bFGF荧光真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨碱性成纤维细胞生长因（bFGF）荧光真核表达-载体转染骨髓间充质干细胞（MSCs）的毒达情况，为进一步开展bFGF基因治疗中枢神经系统疾病奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术将bFGF真核表达-载体导入MSCs，并于转染后18h在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果与结论经转染后18h的MSCs在倒置荧光显微镜下可见片状荧光，说明转染成功。MSCs有望成为bFGF基因治疗中枢神经系统疾病的理想载体。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞*☆

背景：碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。 材料：日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。 方法：抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。 结果：流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。 结论：实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。     

锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用体外培养骨髓间充质干细胞生长及增殖

背景：如何简便有效的在体外大量扩增骨髓间充质干细胞,已成为神经科学研究热点。 目的：观察锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用对骨髓间充质干细胞体外生长及增殖的影响,以寻求体外快速、大量增殖骨髓间充质干细胞的有效方法。 方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。实验分为对照组(不加任何影响因子)、锌组、碱性成纤维细胞生长因子组、锌+碱性成纤维细胞生长因子组,分别用特定浓度的锌及碱性成纤维细胞生长因子单独或联合应用。观察细胞生长曲线,用四唑盐比色法观察存活和增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,进行细胞表面抗原的鉴定。 结果与结论：细胞生长曲线、四唑盐比色法、流式细胞仪结果均显示,第3~5天各组增殖能力达高峰,其中锌+碱性成纤维细胞生长因子组增殖能力最强(P < 0.05)。第7天,对照组及单独应用碱性成纤维细胞生长因子和锌组细胞增殖力均有所下降,仅锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞仍保持较强的增殖(P < 0.05)。锌+碱性成纤维细胞生长因子组细胞中处于S+G2+M期的百分率最大,与其他3组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。结果证实,锌和碱性成纤维因子均有促进体外培养的骨髓间充质干细胞增殖的作用,联合应用锌和碱性成纤维细胞生长因子促增殖作用最强,可以作为体外扩增培养骨髓基质细胞的最佳培养条件。     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗颅脑损伤后痉挛性瘫痪

目的探讨应用自体骨髓间充质干细胞治疗颅脑损伤后痉挛性瘫痪的临床疗效。 方法回顾性分析第四军医大学西京医院神经外科自2009年5月至2014年4月治疗的33例颅脑损伤后痉挛性瘫痪患者,完成4次自体骨髓间充质干细胞移植,每周1次,每次经腰椎穿刺蛛网膜下腔注射,细胞数为2×10⁷,移植前、移植后1个月、3个月、6个月通过改良Ashworth分级、Brunnstrom分级评估患侧上下肢肌张力、运动功能,并行脑PET/CT、脑电图、偏瘫肢体肌电图检查。 结果移植后1个月开始Brunnstrom分级较移植前改善。移植后3个月开始Ashworth分级较移植前改善。5例移植后3个月头颅PET/CT见脑葡萄糖代谢减低较前改善。临床观察未发现明显不良反应,脑电图、偏瘫肢体肌电图检查未见明显变化。 结论自体骨髓间充质干细胞移植对颅脑损伤后痉挛性瘫痪的肢体肌张力增高和运动障碍均有改善,移植后6个月内通过临床观察及影像学检查未发现不良反应,为临床治疗颅脑损伤后遗症提供了新方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑损伤

目的了解大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）经鼠尾静脉移植后在脑内的表达情况及对大鼠脑创伤后神经运动功能的影响。方法将溴脱氧尿苷（BrdU）标记培养的BMSCs分别在大鼠脑创伤后第1天（实验组1，n=6）、第3天（实验组2，n=10）、第7天（实验组3，，F7）经大鼠尾静脉注射移植，另取6只脑创伤大鼠（实验组4）在伤后第3天经尾静脉移植BrdU标记的全骨髓，尾静脉注射仅．MEM脑创伤大鼠作为对照组（n=6）。应用免疫组化染色，了解移植细胞在脑内的表达情况。脑创伤后第1、3、7、14天评价移植对大鼠神经运动功能的影响。结果脑创伤后14d时神经运动功能评分分别为实验组1：31．83±1．60，实验组2：31．10±1．79，实验组3：28，43±1．72，实验组4：28．67±1．37，对照组：26．00±1．00．各组间差异有显著性（P=0．000）。在移植各组的创伤侧脑组织，可见BrdU染色阳性细胞，并以脉络丛、脑室周围、血管周围分布较多。对实验组2进行免疫组化双染色，未发现BrdU＋神经元特异性烯醇化酶（NSE1、BrdU＋胶质纤维酸蛋白（GFAP）双染色细胞。结论大鼠BMSCs经鼠尾静脉移植．在一定时期内能改善大鼠脑创伤后神经运动功能；脑内可以发现移植细胞存活．但移植细胞是否转化为神经元仍然需要进一步的实验证实。     

