PTX3对LPS诱导内皮细胞表达TF的影响

目的研究PTX3（pentraxin-3）对脂多糖（LPS）诱导内皮细胞表达组织因子（Tissue factor，TF）的影响及其相关机制。方法胰蛋白酶消化法原代培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），一期凝血法检测不同实验组TF促凝活性，酶联免疫吸附实验测TF抗原和反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测TF mRNA表达。结果与对照组比较，单独加入SAP、CRP和PTX3的M199培养基中HUVEC TF促凝活性、抗原和mRNA表达未见明显改变（P〉0．05）；当与LPS共同培养6h，每组HUVEC TF活性和抗原均明显升高（P〈0．05）。结论PTX3不影响内皮细胞TF促凝活性、抗原和mRNA表达，但参与LPS诱导的内皮细胞表达TF。     

3条硫代寡核苷酸的亲和性与内皮细胞吸收的比较研究

目的研究硫代寡核苷酸的亲和性及其在内皮细胞株的吸收与亚细胞分布。方法 利用电泳迁移分析法检测硫代寡核苷酸的亲和性;将同位素标记的硫代寡核苷酸与ECV304细胞直接孵化,24 F后测定内皮细胞的吸收率及亚细胞分布。结果3条硫代寡核苷酸(T21GTa、T14Gta及T15Gta)的亲和性(Kd值)分别为2.3×10-9、3.8×10-9及1.5×10-8(M).细胞吸收率分别为11.9％、10.8％、11.1％,核沉淀放射活性分别为77.25％、76.75％、69.32％。结论3条硫代寡核苷酸能够与内皮细胞TF基因SSRE的3个Egr-1/Spl位点结合,具有较好的透膜性、耐酶性及稳定性,能够透过内皮细胞膜和核膜,抵达核内靶基因部位。     

CD40-CD40配体相互作用对内皮细胞促凝活性的影响

目的: 探讨CD40-CD40配体(CD40L)相互作用对内皮细胞促凝活性的影响。方法: 建立内皮细胞与巨噬细胞膜共孵育体系(细胞比例1∶1),观察内皮细胞促凝活性、组织因子(TF)及其抑制物(TFPI)表达的变化,以及阻断CD40-CD40L相互作用对上述效应的影响。结果: 与巨噬细胞膜共孵育6h后,内皮细胞促凝活性增强10.9倍(P＜0.01),TF蛋白的表达亦显著增强。共孵育3h后,TFmRNA表达升高7.5倍,而TFPImRNA仅升高0.99倍。抗CD40L抗体可分别抑制促凝活性和TFmRNA表达变化的66.6%和51.0%(P＜0.01)。结论: 巨噬细胞通过CD40-CD40L相互作用增强内皮细胞促凝活性及TF表达,可能是动脉粥样硬化斑块局部血栓形成的原因之一。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞产生促炎因子的调节作用

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞产生促炎因子的调节作用,探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞。用ELISA检测上清中TNF-α和IL-8,以Greiss法测定NO,RT-PCR检测组织因子(TF)mRNA,Westernblot检测TF蛋白表达。结果显示,α-MSH抑制ECV304细胞产生NO、TNF-α,但促进IL-8的释放。LPS或TNF-α能上调ECV304细胞表达TF mRNA,而α-MSH抑制这种上调作用,并抑制ECV304细胞表达TF蛋白。上述结果提示α-MSH可通过调节血管内皮细胞表达促炎因子而发挥抗炎和免疫调节作用。     

乳糖化多聚赖氨酸导向反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究乳糖化多聚赖氨酸（Gal-PLL）导向反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒（HBV）基因表达的特异性抑制作用。方法 根据聚合酶链反应（PCR）产物直接测序结果,在HBV U5样序列区合成了一段16聚硫代磷酸的反义寡核苷酸,并将其与肝靶向配体GaL-PLL连接,在2.2.15细胞比较,观察了它们对HBV基因表达的影响,结果 通过测序确定了2.2.15细胞中的HBV DNA属于HBV表面抗原ayw1亚型,并将此用于反义寡核苷酸的序列设计;经荧光组化分析表明,Gal-PLL对大鼠肝组织有选择性亲和力;Gal-PLL与DNA形成复合物的最佳摩尔比为2：1,在相同实验条件下,硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70％和58％,而Gal-PLL硫代磷酸反义寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为96％和82％,同时培养上清液和细胞中HBV DNA的含量明显下降,无关序列寡核酸无明显效果,寡核苷酸对细胞未产生毒性,结论 肝靶向配体和反义寡核酸的复合物可以通过无唾液酸糖蛋白受体靶入2.2.15细胞内,并对HBV基因表达和复制产生特异性抑制作用。     

AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的相关基因表达谱研究

目的 :探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱。方法 :体外培养人脐静脉内皮细胞株 (ECV3 0 4) ,实验分AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组。采用改良MTT法、Fen ton反应和硝酸酶还原法分别观察不同浓度AngⅡ在4h、1 2h和 2 4h时对ECV3 0 4细胞的增殖率和细胞产生ROS(·OH和NO)的量。应用基因芯片技术和光镜分别检测 0 .0 62 5和 1 μmol/LAngⅡ作用 1 2h时ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。结果 :实验结果发现 :①一定浓度的AngⅡ(0 .0 3 1 2 5～ 1 μmol/L)作用 1 2h时E…     

分泌人可溶性FL基因转染细胞及其生物学活性分析

应用基因重组技术构建了人可溶性FL基因逆转录病毒载体pLXSN FL ,经转染PA317细胞和G4 18筛选抗性细胞克隆 ,获得重组病毒液。NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后 ,选择适当滴度的重组病毒 (5× 10 5CFU/ml)感染ECV30 4细胞 ;应用聚合酶链反应 (PCR )及反转录聚合酶链反应 (RT PCR )检测感染ECV30 4细胞FL的DNA及mRNA表达 ;应用ELISA测定rhFL在ECV30 4中的表达水平 ,用荧光标记和流式细胞仪检测转基因上清对单个核细胞来源DC的表型影响及3 H TdR掺入法测定DC对T细胞的促增殖作用。结果表明 ,外源性rhFL基因整合到ECV30 4细胞染色体DNA并有效地转录和翻译 ,稳定表达水平为 82 4ng (10 6细胞 /2 4h )的人FL。转基因ECV细胞培养上清能有效诱导人PBMC来源DC的分化和增强DC对T细胞的激发作用。外源性FL基因可以转移到ECV30 4细胞并稳定表达 ,有助于体外研究内皮细胞与免疫细胞的相互作用     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

IGF—IR反义硫代磷酸型寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的病理学研究

目的：探讨IGF-IR基因的反义硫代磷酸型寡核苷酸对胶质瘤细胞的形态学影响。方法：根据IGF-IRcDNA序列设计正义,反义寡核苷酸片段,并对其部分碱基进行硫代磷酸修饰。体外培养的胶质瘤细胞分别经正义寡核苷酸和反义寡核苷酸处理,应用倒置显微镜活细胞观察,HE染色光镜观察,透射电镜及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法研究IGF-IR反义硫代磷酸型寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡作用。结果：经反义寡核苷酸转染的胶质瘤细胞中,呈现典型的凋亡形态学改变,凋亡细胞最早期表现为细胞体积,容量减少,染色质凝聚,继之染色质集聚于核膜下成7新月状或块状;细胞核内染色质可完全固缩成团呈“黑洞”样或萎缩的核破裂形成一些较小的膜包绕的球体位于胞质内,最后出泡形成凋亡小体,DNA琼脂糖凝胶电泳分析经反义寡核苷酸处理的胶质瘤细胞DNA降解片段,可见有明显的小分子量DNA梯状条带,而野生型和正义寡核苷酸处理的胶质瘤细胞未见DNA梯状条带。结论：IGF-IR所介导失发泌环路IGF-I/IGF-IR。在胶质瘤细胞增殖和维持恶性表型中起重要作用。IGF-IR反义硫代磷酸型寡核苷酸能诱导胶质瘤细胞凋亡。     

