经纹状体注射胶质细胞系源性神经营养因子对帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经元保护作用的实验研究

目的 研究经纹状体注射胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neumtrophic factor，GDNF）对帕金森病（Parklnson disease，PD）模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的保护作用。方法 利用1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）制备成年小鼠PD模型，通过单侧纹状体定位注射GDNF，取中脑黑质节段，做连续冠状石蜡切片，结合免疫组织化学染色方法，观察各组酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、钙结合蛋白（calbindin D28k，CB）的表达，光镜观察并细胞计数，统计学分析。结果 在模型制备的第4,6天，单侧纹状体定位注射GDNF后，小鼠黑质致密部TH与CB阳性神经元数量显著多于注射PBS组。结论 经纹状体注射GDNF对成年PD小鼠黑质多巴胺能神经元具有保护作用，且这种保护作用可能与细胞内CB表达增加有关。     

益智宁神颗粒对SHR大鼠前额叶-纹状体多巴胺含量、GDNF mRNA及其蛋白表达的影响

[目的]研究益智宁神颗粒对幼龄自发性高血压(SHR)大鼠前额叶-纹状体多巴胺含量、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)mRNA及其蛋白表达的影响。[方法]以32只幼年SHR大鼠为研究对象,采用随机区组法分为模型对照组、益智宁神组、盐酸哌甲酯组、托莫西汀组,另设8只京都(WKY)大鼠为正常对照组。按各组设计剂量连续给药4周后,取前额叶、纹状体,采用高效液相法检测多巴胺(DA)含量、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测GDNF mRNA表达、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测GDNF蛋白表达。[结果]1)SHR各组大鼠前额叶、纹状体DA的含量均有低于WKY组的趋势,其中,益智宁神组大鼠前额叶DA含量明显高于模型对照组(P0.05);益智宁神组大鼠纹状体DA含量低于正常对照组、盐酸托莫西汀组(P0.05)。2)SHR各组前额叶、纹状体GDNF mRNA表达依次为盐酸托莫西汀组盐酸哌甲酯组益智宁神组模型对照组(P0.05)。3)SHR大鼠各组间前额叶、纹状体GDNF蛋白表达均高于WKY组;其中,益智宁神组前额叶GDNF蛋白表达与其余SHR大鼠各组无统计学差异(P0.05),其纹状体GDNF蛋白表达低于盐酸哌甲酯组(P0.05)。[结论]益智宁神颗粒能够提高SHR特定脑区DA含量、GDNF mRNA及其蛋白表达,对促进幼龄SHR大鼠特定脑区DA能神经网络成熟度具有一定的作用。     

PEA3基因在大鼠肾脏组织不同发育时期的表达

目的:探讨PEA3基因在大鼠肾脏组织发育后期不同阶段的表达变化,分析PEA3基因与肾脏发育的关系。方法:获取出生后第1、7、21天和成年大鼠肾脏组织,采用RT-PCR技术检测肾脏组织中PEA3基因mRNA的表达水平。结果:PEA3基因在新生鼠肾脏表达丰富(64.09±10.12)%,出生后7天表达明显减少(22.43±7.97)%,出生后21天(12.79±2.90)%和成年鼠肾(11.17±3.08)%表达微弱,除出生后21天和成年大鼠两组间表达没有统计学差异外,其他各组表达差异均有统计学意义。结论:PEA3基因的表达水平随肾脏发育的成熟而下降,可能与肾脏发生发育有关。     

Boule基因在小鼠精子发生过程中的动态表达

目的:研究雄性不育相关基因Boule在小鼠出生后首个精子发生波中的动态表达,探讨Boule在精子发生过程中的调控作用。方法:运用免疫印迹法分析BOULE蛋白在多组织中的表达情况。运用实时荧光定量、免疫组织化学和免疫荧光技术检测Boule m RNA和BOULE蛋白在雄性小鼠出生后首个精子发生波各个时间点中的表达。结果:1免疫印迹法显示BOULE蛋白在睾丸中特异性高表达,在出生后16 d睾丸可被检测到,并在随后的发育中睾丸和成年睾丸持续表达;2实时荧光定量方法证实Boule m RNA在雄鼠出生后14 d睾丸中可被检测到,20 d呈现表达高峰;3免疫组织化学显示在精母细胞及圆形精子细胞胞质中存在BOULE蛋白阳性信号。结论:Boule在精子发生过程中的表达是在发育水平精密调控的,在粗线期精母细胞和圆形精子细胞阶段的特异表达提示Boule可能在精母细胞进程和圆形精子细胞中发挥作用。     