骨髓间充质干细胞移植治疗脑损伤大鼠的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)移植治疗大鼠脑损伤后神经系统功能障碍的方法、疗效和机制.方法 制作50只脑损伤大鼠动物模型,随机分为2组每组25只.一组采用移植异体MSCs,另一组作为对照,分别于治疗前和治疗后1周、4周对2组大鼠肌力、平衡力和空间学习能力进行检测,观察2组治疗后神经功能恢复情况.结果 脑损伤可以导致大鼠肌力、平衡力和空间学习能力下降,移植组与对照组在治疗后大鼠肌力、平衡力和空间学习能力均有改善,但改善情况移植组明显好于对照组(P《0.05).结论 骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑损伤(traumatic brain injury, TBI)后神经系统功能(肌力、平衡力和空间学习能力)的恢复有显著的改善作用.     

骨髓间充质干细胞立体定向移植治疗大鼠脑缺血损伤的实验研究

目的观察立体定向移植骨髓间充质干细胞(BMSC)治疗MCAO大鼠的效果并探讨其可能机制。方法用改良线拴法制作大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。60只模型大鼠随机分为移植组(A组)、磷酸盐缓冲液溶液组(B组)与假手术组(C组)。在模型建立后7 d,通过立体定向方式将1×106个BMSCs移植入A组大鼠损伤侧纹状体,B组大鼠以同样方式在同样部位移植等体积的磷酸盐缓冲液,C组完成立体定向过程,但无液体注入。应用改良大鼠神经功能缺损评分(m NSS评分)、水迷宫测试观察大鼠神经功能恢复状况,并取大鼠脑组织行免疫组织化学染色。结果 A组m NSS评分优于B组、C组(P0.05);A组逃避潜伏期明显缩短(P0.05);跨越平台次数明显增多(P0.05)。A组大鼠在脑损伤中心及周围区,可见Brdu单染阳性细胞及Brdu+BDNF、Brdu+GFAP、Brdu+v WF、Brdu+VEGF双染阳性细胞。结论立体定向移植BMSCs可以显著改善MCAO大鼠神经功能恢复。     

骨髓间充质干细胞移植联合吡拉西坦修复大鼠脊髓损伤

背景：单纯的干细胞移植对脊髓损伤的修复作用并不理想,主要是因为脊髓损伤后损伤区域神经组织的水肿、缺血、缺氧等引起继发性损伤造成的。 目的：在骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的同时应用吡拉西坦,观察两者对大鼠脊髓损伤恢复的影响。 方法：雌性Wistar大鼠参照改良Allen打击法制备大鼠脊髓损伤模型。随机分成3组,即单纯损伤组、骨髓间充质干细胞移植组及骨髓间充质干细胞移植联合吡拉西坦组。于伤后1,2,4,6,8周进行BBB评分和斜板实验等运动功能检测。第4周取材行病理切片苏木精-伊红染色,通过SRY-PCR检测雄性大鼠Y染色体上特有的基因SRY,从而得知移植骨髓间充质干细胞是否存活。8周后取材,行辣根过氧化物酶示踪观察,并通过透射电镜观察轴突的再生情况。 结果与结论：伤后4周,骨髓间充质干细胞移植组、联合治疗组大鼠后肢运动功能均有较明显恢复,联合治疗组较骨髓间充质干细胞移植组恢复快(P < 0.05)。单纯损伤组亦有所恢复,但程度较轻。病理切片单纯损伤组未见神经轴索通过;骨髓间充质干细胞移植组可见少量神经轴索样结构;联合治疗组可见较多神经轴索样结构。骨髓间充质干细胞移植组、联合治疗组有SRY基因表达,单纯损伤组未检测到SRY基因。辣根过氧化物酶阳性神经纤维数联合治疗组﹥骨髓间充质干细胞移植组>单纯损伤组,差异具有显著性意义(P < 0.05)。透射电镜下,骨髓间充质干细胞移植组、联合治疗组正中横断面可见新生的无髓及有髓神经纤维。提示骨髓间充质干细胞移植联合吡拉西坦促进大鼠损伤脊髓结构和功能恢复的效果明显优于单纯细胞移植组,两者联用具有协同效应。     