氧化高密度脂蛋白通过MAPKs信号转导途径诱导ECV304细胞表达组织因子

目的： 探讨氧化高密度脂蛋白(oxHDL)对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞表达组织因子(TF)的影响及其机制。方法：实验分为阴性对照组、阳性对照组（加组胺）、HDL、oxHDL 4组, ECV304细胞经不同浓度oxHDL、HDL（10-120 mg/L）和组胺(1×10-9-1×10-4 mol/L)处理不同时间(2-8 h)后,采用实时定量PCR (RQ-PCR)和Western bloting方法检测TF表达。同时,分别应用SP600125［c-Jun氨基端激酶(JNK) 特异性抑制剂］、SB203580［p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK) 特异性抑制剂］、 PD98059［细胞外信号调节激酶(ERK1/2) 特异性抑制剂］,观察其对oxHDL和组胺诱导的ECV304细胞表达TF的影响。 结果：正常ECV304细胞未检测到TF,经组胺处理1 h后TF mRNA表达明显增加,在1×10-5 mol/L时最高,约为1×10-9 mol/L时的4.8倍。oxHDL以时间和浓度依赖性方式诱导ECV304细胞TF mRNA表达,在oxHDL 20 mg/L时最高,为10 mg/L时的1.8倍,在第6 h时TF mRNA表达水平为第2 h的5.3倍（P<0.05）,并在20 mg/L时显著刺激ECV304细胞TF蛋白表达,为40 mg/L时的1.5倍,而HDL没有此效应。 MAPKs（JNK、p38 MAPK、ERK1/2）抑制剂可部分解除oxHDL诱导ECV304细胞TF表达的效应,TF分别下调表达至原来的19.0%、5.0%和13.0%（P<0.05)。结论：oxHDL能以浓度和时间依赖性方式诱导ECV304细胞产生TF,其机制可能通过JNK、p38 MAPK和ERK1/2所介导。     

弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导ECV304组织因子基因表达及银杏内酯B的抑制作用

为研究弱氧化修饰低密度脂蛋白（mmLDL)对ECV304组织因子（TF）蛋白含量和mRNA水平的影响、对胞浆游离钙离子[Ca^2 ]i的影响，以及银杏内酯B等的干预作用。采用ELISA法检测细胞内TF蛋白含量，用RT－PCR法检测细胞内TF mRNA水平，用激光共聚焦显微镜观察[Ca^2 ]i的变化。结果显示，40mg/L mmLDL作用ECV304 4h，能使TF蛋白含量及mRNA水平显著增加，并迅速升高[Ca^2 ]i。抗氧化剂银杏内酯B及PKC抑制剂Staurosporine可拮抗mmLDL的上述诱导反应。以上结果提示，mmLDL可诱导ECV304 TF表达，Ca^2 与PKC参与mmLDL诱导ECV304 TF基因表达过程，并且银杏内酯B可抑制mmLDL的此种效应。     

Critical evaluation of ECV304 as a human endothelial cell model defined by genetic analysis and functional responses: a comparison with the human bladder cancer derived epithelial cell line T24/83

Early reports indicated that ECV304 was a spontaneously-transformed line derived from a Japanese human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) culture. Many morphological, immunochemical, and genetic studies provided further evidence that ECV304 was a valuable biomedical research tool and could be used to study processes that include angiogenesis in vitro and signal transduction by a variety of G protein-coupled receptors. However, several distinct differences between ECV304 and HUVEC are now apparent and recent reports have indicated genetic similarity between ECV304 and T24/83, a human bladder cancer cell line. To further assess the utility of ECV304 as a human endothelial cell model, we compared the functional responses of ECV304 and T24/83 to a range of G protein-coupled receptor agonists. We also used DNA fingerprinting to karyotype both ECV304 and T24/83. Both ATP and uridine triphosphate (UTP) stimulated inositol phosphate metabolism in ECV304 without alteration of cAMP levels. Comparative data using selective P2Y receptor agonists indicated that this response, leading to calcium mobilization from intracellular stores, was predominantly mediated by the activation of P2Y2 receptors. Similar responses were recorded from both ECV304 and T24/83 cells. ECV304 expressed a relatively high basal activity of NOS that was reduced by L-NAME and stimulated by P2Y2 receptor agonists. In contrast, P2Y2 receptor activation did not induce prostaglandin synthesis in ECV304. Both ECV304 and T24/83 express receptors for adenosine, adrenaline, and calcitonin, which stimulate adenylate cyclase. Proliferation of ECV304 and T24/83 cells, measured by the incorporation of [3H]thymidine into DNA, was largely serum-independent. This was in contrast to parallel experiments with porcine and bovine aortic endothelial cells that indicated a marked serum-dependent increase in DNA synthesis. Genetic analysis confirmed that ECV304 and T24/83 are identical. ECV304 displays some endothelial characteristics and is useful for the study of receptor pharmacology. However, ECV304 is not of HUVEC origin and is therefore an inappropriate cell line to study endothelial cell biology.     

