埃罗替尼和塞来昔布抑制胆管癌生长和血管生成

目的:观察表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂埃罗替尼与环氧合酶(COX-2)抑制剂塞来昔布对胆管癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长协同抑制作用。方法:联合EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-selective tyrosine kinaseinhibitor,EGFR TKI)埃罗替尼和COX-2抑制剂塞来昔布作用于胆管癌细胞株QBC939荷瘤裸鼠,评价药物体内作用效果。结果:埃罗替尼、塞来昔布联合用药显著抑制肿瘤生长,与对照组、埃罗替尼、塞来昔布单药组相比,均有显著性差异。抑制肿瘤生长的作用伴随EGFR下游活性蛋白p-MAPK的下调和VEGF、Ki-67表达的降低。肿瘤组织微血管密度降低。结论:埃罗替尼、塞来昔布抑制胆管癌荷瘤生长,抑制肿瘤细胞增殖,同时抑制肿瘤新生血管。两者具协同作用。靶向抑制EGFR和COX-2通路可以作为胆管癌的潜在治疗方法。     

塞来昔布(celecoxib)通过前列腺素E2途径影响胆管癌细胞株生长和凋亡

目的：研究塞来昔布（celecoxib)对环氧合酶－2（COX－2）高表达人胆管癌细胞系QBC939和COX－2低表达人胆管癌细胞系SK－Cha-1生长和凋亡的影响及其作用机制。方法：采用四唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖，光镜和电镜形态学观察，末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位酶标记法（TUNEL）计数细胞凋亡，流式细胞仪测定细胞周期，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测前列腺素E2（PGE2）含量。结果：塞来昔布抑制QBC939生长和诱导调亡，这种抗增殖作用能被PGE2拮抗；塞来昔布对结构性低表达COX－2胆管癌细胞SK－Cha-1无显著性作用。结论：塞来昔布通过PGE2途径抑制人胆管癌细胞生长和诱导凋亡。针对COX－2结构性高表达肿瘤塞来昔布可能是一种有效的化学治疗和化学预防药物。     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

尼美舒利对胆管癌QBC939细胞增殖的抑制作用

目的研究选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939细胞增殖的抑制作用。方法应用MTT比色法观察尼美舒利对QBC939细胞增殖的影响，细胞凋亡采用透射电镜及流式细胞仪检测，应用免疫组化法检测尼美舒利对QBC939细胞COX-2及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。结果尼美舒利呈时间、剂量依赖性抑制QBC939细胞的增殖，降低QBC939细胞COX-2和PCNA的表达，流式细胞仪检测结果显示，随药物浓度增加，细胞凋亡率显著增加，透射电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变。结论尼美舒利显著抑制QBC939细胞的增殖，诱导其凋亡，且呈时间、剂量依赖性，其机理可能与其下调细胞内COX-2蛋白表达有关。     

光动力疗法对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响

目的 研究血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative,HPD)介导的光动力作用(photodynamic therapy,PDT)对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人胆管癌QBC939细胞株,用不同浓度HPD处理,并用半导体激光治疗仪不同强度光照后,应用CCK8法检测PDT对QBC939细胞生长的相对抑制率.采用流式细胞术检测PDT作用前后QBC939细胞凋亡情况.应用RT-PCR检测PDT作用前后QBC939细胞中血管内皮细胞生长因子-C (VEGF-C)、环氧合酶-2 (COX-2)基因表达情况.用SP免疫细胞化学法测定PDT作用前后QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达情况.用ELISA法测定PDT作用前后QBC939细胞上清中VEGF-C、COX-2两种蛋白分泌情况.结果 HPD-PDT在体外能够抑制QBC939细胞生长,HPD 10 mg/L经5 J/cm2光照强度时,实验组与空白组A值差异有统计学意义(P＜0.05),细胞生长抑制率达到70％.继续增加药物浓度或光照剂量,差异无统计学意义,细胞存活率降低不明显.流式细胞术显示HPD-PDT明显促进QBC939细胞早期凋亡.RT-PCR显示HPD-PDT能明显抑制QBC939细胞中VEGF-C、COX-2基因表达.SP免疫细胞化学法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达.ELISA法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞VEGF-C、COX-2两种蛋白细胞外分泌.结论 HPD-PDT能抑制胆管癌QBC939细胞生长,促进胆管癌细胞早期凋亡.HPD-PDT对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过促进早期凋亡实现的,而VEGF-C、COX-2从基因到蛋白水平低表达可能是促进胆管癌QBC939细胞早期凋亡的途径.     