DNAJB8在小鼠睾丸生殖细胞中的表达定位

目的：探究DNAJB8［DnaJ heat shock protein family（HSP40） member B8］在小鼠精子发生过程中的表达模式。方法：分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测小鼠各脏器、不同发育时期睾丸组织以及不同生精细胞DNAJB8的mRNA转录和蛋白表达量;免疫荧光检测DNAJB8在生精细胞中的表达定位。结果：DNAJB8基因在睾丸组织中特异表达,从小鼠出生后21 d（P21）即圆形精子阶段开始DNAJB8 mRNA保持较高的表达,而DNAJB8蛋白在精子变形晚期出生后35 d（P35）才开始表达。DNAJB8蛋白主要定位在晚期精子细胞及精子鞭毛中段。结论：DNAJB8可能参与小鼠精子变形晚期的发育过程。     

肌苷对帕金森病小鼠模型的神经保护作用

目的: 观察肌苷对MPTP致帕金森病(PD)小鼠模型的神经保护作用.方法: 用MPTP建立C57BL小鼠PD模型,在MPTP前给予肌苷,通过行为学检测(自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验)、免疫组织化学和荧光分光光度法,观察肌苷对PD小鼠模型的行为学表现、黑质多巴胺(DA)神经元和纹状体酪氨酸羟化酶免疫反应阳性(TH-ir)神经纤维以及纹状体DA水平的影响.结果: 给予MPTP后,小鼠行为学计数降低,自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验分别降低约45%、43%和22%,黑质DA神经元数目减少约58%,纹状体TH-ir神经纤维密度减低,纹状体DA水平明显降低约88%,提前给予肌苷后降低程度减轻,自主活动计数、Rotarod检测、游泳实验降低程度分别约为5%、11%和12%,黑质DA神经元数目减少约43%,纹状体DA水平降低约71%,两组相比有显著性差异(P＜0.01).结论: 肌苷对MPTP所致的C57BL小鼠的神经损伤具有保护作用.     

胡黄连对缺血再灌注脑组织胶质源神经营养因子的影响

目的 观察缺血再灌注大鼠脑内胶质源神经营养因子(GDNF)及GDNF mRNA的变化,探讨胡黄连对神经元的保护作用.方法 成年健康雄性Wistar大鼠36只,应用线栓法制作脑缺血再灌注模型,用胡黄连甲醇提取物灌胃治疗后,免疫组织化学染色法观察皮质、纹状体GDNF蛋白表达,原位杂交方法观察其mRNA表达.结果 模型组缺血侧皮质区于缺血再灌1 d时GDNF蛋白、GDNF mRNA表达至高峰,与假手术组比较差异有显著性(F=14.168、40.189,q=12.565～16.847,P<0.01),14 d降至基础水平;纹状体区于缺血再灌3 d时GDNF蛋白、GDNF mRNA表达至高峰,与假手术组比较有显著性差异(F=12.531、113.312,q=11.379～12.565,P<0.01),14 d降至基础水平;胡黄连组缺血再灌注14、21 d时GDNF蛋白、GDNF mRNA表达与手术组及假手术组比较升高,有显著性差异(q=16.847～30.079,P<0.01).结论 胡黄连对脑缺血再灌注损伤神经元有保护作用,其机制可能与上调脑内GDNF表达有关.     