碱性成纤维细胞生长因子等体外诱导成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外定向诱导分化为神经元样细胞。方法 采用Percoll分离液离心分离hMSCs，体外扩增，分别采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和2-巯基乙醇(2-ME)等无血清DMEM诱导hMSCs分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果 hMSCs在体外扩增传至5代后，流式细胞仪显示99．5％，97．8％，98．8％hMSCs表面抗原CD29、CD44、CD90表达阳性。接种到12孔板，3d后加入bFGF和2-ME联合或2-ME单种诱导剂诱导后，hMSCs胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性，GFAP阴性。结论 成人骨髓间干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。     

PKH67示踪骨髓间充质干细胞迁移至损伤脊髓的实验研究

目的 探讨SCI后体外移植PKH67标记的BMSCs迁移至脊髓损伤处并进行增值和分化的动员情况。方法 用梯度离心法分离和培养出SD 大鼠第3代BMSCs,用绿色荧光染料PKH67标记; 采用钳夹法制备脊髓损伤(SCI)模型,分为实验组(n=15)、对照组(n=16)、假手术组(n=16); SCI术后对脊髓损伤组织进行HE染色,实验组和假手术组于术后尾静脉移植含有1×10⁷个BMSCs的0.5 mL生理盐水,对照组注射等量生理盐水; 分别于术后1、7、14、21 d观察大鼠后肢运动功能恢复情况,并做BBB分; 术后21 d后取脊髓组织,行免疫荧光染色,观察BMSCs的迁移,增值和分化情况。结果(1)镜下可见损伤脊髓形成的空洞、坏死及炎性细胞的增多;(2)共聚焦荧光显微镜观察显示术后21 d实验组脊髓损伤部位可见移植的BMSCs, 部分BMSCs呈GFAP和Nestin阳性表达; 假手术组无 PKH67标记的BMSCs; 实验组GFAP和Nestin阳性细胞数较对照组和假手术组明显增加(P<0.05),对照组较假手术组增加不明显(P>0.05);(3)实验组和对照组BBB评分均有增加,但实验组BBB评分显著高于对照组(P<0.05)。结论 PKH67示踪的BMSCs可迁移至损伤脊髓部位,进行增值并分化为神经元样细胞,促进损伤脊髓的神经功能恢复。     

神经干细胞侧脑室内移植治疗脑瘫鼠的实验研究

目的探讨神经干细胞(NSCs)侧脑室内移植对脑瘫鼠的治疗效果。方法将60只7日龄Wistar大鼠随机分为正常组、脑瘫组、NSCs移植组和神经营养因子(NT-3)修饰的NSCs移植组。除正常组外其余各组鼠均行左侧颈动脉结扎并缺氧2h建立脑瘫模型,建模3d后分别对两移植组进行侧脑室NSCs以及NT-3修饰的NSCs移植。移植后第46天,开始对各组大鼠的学习记忆以及行为学能力进行评估,学习记忆能力连续测5d。之后取鼠脑组织行病理学检测。结果①Morris水迷宫:正常组、两组移植组大鼠逃避潜伏期与脑瘫组比较明显缩短(P<0.05);②足印试验:正常组、两移植组潜伏期与脑瘫组比较明显缩短(P<0.05),右侧后肢足印重复也明显好于脑瘫组,足印间距减小,且稳定(P<0.05);③平衡木试验:与脑瘫组比较,正常组、移植组潜伏期时间明显缩短,后足滑脱次数明显减少(P<0.05);④组织病理学HE染色结果:脑瘫组鼠侧脑室周围细胞肿胀、变性、坏死和排列紊乱,局部囊性变和炎性细胞聚积;NSCs移植组鼠脑组织结构破坏以及细胞形态较脑瘫组有所改善;NT-3移植组恢复情况更好,细胞形态趋于正常。结论经侧脑室移植外源性NSCs可明显改善脑瘫鼠脑组织的病理损伤和促进其神经行为学及学习记忆功能的恢复。     