血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响

目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响。方法①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量。结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24h、48h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、5.64%)(P<0.05)。②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8h、24h、48h释放PDGF的量(1593、2625、2175ng/L)明显高于正常孕妇组(235、405、133.5ng/L)差异显著(P<0.01)。③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24h、48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3266、2360ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05)。结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放。     

血管形成抑制因子tumstatin45-132的基因克隆、表达和生物学活性

目的: 克隆人tumstatin全长编码区基因及编码tum statin45-132的基因, 在大肠杆菌中表达。方法: 采用RT PCR从人胚肾细胞系 293细胞中克隆人的tumstatin全长编码基因, 继以PCR扩增tumstatin45-132 (45 -132位氨基酸 )编码基因, PCR产物克隆到pBV220载体中, 测序证实后, 转化E.coliBL21, 于 42℃进行热诱导表达。用SDS -PAGE分析表达产物, 对重组蛋白纯化后用内皮细胞增殖试验测定其生物学活性。结果: RT- PCR扩增出tumstatin全长编码基因, 以PCR扩增出tumstatin45-132的编码基因, 经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致。以含有tumstatin45-132编码基因的表达载体转化E.coliBL21后, 可表达出相对分子质量(Mr)为 9 600的重组蛋白。表达产物的蛋白量占菌体蛋白量的 10%, 纯化后能抑制内皮细胞的增殖。结论: 成功克隆全长tumstatincDNA, 并在大肠杆菌中表达重组tumstatin45-132蛋白, 证实其具有抑制内皮细胞增殖的活性。     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

高糖时细胞间相互作用对共培养ECV304细胞的影响及茶多酚的干预作用

目的：研究高糖时系膜细胞对体外共培养的ECV304细胞产生活性氧和转化生长因子β1（TGF-β1）的影响以及茶多酚的干预作用。 方法： 建立体外ECV304细胞和系膜细胞不直接接触共培养体系，分为正常对照组、高糖组、茶多酚组、茶多酚干预组，并与两种细胞分别单独培养进行比较，培养36 h后，分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，RT-PCR法测定培养ECV304细胞内TGF-β1 mRNA的表达。 结果： 在共培养模型中，高糖抑制SOD活性，促进MDA产生，上调共培养模型中ECV304细胞TGF-β1 mRNA表达，其作用显著高于单独培养的ECV304细胞，茶多酚干预可拮抗高糖时ECV304细胞的上述改变。 结论： （1）高糖环境下系膜细胞和ECV304细胞间存在相互作用，这种作用能促进共培养的ECV304细胞产生活性氧和上调TGF-β1的表达。（2）茶多酚通过干预这种细胞间相互作用，保护ECV304细胞。     

人参皂甙对内毒素致血管内皮细胞表达TF和PAI-1的影响

目的:研究人参皂甙对内毒素脂多糖(LPS)致血管内皮细胞组织因子(TF)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)表达的影响,探讨人参皂甙对心血管疾病的保健及防治机制。方法:用酶消化法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC);ELISA方法检测HUVEC条件培养液PAI-1蛋白量;用一步凝固法检测HUVECTF活性;Northernblot检测HUVECTF和PAI-1的mRNA表达。结果:LPS能使HUVECPAI-1蛋白和TF活性及其mRNA表达显著增强,人参皂甙则明显抑制LPS对HUVEC的这种作用。结论:通过拮抗LPS致HUVECTF和PAI-1的表达,人参皂甙可维持血管内皮功能稳定,而发挥其心血管疾病的保健与防治作用。     

腺病毒介导的mPPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达

目的：观察腺病毒介导的mPPARγ1转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达。方法：构建表达小鼠PPARγ1基因的复制缺陷型腺病毒表达载体；将融合80%的ECV304细胞给予不同刺激量（1×104 U/L、5×104 U/L、1×105 U/L和2×105 U/L）的IFN-γ干预；将IFN-γ（1×105 U/L）预刺激并孵育 24 h 的ECV304细胞分成对照组（C）、PPARγ基因过度表达组(P)、PPARγ活化剂曲格列酮干预组(T)以及PPARγ基因过度表达和曲格列酮共刺激组(PT)进行干预，观察不同剂量IFN-γ对ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达的作用，以及PPARγ基因过度表达和/或活化对上述作用的影响。结果：正常ECV304细胞galectin-9基因表达弱。IFNγ孵育24 h后， ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达增加，且galectin-9表达与IFN-γ具有量效关系。PPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导galectin-9基因/蛋白表达，曲格列酮对上述作用无影响；PPARγ1基因转染和曲格列酮共刺激抑制IFN-γ诱导galectin-9基因/蛋白表达与单一PPARγ1基因转染效应相似。正常ECV304细胞PPARγ表达量低，而PPARγ基因过表达和活化不影响内源性PPARγ基因表达。结论：PPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因/蛋白表达可能是PPARγ基因发挥免疫调控作用的一个重要机制。