MPTP对快速老化小鼠黑质纹状体系统的急性损害及小胶质细胞的激活

目的:探讨MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)对快速老化小鼠(senescence accelerated mouse prone8,SAMP-8)黑质纹状体系统的急性损害及小胶质细胞激活与损害的关系。方法:57只健康雄性12周龄SAMP8小鼠,随机分为生理盐水对照组和MPTP组,每组再分别于第1次给药后6 h、24 h、3 d和8 d四个时间点处死小鼠,每个时间点6~9只。SAMP8小鼠背部皮下注射MPTP 20 mg·kg-1,1次/2 h,注射4次,观察各时间点小鼠的自主活动;免疫组织化学染色检测各时间点黑质TH+神经元数量、纹状体TH免疫反应性及小胶质细胞的状态;HPLC技术检测纹状体DA含量。结果:第3次注射后小鼠出现明显活动减少,并于第1次给药后48 h恢复近正常水平。与对照组相比:MPTP组黑质TH+神经元数目于第1次注射后6 h、24 h、3 d、8 d分别减少7.06%(P=0.235)、12.79%(P<0.05)、22.49%(P<0.01)、42.39%(P<0.001),两个时间点之间比较3 d与8 d有统计学差异(P<0.05);与对照组相比,MPTP组纹状体TH免疫反应性(COD值)减低,6 h (P<0.05)、24 h (P<0.01)、3 d (P<0.001)、8 d (P<0.001),两个时间点之间比较24 h与3 d比较差异有统计学意义(P<0.05);纹状体多巴胺含量6 h降低79.09% (P<0.001),24 h降低80.3% (P<0.001),3 d降低86.6% (P<0.001),8 d降低81.0% (P<0.001),但24 h、3 d、8 d比较无统计学差异。纹状体小胶质细胞于给药后24 h免疫反应性明显增强,3 d明显激活,8 d激活现象明显回落。结论:MPTP可导致SAMP8小鼠黑质纹状体系统的急性损害,出现自主活动减少、黑质多巴胺能神经元减少及纹状体多巴胺能纤维脱失,多巴胺含量降低;小胶质细胞激活可能与MPTP-SAMP8小鼠的黑质纹状体系统损伤有关。     

知母活性成分ZMR对慢性MPTP损伤小鼠模型的保护作用

目的 研究知母活性成分ZMR对慢性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)损伤小鼠模型黑质纹状体通路多巴胺神经元的影响.方法 C57BL/6小鼠分为对照组、模型组、ZMR低剂量组和ZMR高剂量组.模型组、ZMR低剂量组和ZMR高剂量组小鼠经皮下注射MPTP及腹腔注射丙磺舒建立慢性MPTP损伤小鼠模型;建模开始1周后,ZMR低剂量组给予ZMR 10 mg·kg-1·d-1, ZMR高剂量组给予ZMR 26 mg·kg-1·d-1,连续灌胃给药60 d.各组小鼠分别进行Rotarod行为学测试,黑质酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色观察,ELISA法测定纹状体内胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白含量.结果 与模型组比较,ZMR低剂量和高剂组的Rotarod行为学得分分别提高20.6%和23.8% (P<0.05);黑质TH阳性细胞分别增加104.1%和228.8%(P<0.05);纹状体GDNF蛋白水平分别提高99.0%和125.5% (P<0.01),纹状体BDNF蛋白水平分别提高76.8%和80.2%(P<0.01).结论 ZMR提高慢性MPTP损伤小鼠模型纹状体GDNF和BDNF蛋白水平,增加黑质TH阳性细胞数量,改善小鼠运动能力.提示ZMR对慢性MPTP损伤小鼠模型黑质纹状体通路多巴胺神经元具有保护作用.     

乌鸡白凤丸有效成分对帕金森病模型小鼠的神经保护作用

目的探讨乌鸡白凤丸有效成分（BFP）对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱致C57BL小鼠黑质神经元凋亡的保护作用及其可能机制。方法C57BL小鼠连续5d皮下注射MPTP（30mg／kg）制备帕金森病小鼠模型。给予BFP预处理后，用酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学法观察黑质神经元的变化；同时应用免疫组织化学法检测Bax蛋白表达; 应用高效液相-电化学方法检测纹状体（Str）多巴胺（DA）及其代谢产物二羟基苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的含量变化。结果BFP预处理能使黑质致密带（SNc）TH免疫阳性神经元数目较MPTP组明显增多，而Bax蛋白表达较MPTP组明显减少；可使Str区DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量明显增加。结论BFP有效成分可以拮抗神经毒性物质MPTP对C57BL小鼠黑质多巴胺能神经元的损伤，其作用机制可能与其抗凋亡作用有关，Bax表达的降低可能是BFP抗凋亡作用的途径之一。     