阻断Hedgehog信号通路可抑制胆管癌细胞QBC939的生长

目的 研究Hedgehog信号通路特异性阻断剂环靶明(cyclopamine)对人胆管癌细胞系QBC939增殖与凋亡的影响.方法 用MTT比色法检测环靶明对QBC939细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率.RT-PCR法分别检测环靶明处理前后PTCH1、GLI1、EGFR在QBC939中的mRNA表达及变化.Western blot检测环靶明处理前后PTCH1、GLI1、EGFR在QBC939中的蛋白表达及变化.结果 环靶明抑制QBC939细胞的增殖,其作用呈剂量和时间依赖性.经5、10、20 μmol/L的环靶明作用48 h后,QBC939细胞的凋亡率逐渐升高,明显高于对照组的凋亡率(P＜0.01).PTCH1、GLI1、EGFR的mRNA和蛋白均在QBC939中表达,环靶明下调QBC939的PTCH1、GLI1、EGFR表达.结论 阻断Hedgehog信号通路能抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,促进其凋亡.     

外源性IL-6对胆管癌细胞的抗凋亡作用及其对Bcl-2 mRNA的调控

目的观察外源性IL-6对胆管癌细胞系QBC939凋亡及对Bcl-2 mRNA表达的影响。方法用MTT法检测外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939的促增殖作用;通过annexin V/FITC和PI染色、流式细胞分析检测外源性IL-6对QBC939细胞凋亡的影响,RT-PCR测定Bcl-2 mRNA的表达。结果外源性IL-6能刺激QBC939细胞增殖,且QBC939细胞增殖与IL-6浓度呈正相关(r=1);外源性IL-6处理后,凋亡率显著低于对照组(P0.05),外源性IL-6处理细胞后Bcl-2 mRNA显著高于对照组(P0.05)。结论外源性IL-6在一定剂量范围内促进QBC939细胞生长,并抑制QBC939细胞凋亡;而此作用可能与上调Bcl-2 mRNA表达有关。     

塞来昔布联合顺铂对SGC-7901人胃癌细胞凋亡及Bcl-2表达的影响

目的:探讨选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布联合顺铂对SGC-7901人胃癌细胞生长、凋亡及Bcl-2表达的影响.方法:终浓度为100、200及300 μmol/L的塞来昔布作用于SGC-7901入胃癌细胞24 h后加入顺铂(2.0 μg/mL),采用M开比色法测定细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及Bcl-2表达水平.结果:不同浓度的塞来昔布对SGC-7901人胃癌细胞均有抑制作用,抑制率与对照组相比.差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞学检测到凋亡峰,细胞阻滞于G0/G1期.同时伴随Bcl-2表达水平下降,其抑制作用呈时间-剂量依赖性,且以上抑制作用与顺铂具有协同作用.结论:塞来昔布能促进顺铂诱导胃癌细胞凋亡,进而抑制胃癌细胞的增殖,这可能是COX-2抑制剂抗肿瘤的机制之一.     

新维甲类化合物4HPR对人胆管癌细胞周期和凋亡的影响及可能机制

目的　探讨N hydroxyphenyl retinamide(4HPR)对人胆管癌细胞QBC939细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法　采用四甲基氮唑蓝实验 (MTT)、免疫组织化学染色、流式细胞术等技术 ,检测经 5× 10 -6mol/L 4HPR处理后 ,QBC939细胞生长增殖、细胞周期和凋亡的变化 ,以及对P2 1waf1、P2 7kip1、P5 3蛋白表达的影响。结果　 4HPR显著抑制人胆管癌细胞QBC939细胞的生长增殖 ,并呈时间、剂量依赖性。用 5× 10 -6mol/L 4HPR处理细胞后 ,细胞周期停滞于G1期。流式细胞术检测发现 ,4HPR处理 12h细胞凋亡率达 9 7% ,至 4 8h达 5 7 2 %。而P2 1waf1、P2 7kip1蛋白表达呈上升趋势 ,P5 3蛋白表达则无明显变化。结论　 4HPR具有抗增殖和诱导QBC939细胞发生凋亡的作用 ,并可导致细胞周期停滞于G1期。此种机制与其上调P2 1waf1、P2 7kip1蛋白表达有关 ,而与P5 3蛋白表达无关。     