重型颅脑损伤合并脑疝的救治与预后分析

目的总结重型颅脑损伤合并脑疝的救治经验并分析其预后情况。方法回顾性分析68例重型颅脑损伤合并脑疝患者的临床资料,根据不同手术方法、GCS评分与病情分别分析其预后情况。结果GCS评分3～5分患者的死亡率显著高于GCS评分6～8分患者(P＜0．05),幕上去大骨瓣减压 颅内血肿清除 小脑幕切开手术方式治疗的患者死亡率明显低于单侧幕上去大骨瓣减压 颅内血肿清除手术方式治疗的患者(P＜0．05)。结论重型颅脑损伤合并脑疝的临床疗效与GCS评分和手术方式密切相关。     

重型颅脑损伤继发脑梗死的早期防治

目的 探讨重型颅脑损伤继发性脑梗死早期预防性治疗的效果。方法 回顾性分析53例重型颅脑损伤继发性脑梗死的临床资料,针对继发性脑梗死的高危因素早期采用预防性治疗。结果 53例中,死亡18例（34.0%）。出院后6个月按GOS评分评估预后:植物生存5例,重残8例,中残10例,恢复良好12例。出院后12个月GOS评分:植物生存5例,重残7例,中残9例,恢复良好14例。结论 早期预防性合理治疗有助于降低重型颅脑损伤继发性脑梗死的病死率,改善病人预后。     

Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血的实验研究

目的观察Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对大鼠脑缺血性损伤的治疗作用及对移植的MSCs保护性作用。方法将114只SD大鼠随机分为假手术组、Model组、MSCs组和Bcl-2-MSCs组;线栓法制作大鼠一侧大脑中动脉缺血再灌注模型,MSCs组及Bcl-2-MSCs组在缺血24h后经尾静脉注射方式移植BrdU标记的MSCs及人Bcl-2基因修饰的MSCs;分别于术后1、7、14、28d对各组大鼠进行神经功能缺损评分（NSS）;在脑缺血14d应用TTC法观察梗死灶体积;BrdU和TUNEL免疫荧光双重标记检测移植的MSCs凋亡情况;Westernblot检测大鼠脑梗死周边区Bcl-2蛋白的表达;HE染色观察脑组织病理形态。结果MSCs-Bcl-2组和MSCs组NSS评分、脑梗死体积百分比、TUNEL阳性细胞数较Model组低（P〈0.05）,且MSCs-Bcl-2组比MSCs组更低,BrdU阳性细胞数较多（P〈0.05）;MSCs-Bcl-2组BrdU和TUNEL免疫荧光双标细胞数稍多,但差异不显著（P〉0.05）,而MSCs-Bcl-2组BrdU和TUNEL免疫荧光双标细胞占BrdU阳性细胞百分比明显较低（P〈0.05）。MSCs-Bcl-2组Bcl-2蛋白呈持续较高水平的表达,和MSCs组同时间点相比差异有统计学意义（P〈0.05）。HE染色示MSCs组和MSCs-Bcl-2组脑组织损伤及细胞丢失较轻,MSCs-Bcl-2组更明显,脑梗死周边区均未见到核大、浓染的异形细胞。结论Bcl-2基因修饰的MSCs移植较MSCs移植能进一步改善脑缺血大鼠的神经功能,减少脑梗死体积;其机制为Bcl-2基因修饰使MSCs持续、稳定表达一定量的Bcl-2蛋白,从而能保护移植的MSCs,减少其凋亡,增加其存活。     