脂多糖所致小鼠睾丸支持细胞GDNF表达减少对精原干细胞的影响

目的   探讨脂多糖（LPS）处理后的小鼠睾丸支持细胞(SCs)中胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达的变化及该变化对精原干细胞（SSCs）的影响。 方法   取5～6周龄昆明小白鼠睾丸组织,分离纯化并培养SCs,将其分为4组：正常对照组（Con组）,添加LPS处理1d组（1d组）、2d组（2d组）和3d组（3d组）,收集4组培养液作为条件培养液,采用RT-PCR和Western blot检测各组SCs GDNF表达的变化;取5～7d龄昆明小乳鼠睾丸组织,筛选SSCs后分为4组：Con组、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,分别用前面的4组培养液培养96h。通过免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中PLZF、oct4、PCNA和c-kit、sohlh2的表达变化,并通过RT-PCR检测SSCs中Gfrα1、c-ret和Bcl6b、Etv5的表达变化。  结果   RT-PCR与Western blot结果显示,SCs GDNF表达按Con、1d、2d、3d组的顺序降低; RT-PCR和免疫荧光染色结果显示,SSCs PLZF、oct4和PCNA的表达按Con、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组顺序降低,而c-kit和sohlh2的表达按Con组、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组顺序升高; SSCs中Gfrα1、c-ret、Bcl6b与Etv5的表达Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组均低于Con组。 结论   LPS处理导致小鼠SCs GDNF表达减少,该变化可使SSCs分化加速而其自我更新受到抑制,其机制可能与Bcl6b和Etv5的表达下调有关。     

神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后GDNF基因表达的影响及意义

目的:探讨神经干细胞(NSC)移植对大鼠脊髓损伤后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响及其意义。方法:NSC提取自新生Wistar大鼠的海马区,经培养、鉴定。制作大鼠脊髓损伤(SCI)模型,于伤后第7d移植NSC。实验分为3组:NSC移植组(A组)、DMEM填充组(B组)、正常对照组(C组)。应用RT-PCR法和免疫组化法观察细胞移植后不同时间点GDNF基因的表达变化。结果:RT-PCR结果分析,移植术后第1,3,5d,A组GDNF mRNA的表达量明显高于B组,差别有显著性意义(P<0.05)。组化结果分析,移植术后第7,14,28d GDNF的表达量明显高于B组,差别有显著性意义(P<0.05)。结论:NSC在移植后可上调神经营养因子GDNF基因的表达,是修复脊髓损伤的机制之一。     

神经营养因子-3和胶质细胞衍生的神经营养因子共转导对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用

目的　探讨新型的病毒载体 (HSV Amplicon)介导的神经营养因子 3(NT 3)和胶质细胞衍生的神经营养因子 (GDNF)共同表达 ,对耳蜗螺旋神经节细胞 (SGNC)的保护作用。方法　构建能够在独自的转录控制条件下 ,同时表达NT 3和GDNF的HSV Amplicon重组体 (HSVnt 3myc/gdnf)。包装后 ,转导体外培养的内耳细胞 (MOI =1) ,4 8h后分别测定培养基中NT 3和GDNF的含量。建立顺铂 (DDP)致聋的小鼠动物模型 ,2 4只实验小鼠被分成 3组 ,经鼠尾静脉隔日注射DDP两次 ,8mg/kg ,4 8h后再分别经圆窗将 10 μlHSVnt 3myc/ gdnf、HSVnt 3myc/lac和HSVlac病毒悬液注入鼓阶 ,饲养 4周后 ,取出耳蜗 ,采用NIH软件分析系统 ,定量分析耳蜗内SGNC的总数。结果　ELISA显示HSVnt 3myc/gdnf转导的内耳细胞培养基中 ,NT 3的含量达 11 4 4 μg/ml,而GDNF的含量达 1 79ng/ml,与对照组比较 ,差异有显著意义 (P <0 0 1)。在DDP致聋的小鼠模型中 ,定向转染HSVnt 3myc/ gdnf、HSVnt 3myc/lac和HSVlac的耳蜗平均SGNC存活率分别为 88%、77%和2 2 % ,各组间差异有显著意义 (P <0 0 1)。结论　HSV Amplicon介导的NT 3/GDNF共同表达 ,可以刺激SGNC分泌NT 3和GDNF ,有效拮抗耳毒性药物所致的SGNC损伤 ,提高SGNC的残留数量 ,促进SGNC突起的再生。     