1,25二羟维生素D3对胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的影响

目的 探讨1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2 D3]对胆管癌细胞系QBC939的体外增殖及凋亡的影响.方法 将不同浓度的1,25(OH)2 D3与胆管癌细胞系QBC939共同培养,采用MTT法测定细胞增殖能力、显微镜观察细胞形态学的改变、流式细胞仪检测细胞周期与凋亡、免疫细胞化学观察bcl-2的表达.结果 0.1～0.5μmol/L的1,25(OH)2 D3对胆管癌细胞QBC939有抑制作用,呈剂量依赖性.经1,25(OH)2 D3作用72h后细胞G1期比例升高,S期比例下降,其中0.5μmol/L组细胞G1期由(50.3±1.0)%上升至(65.5±3.2)%,S期由(39.4±0.5)%下降至(23.6±0.7)%;并且可诱导细胞产生凋亡,0.5μmol/L组作用后细胞凋亡率由0.5%上升至24.6%;bcl-2的表达下调.结论 1,25(OH)2 D3能抑制胆管癌细胞系QBC939增殖并诱导细胞凋亡,其引起凋亡的机制可能与下调bcl-2的表达相关.     

rhNIS基因转导胆管癌细胞介导125I摄取的研究

目的：探讨人钠/碘同向转运体(hNIS)基因cDNA转导至胆管癌细胞系QBC939细胞后的表达水平及其对介导125I摄取的影响。方法：将扩增出的hNIS基因cDNA序列克隆至pMD18-T载体;筛选后的亚克隆hNIS编码至真核表达型载体PDC316中,经脂质体途径导入胆管癌细胞（QBC939）,建立新细胞系(QBC939-A) 。同时设立空质粒(QBC939-B)转染和空白(QBC939-C)对照组。在体外培养条件下采用半定量RT-PCR检测各组2,3,6 d细胞内hNIS-mRNA表达水平和1,2,3,6 d的125I摄取情况。结果：建立了能稳定表达hNIS基因的新型细胞系QBC939-A。hNIS-mRNA表达水平检测显示,QBC939-A于3 d表达量达高峰,与QBC939-B和QBC939-C比较,有显著性差异（P<0.05）。且QBC939-A细胞的摄碘能力在转染后3 d达高峰,较QBC939-C高14倍,较QBC939-B高16倍。结论：rhNIS基因转导至胆管癌细胞足以在短期内介导125I的摄取,为介导125I靶向治疗胆管癌的研究奠定了基础。     

阿托伐他汀对人胆管癌QBC939细胞系增殖及侵袭的影响

目的 探讨阿托伐他汀(ATV)对人胆管癌QBC939细胞系增殖、侵袭的影响及其可能作用机制方法 应用细胞培养技术培养QBC939细胞,经不同浓度的阿托伐他汀处理后,以MTF法检测阿托伐他汀对QBC939细胞的杀伤抑制率,以Matrigel侵袭实验、迁移实验和半定量RT-PCR检测阿托伐他汀对QBC939细胞的侵袭、运动能力和对细胞内RhoC,MMP-9,p27 mRNA表达的影响情况.结果 阿托伐他汀可明显抑制QBC939细胞的生长及增殖,且其抑制作用呈剂量-时间效应关系:IC50为25 μmoL/L,最强抑制作用时间为48h.Matrigel侵袭实验及迁移实验显示,经10 μmol/L,25 μmol/L,50 μmoL/L药物干预48h后的QBC939细胞,随着浓度的增加,其体外侵袭、运动能力明显减弱(P＜0.05);半定量RT-PCR测定显示,阿托伐他汀作用48h后,QBC939细胞中p27表达含量明显增高、MMP-9的表达降低,而RhoC的表达改变并不明显.结论 阿托伐他汀可抑制人胆管癌QBC939细胞的生长增殖,并减弱其体外侵袭、运动能力.     

上调神经生长因子-β对人胆管癌细胞QBC939、生物学特性的影响

目的探讨神经生长因子-β上调对人胆管癌细胞QBC939增殖、凋亡、细胞周期及克隆形成能力等生物学特性的影响。方法构建稳定转染pEGFP-N1-NGF的QBC939细胞,上调神经生长因子-β的表达(高表达组),转染pEGFP-N1-NC组的QBC939细胞作为对照组。以Western blot方法检测细胞转染效果,细胞增殖实验(CCK-8实验)检测细胞增殖能力,单克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果在450nm波长下,24小时测得对照组QBC939细胞的吸光度值为0.409±0.014,高表达组细胞的吸光度值为0.691±0.029;48小时测得对照组QBC939细胞的吸光度值为1.612±0.044,高表达组细胞的吸光度值为2.033±0.005,其差异均具有统计学意义(P<0.05);200倍显微镜下观察,对照组直径大于500um的单细胞克隆数比例为10%,高表达组直径大于500um的单细胞克隆数比例为24%,统计学差异显著(P<0.01);对照组S期细胞数所占比例为(15.643±0.693)%,高表达组S期细胞数所占比例为(40.193±1.671)%,统计学差异显著(P<0.01);对照组细胞早期凋亡率为(15.76±0.97)%,高表达组细胞早期凋亡率为(8.82±0.93)%,具有统计学差异(P<0.05)。结论上调神经生长因子-β能够增强QBC939细胞的增殖与克隆形成能力,能够促进细胞进入S期,抑制细胞凋亡。     

