联合应用IL—2及IL—4基因转染瘤苗对实验性肺转移…

将ＩＬ－２基因转染的高分泌ＩＬ－２的Ｂ１６黑色素瘤细胞株（Ｂ２）及ＩＬ－４基因转染的高分泌ＩＬ－４的Ｂ１６黑色素瘤细胞株（Ｂ４）制备成新型瘤苗，用以治疗实验性肺转移荷瘤小鼠，并辅以低剂量环磷酰胺，结果表明，荷瘤小鼠存活期明显延长；肺部转移结节数明显减少；两种瘤苗联合治疗后的疗效较单独使用明显，当辅以低剂量环磷酰胺时治疗效果更加明显。体内免疫功能检测表明，经两种瘤苗联合治疗的荷瘤小鼠脾细胞ＮＫ及ＣＴ     

多发性骨髓瘤患者IL－1、IL－6测定及相关性研究

以ＥＬ４＋ＣＴＬＬ－２及７ＴＤ１细胞株增殖法分别检测ＩＬ－１和ＩＬ－６，发现多发性骨髓瘤患者ＰＢＭＣ及骨髓瘤细胞培养上清中ＩＬ－１与ＩＬ－６水平均高于正常对照，且ＩＬ－１和ＩＬ－６水平变化呈平行相关，基因重组ＩＬ－１α和β可剂量依赖性增强骨髓瘤细胞产生ＩＬ－６，提示ＩＬ－１可诱导人类多发性骨髓瘤细胞产生ＩＬ－６，进而刺激瘤细胞增殖。     

瘤体内注射IL—2基因后肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞的功能分析

将脂质体包裹的ＩＬ－２基因直接注射至Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤瘤体内，研究肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）的功能变化。１０ｄ后，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定显示瘤体内注射ＩＬ－２基因后肿瘤细胞及ＴＩＬ中ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达阳性；经Ｇ４１８筛选后的肿瘤细胞培养上清中可检测出ＩＬ－２；肿瘤细胞表面表达了较高水平的ＭＨＣＩ类抗原（Ｈ２Ｋ＾ｂＤ＾ｂ）；ＴＩＬ表面粘附分子ＬＡＦ－１表达也明显高于对照组，其     

IL—3基因转染的肿瘤细胞增强机体免疫功能的实验研究

建立了ＩＬ－３基因转染的Ｂ１６小鼠黑素瘤细胞株（Ｂ１６－ＩＬ－３），发现其体内的致瘤性和肺转移能力明显下降，对其免疫机理作一探讨，结果发现接种Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的小鼠脾细胞体所诱生的ＬＡＫ活性和ＣＴＬ活性显著升高，外周血和脾细胞的ＣＤ４／ＣＤ８比值都有所升高，此外，在裸鼠体内，Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的致瘤性也有一定程度的降低，结果表明ＩＬ－３基因转染的肿瘤细胞能诱导机体的特异性和非特异性免疫功能，     

通过维持微环境IL－2水平抑制肿瘤形成

为研究肿瘤微环境中ＩＬ－２对肿瘤生长的抑制效应，用转基因方法，将携带ｍＩＬ－２ｃＤＮＡ基因的牛乳头瘤病毒载体（ＢＣＭＧ）转染小鼠Ｂ１６瘤细胞，获稳定持久分泌ｍＩＬ－２的Ｂ１６细胞株（ｍＩＬ－２＋Ｂ１６）。动物实验结果显示：ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞的致瘤性明显下降，但体外生长率与其亲代Ｂ１６细胞相比较无区别。用ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞诱导的小鼠腹腔渗出细胞（ＰＥＣ）对ＹＡＣ－１靶细胞和Ｂ１６靶细胞的体外杀伤能力比对照组ＰＥＣ（Ｂ１６诱导的ＰＥＣ）高一倍以上（Ｐ＜０．０１）。表明提高微环境中的ＩＬ－２水平能提高抗肿瘤免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤的形成。     

多发性骨髓瘤患者IL－1、IL－6测定及相关性研究

以ＥＬ４＋ＣＴＬＬ－２及７ＴＤ１细胞株增殖法分别检测ＩＬ－１和ＩＬ－６，发现多发性骨髓瘤患者ＰＢＭＣ及骨髓瘤细胞培养上清中ＩＬ－１与ＩＬ－６水平均高于正常对照，且ＩＬ－１和ＩＬ－６水平变化呈平行相关，基因重组ＩＬ－１α和β可剂量依赖性增强骨髓瘤细胞产生ＩＬ－６，提示ＩＬ－１可诱导人类多发性骨髓瘤细胞产生ＩＬ－６，进而刺激瘤细胞增殖。     