GDNF基因修饰的神经干细胞抑制脑卒中后大鼠的Caspase-3表达

目的研究胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neural factor,GDNF)基因修饰的神经干细胞(neuralstem cells,NSCs)移植对脑卒中后大鼠缺血侧脑组织内半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific protein-ase-3,caspase-3)表达的影响,探讨GDNF基因修饰的神经干细胞(GDNF/NSCs)移植对大鼠脑卒中的神经保护作用机制。方法取新生大鼠脑组织分离培养NSCs,收集第6代前的NSCs备用。用重组腺病毒GDNF转染神经干细胞,制备GDNF/NSCs。暂时性阻塞大鼠大脑中动脉制备脑卒中模型,3d后,用脑立体定位仪向卒中侧侧脑室分别给予NSCs、GDNF/NSCs和生理盐水。再灌注时间1周、2周、3周、5周、7周后处死大鼠(n=3)。裂解卒中侧脑组织,离心后得到脑组织蛋白样品,通过蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测Caspase-3表达。结果 GDNF/NSCs、NSCs、NS各组caspase-3的表达在1周、2周、3周、5周、7周各时间点均逐渐降低。NSCs组、GDNF/NSCs组显著低于NS组(P<0.01;P<0.001);GDNF/NSCs组明显低于NSCs组(P<0.01)。结论 GDNF/NSCs移植治疗脑卒中的机制可能与抑制caspase-3表达有关。     

体外培养神经干细胞PDGF、EGF和GDNF的表达

目的为研究体外培养小鼠神经干细胞（NSC）血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的基因表达.方法取小鼠胚胎海马NSC培养并鉴定,提取其总RNA,用RT-PCR技术检测培养NSC内PDGF、EGF、GDNFmRNA的表达.结果培养NSC中PDGF mR-NA表达最强,EGF mRNA明显表达,但几乎未检测到GDNF mRNA.结论为了解NSC分泌神经营养因子发挥生物学作用提供了理论基础.     

大鼠脑缺血再灌注后GDNF mRNA的表达及人参皂甙Rb1对其的影响

目的:从分子水平探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注后的GDNFmRNA表达规律及人参皂甙Rb1对其的影响。方法:阻塞大鼠大脑中动脉2h再灌注3h至10d制备脑缺血模型,通过RT-PCR方法克隆的大鼠GDNFcDNA构建重组腺病毒质粒,并用质粒制备地高辛标记的GDNFcDNA探针,采用原位杂交技术观察脑缺血模型不同时程GDNFmRNA的表达及人参皂甙Rb1对其的影响。结果:GDNFmRNA主要分布于神经细胞的突起,在纤维束处更明显。脑缺血再灌注3h后GDNFmRNA表达出现上调反应,3d达高峰,此后逐渐减弱。人参皂甙Rb1能促进GDNFmRNA的表达。结论:脑缺血再灌注后GDNFmRNA的表达与缺血性损伤有一定的联系,人参皂甙Rb1对中枢神经系统有保护作用。     

肺腺癌A549细胞株GDNF、BDNF、NT3和NT4的表达

目的探讨神经营养因子在肺腺癌细胞株A549中的表达及临床意义.方法体外培养肺腺癌A549细胞株,观察细胞形态变化.取代培养后3 d的A549细胞,用免疫组化检测神经营养因子GDNF、BD-NF、NT3和NT4在肺腺癌细胞株A549的表达.结果神经营养因子GDNF、BDNF、NT3和NT4在部分肺腺癌细胞株A549中表达.结论神经营养因子GDNF、BDNF、NT3和NT4可能在肺癌的增殖中发挥作用.     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导     

GFP标记的重组腺病毒GDNF基因在脑缺血大鼠脑内的表达

目的：研究绿色荧光蛋白（GFP）标记的重组腺病毒胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因在脑缺血大鼠脑内的表达。方法：采用改良的线栓法制作脑缺血再灌注模型,3d后用脑立体定位仪经侧脑室注射生理盐水或GDNF重组腺病毒液,注射前及注射后4d对大鼠进行神经功能损伤程度评分（NSS）。注射后4d麻醉处死大鼠,脑组织石蜡包埋。抗GFP免疫组织化学方法观察重组腺病毒GDNF基因在脑内的表达。结果：注射后4d,GDNF组与NS组相比,NSS评分显著降低;GDNF组,注射后4d,缺血侧纹状体内和梗死灶周围有大量GFP阳性细胞。结论：腺病毒介导的GDNF基因在脑缺血大鼠脑内能直接感染病灶周围神经细胞,表达GDNF蛋白,改善缺血后大鼠的神经功能状况。