酸化,加入LY294002后AKT的磷酸化受到抑制,预处理LY294002后鹿角胶丸的促AKT磷酸化作用被抑制。结论中药复方鹿角胶丸通过PI3K/AKT通路促进破骨细胞凋亡。     

Tumor-Associated Macrophage Correlated with Angiogenesis and Progression of Mucoepidermoid Carcinoma of Salivary Glands

Background   There is considerable controversy about whether tumor-associated macrophages (TAMs) promote or inhibit tumor progression. The present study examined the clinicopathologic significance of TAMs and their association with tumor angiogenesis, cell proliferation, and apoptosis in mucoepidermoid carcinoma (MEC). The potential effect of TAMs on cancer cells was also investigated. Methods  CD68, CD34, Ki-67, and vascular endothelial growth factor (VEGF)-A immunohistochemical staining and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) were applied to samples from 41 MEC patients. The biologic effect of macrophages on MEC cancer cells was examined in a co-culture system. Results  The proliferation index (PI) was 11.7 ± 5.9%, and the apoptotic index (AI) was 4.1 ± 2.3% in cancer patients. PI was significantly correlated with tumor grade, and the PI/AI ratio was significantly correlated with tumor size and stage. The distributions of intratumoral TAMs and microvessel density (MVD) were heterogeneous. TAM count associated strongly with tumor size, grading, and MEC staging. A greater intratumoral MVD was observed frequently in patients with large, intermediate/high-grade, and advanced-stage tumors. VEGF-A expression correlated significantly with tumor size and stage. MVD count was closely associated with TAM count and VEGF-A expression. Co-cultured cancer cells with macrophages increased migration and invasion ability of cancer cells. Co-cultured endothelial cells with cancer cells elevated VEGF-A expression, proliferation, and migration, and tube formation of endothelial cells. Conclusion  Our data suggest that TAMs play a tumor-promoting role in MEC. The TAM count, intratumoral MVD, and PI/AI ratio are potentially useful markers of progression in patients with MEC.