瘤体内注射IL－2基因后肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞的功能分析

将脂质体包裹的ＩＬ－２基因直接注射至Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤瘤体内，研究肿瘤细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）的功能变化。１０ｄ后，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定显示瘤体内注射ＩＬ－２基因后肿瘤细胞及ＴＩＬ中ＩＬ－２ｍＲＮＡ表达阳性；经Ｇ４１８筛选后的肿瘤细胞培养上清中可检测出ＩＬ－２；肿瘤细胞表面表达了较高水平的ＭＨＣⅠ类抗原（Ｈ－２Ｋ￣ｂＤ￣ｂ）；ＴＩＬ表面粘附分子ＬＡＦ－１表达也明显高于对照组，其杀伤Ｂ１６细胞的活性明显增强。结果表明瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因后，可在肿瘤原位将基因转移至肿瘤细胞及ＴＩＬ中，提高肿瘤细胞的ＭＨＣⅠ类抗原的表达，增强肿瘤细胞的免疫原性，并通过提高ＴＩＬ粘附分子的表达，共同促进ＴＩＬ的肿瘤特异性杀伤功能。     

TNF-α基因和IL-2基因共转染的肿瘤细胞体内致瘤性和瘤苗效果的观察

为了探讨两种具有协同作用的细胞因子共转染的瘤苗是否具有更好的抗肿瘤作用，我们将ＴＮＦ－α基因和ＩＬ－２基因转染Ｂ１６黑色素瘤细胞，获得同时分泌ＩＬ－２和ＴＮＦ的Ｂ１６细胞克隆株（命名为Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞），并观察了其体内致瘤性和瘤苗效果。结果发现，Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的体内致瘤性显著低于ＴＮＦ－α基因或ＩＬ－２基因单独转染的Ｂ１６细胞；而且，事先接种Ｂ１６－ＩＬ－２＋－ＴＮＦ－α＋细胞的小鼠能抵抗再接种的野生型肿瘤细胞的生长，表明其具有更佳的瘤苗效果。     

通过维持微环境IL－2水平抑制肿瘤形成

为研究肿瘤微环境中ＩＬ－２对肿瘤生长的抑制效应，用转基因方法，将携带ｍＩＬ－２ｃＤＮＡ基因的牛乳头瘤病毒载体（ＢＣＭＧ）转染小鼠Ｂ１６瘤细胞，获稳定持久分泌ｍＩＬ－２的Ｂ１６细胞株（ｍＩＬ－２＋Ｂ１６）。动物实验结果显示：ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞的致瘤性明显下降，但体外生长率与其亲代Ｂ１６细胞相比较无区别。用ｍＩＬ－２＋Ｂ１６细胞诱导的小鼠腹腔渗出细胞（ＰＥＣ）对ＹＡＣ－１靶细胞和Ｂ１６靶细胞的体外杀伤能力比对照组ＰＥＣ（Ｂ１６诱导的ＰＥＣ）高一倍以上（Ｐ＜０．０１）。表明提高微环境中的ＩＬ－２水平能提高抗肿瘤免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而抑制肿瘤的形成。     

白细胞介素2基因转移的肿瘤细胞克隆的建立及其体内外生长特性的研究

为了开展ＩＬ－２基因转移后免疫原性增强的新型瘤苗抗肿瘤作用的研究，须首先获得ＩＬ－２基因转移后、能够高分泌ＩＬ－２的肿瘤细胞并确定其生长特性。本室构建了含５６３ｂｐ的小鼠ＩＬ－２全长ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２，采用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法将ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－２转移入Ｂ１６黑色素瘤细胞中，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及活性检测，获得一株高分泌ＩＬ－２（５０６Ｕ／ｍｌ）克隆，并经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法证实ＩＬ－２基因已转入该克隆中。结果表明ＩＬ－２基因转移的肿瘤细胞体外生长能力没有明显变化，但体内致瘤原性显著下降，从而为制备新型瘤苗打下了基础。     

IL-3基因转染的肿瘤细胞体内对巨噬细胞数目和功能的影响

曾发现转染IL—3基因的黑色素瘤细胞(B16—IL—3)体内致瘤性下降,肿瘤组织有包括巨噬细胞在内的大量炎症细胞浸润。进而研究了C57BL/6小鼠在皮下接种B16—IL—3细胞后,腹腔巨噬细胞数目和功能的变化。在接种B16-IL-3细胞后第4天,腹腔巨噬细胞的数目就升高1倍,接种后第10～15天升高5～6倍。而且体外无需LPS的刺激,腹腔巨噬细胞就能分泌一定水平的细胞因子IL—1、IL—6和TNF,具有较强的杀伤活性,体外经LPS刺激后,其分泌水平和杀伤活性继续升高,明显高于对照组。此外。腹腔巨噬细胞MHC二类抗原Ia的表达也明显增强。提示B16—IL—3细胞分泌的IL—3有效地激活了体内的巨噬细胞,这可能是B16—IL—3细胞体内致瘤性下降的原因之一。     