RNA干扰降低环氧化酶2基因表达对人胆管癌QBC939细胞的体外作用

目的研究小干扰RNA（siRNA）降低环氧化酶2（COX-2）基因对胆管癌QBC939细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白表达的影响。方法采用RNA干扰的方法,将胆管癌细胞株QBC939细胞分为4组：COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体、空白对照组。将COX-2 siRNA转染入QBC939细胞;流式细胞仪检测siRNA降低COX-2基因表达对凋亡的作用,WesternBlot法检测siRNA降低COX-2基因表达对caspase-3表达变化的影响。结果 RNA干扰后QBC939细胞COX-2表达下降至空白对照组的42%,流式细胞仪检测结果显示COX-2 siRNA干预组细胞的凋亡率以及凋亡蛋白caspase-3的表达明显高于其他3个对照组。结论 RNA干扰可抑制细胞COX-2蛋白的表达,促使胆管癌QBC939细胞的凋亡,caspase-3途径可能是其调控通路之     

反义调控DNA甲基转移酶3b基因对人胆管癌细胞QBC939生长的影响

目的观察转染反义DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，初步探讨DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法构建反义DNMT3b基因真核表达质粒，用脂质体介导法将其转人人胆管癌细胞株QBC939；Western blot检测转染前后DNMT3b蛋白表达的变化；MTT法和软琼脂克隆形成试验观察细胞的生长增殖能力；流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果转染反义基因能使DNMT3b蛋白表达水平降低；转染反义DNMT3b基因不能抑制QBC939的生长曲线，对其软琼脂克隆形成率亦无影响（P=0．717）；转染反义DNMT3b基因不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡（P=0．089）。结论转染反义DNMT3b基因真核表达质粒可下调DNMT3b在QBC939细胞中的表达水平，但对QBC939的生长和增殖无影响，也不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡的发生。     

Bcl-2反义寡核苷酸对VP-16抑制人胆管癌细胞株增殖和诱导凋亡的影响

目的:探讨bcl-2 反义寡核苷酸（ASODN）对VP-16抑制人胆管癌QBC939细胞生长和诱导细胞凋亡的影响。方法:合成特异性靶向Bcl-2 ASODN，并将其转染QBC939细胞;四甲基噻唑蓝（MTT）试验检测Bcl-2 ASODN对VP-16抑制QBC939细胞增殖的影响;流式细胞术观察Bcl-2 ASODN对VP-16诱导QBC939细胞凋亡的影响。结果:ASODN组细胞的存活率显著低于无义寡核苷酸（NSODN）组(P＜0.05);ASODN+VP-16组细胞存活率显著低于ASODN组及VP-16组(P＜0.05);ASODN组、ASODN+VP-16组和VP-16组细胞凋亡率显著高于对照组和NSODN组（P＜0.05);ASODN+VP-16组细胞凋亡率显著高于ASODN组及VP-16组(P＜0.05)。结论:Bcl-2 ASODN对VP-16抑制人胆管癌QBC939细胞生长和诱导细胞凋亡有促进作用。     

Oddi括约肌成型术后患者胆汁促增殖活性的探讨

目的　观察经十二指肠Oddi括约肌成型术 (TS)后患者胆汁 (TSB)对人胆管癌细胞QBC 93 9生长的影响 ,探讨TS与胆管癌发生与发展的关系。方法　应用四唑蓝 (MTT)比色法检测 12份TSB和10份正常胆汁 (NB)对QBC93 9细胞增殖的影响 ,应用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。结果　TSB与NB比较 ,前者明显促进QBC 93 9细胞增殖 (P <0 .0 5 ) ;TSB处理 2 4h的QBC93 9细胞增殖指数显著上升 (P <0 .0 5 )。结论　TSB具有潜在的促增殖活性 ,TS与胆管癌的发生与发展关系密切。