腺苷预处理对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用和机制

目的探讨腺苷预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用和机制。方法制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型。将大鼠随机分为3组:假手术组(F组)、缺血再灌注组(IR组)、腺苷预处理组(AP组),用Zeal Longa 5级评分法进行神经功能评分;免疫组织化学法检测脑组织内碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达。结果 (1)神经功能评分AP组各亚组均小于IR组各亚组(P均<0.05),但大于F组各亚组(P均<0.05);(2)F组bFGF阳性表达极弱,IR组和AP组在脑缺血再灌注后2 h开始出现bFGF弱阳性表达并逐渐增强,24 h达高峰,72 h略有下降,6 h2、4 h、72 h时AP组bF-GF阳性表达较IR组相应各亚组增强(P<0.05)。结论 (1)腺苷预处理能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤所引起的神经功能缺损症状;(2)腺苷预处理能增强中枢神经系统内bFGF的分泌,进而起到保护脑组织的作用。     

bFGF对大鼠局灶性缺血再灌注脑组织的保护作用

目的探讨bFGF对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡和脑组织中SOD、MDA含量变化的影响。方法应用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,大脑中动脉阻塞1h再灌注损伤24h,检测假手术组、缺血再灌注组和bFGF组的凋亡细胞数和脑组织中SOD、MDA的含量。结果假手术组偶见凋亡细胞,缺血再灌注组和bFGF组凋亡细胞数分别是26.35±5.67和18.65±5.91,与缺血再灌注组相比,bFGF组缺血区皮质凋亡神经元明显减少(P<0.05)。SOD,MDA测定结果显示三组间比较,具有显著性差异(P<0.01和P<0.05)。结论抗氧化作用可能是bFGF减少大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的分子机制之一。     

颅脑损伤后症状性脑血管痉挛的危险因素分析

症状性脑血管痉挛（symptomatic cerebral vasospasm,SCVS）是颅脑损伤后引起死亡或致残的主要因素之一。其发生机制复杂,是一个多因素的病理过程。为探讨其影响因素,我们选择了聊城市脑科医院2006年4月至2007年7月连续308例颅脑损伤患者,对其发生SCVS的危险因素进行前瞻性研究。     

bFGF、VEGF在大鼠创伤脑组织中的表达

目的研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)在大鼠创伤脑组织中的表达及它们之间的关系，从分子水平探讨颅脑损伤后的病理机制，为临床治疗脑损伤的新途径提供实验基础。方法 改进Marmarou大鼠加速弥漫性脑损伤模型，制作成弥漫性轴索损伤同时合并局灶性脑挫伤的新的动物模型，取挫伤灶周围脑组织免疫组化染色观察bFGF、VEGF基因表达情况。结果 脑挫伤灶周围脑组织bFGF基因表达在伤后1h明显增加，伤后12h达高峰；VEGF基因表达伤后逐渐增加，24h达高峰。结论 bFGF、VEGF基因表达与脑损伤密切相关，bFGF、VEGF作为生长因子可能参与颅脑损伤后神经元保护及损伤后修复过程。     

大鼠脑弥漫性轴索损伤的bFGF表达及意义

目的 探讨大鼠脑弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injuries,DAI)后不同时期脑皮层组织中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达及意义,为临床治疗脑损伤寻求有效手段。方法 选择雄性SD大鼠60只,随机分为正常对照组(10只)和DAI组(50只),DAI组大鼠接处死时间又分为第6h、12h、24h、72h和第7d组,每组10只大鼠。用免疫组织化学方法检测大鼠脑皮层bFGF的表达,并分析其表达变化特点。bFGF阳性结果判断标准以细胞浆内出现棕黄色染色颗粒为阳性,反之为阴性。结果 DAI后6h,损伤组即出现bFGF表达[(16.4±2.2)个/0.1mm~2],12h表达数量增强[(66.2±5.1)个/0.1mm~2],至72h达高峰[158.7±10.1)个/0.1mm~2],7d后仍维持在较高水平[(92.1±11.2)个/0.1mm~2],各DAI组时限之间比较差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。HE染色结果显示,损伤后12h可见大鼠额顶区皮层神经元胞浆粉红、核浓染,胞体皱缩,神经元细胞突起成屈曲螺旋状变形;脑皮层神经无数量亦明显减少。结论 DAI后bFGF的表达具有时空效应,提示bFGF与脑损伤后神经元的保护及修复作用有密切关系。