联合应用IL-2及IL-4基因转染瘤苗对实验性肺转移肿瘤的治疗作用

将IL—2基因转染的高分泌IL—2的B16黑色素瘤细胞株(B2)及IL—4基因转染的高分泌IL—4的B16黑色素瘤细胞株(B4)制备成新型瘤苗,用以治疗实验性肺转移荷瘤小鼠,并辅以低剂量环磷酰胺,结果表明,荷瘤小鼠存活期明显延长;肺部转移结节数明显减少;两种瘤苗联合治疗后的疗效较单独使用明显,当辅以低剂量环磷酰胺时治疗效果更加明显。体内免疫功能检测表明,经两种瘤苗联合治疗的荷瘤小鼠脾细胞NK及CTL杀伤活性升高得更加明显,但对LAK活性及腹腔巨噬细胞杀伤活性无明显协同增强作用;脾细胞经诱导后产生的细胞因子中,IL—2含量有所升高。     

IL—6基因转染的瘤苗体内诱导的抗肿瘤免疫功能与效果

经丝裂霉素C体外处理后,将IL-6基因转染的、高分泌的IL-6的B16黑色素瘤细胞制成瘤苗。结果发现,体内注射IL-6基因转染的瘤苗后,小鼠脾脏CTL活性、NK活性及IL-2诱导的LAK活性显著升高。经IL-6基因转染瘤苗体内治疗后,荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长显著减慢、肺转移结节数显著降低、存活期显著延长,若同时合用低剂量IL-2,则上述治疗效果更好。可见IL-6基因转染的瘤苗能有效地通过诱导机体抗肿瘤免疫功能而发挥抗肿瘤作用,与低剂量IL-2合用后,IL-6基因转染的瘤苗的抗肿瘤效果更佳。     

人IL-6基因转染的小鼠黑色素瘤细胞B16-IL-6~ 致瘤性降低的实验研究

应用细胞因子基因转染的瘤苗治疗肿瘤是近年来肿瘤基因治疗的重要进展之一。本研究采用磷酸钙DNA共沉淀法将人IL-6基因转染入B16黑色素瘤细胞中,筛选出一株高分泌IL—6(240U/ml)克隆(B16—IL—6~ ),B16—IL-6~ 细胞体外生长能力减弱,小鼠皮下接种后肿瘤结节形成率降低,生长速度减慢,并对再次接种野生型B16细胞具有抵抗作用。小鼠静脉接种后形成的肺转移结节数显著减少,荷瘤小鼠存活期延长。结果表明IL-6基因转染的肿瘤细胞致瘤性显著下降。并能诱导机体产生抗肿瘤免疫功能。     

不同细胞因子基因转导对小鼠B16细胞体内生长及免疫原性的影响

目的：通过比较不同细胞因子基因转导对肿瘤细胞体内生长及对机体免疫活性的影响,探讨基遥作用机制及因子间的协同效果。方法：采用逆转录病毒介导的方法将ＩＬ－６／ＩＬ－２融合基因及ＩＬ－６、ＩＬ－２单基因分别导入小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞中,检测基因修饰瘤细胞体内成瘤及对机体ＬＡＫ、ＣＴＬ活性的诱导。结果：三种基因修饰的肿瘤细胞均可表现出体内生长抑制及免疫原性增强,但融合基因转导细胞的改变,较单一基因修饰细胞     

瘤体内注射脂质体包裹的IL－2基因的抗肿瘤作用及其局部免疫机理分析

脂质体可以介导体内的细胞因子基因治疗。将脂质体包裹的ＩＬ－２基因直接注射到小鼠黑色素瘤（Ｂ１６－Ｆ１０）瘤体内，结果发现，肿瘤的生长明显受到抑制，部分小鼠的瘤体完全消退，存活期明显延长；从瘤体中分离的肿瘤细胞经Ｇ４１８筛选后产生阳性克隆，其上清中分泌有ＩＬ－２；肿瘤局部浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）具有较高的杀伤活性，揭示瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因后，可增强肿瘤细胞的免疫原性，激活瘤体局部的抗肿瘤免疫功能。结果表明瘤体内注射脂质体包裹的ＩＬ－２基因具有良好的抗肿瘤效果。     

白细胞介素4基因转移的肿瘤细胞体外生物学特性及体内致瘤性的研究

观察了白细胞介素４（ＩＬ－４）基因转移的肿瘤细胞体内致瘤性的变化。构建了含５００ｂｐ的小鼠ＩＬ－４ｃＤＮＡ的真核表达载体ＢＭＧＮｅｏ－ＩＬ－４．用该表达载体将ＩＬ－４基因转移至小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞，通过Ｇ４１８抗性筛选、有限稀释法及ＩＬ－４活性检测，获得了高分泌ＩＬ－４的黑色素瘤细胞克隆株并经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹鉴定，将其接种于小鼠皮下后观察到肿瘤生长缓慢、小鼠存活期延长，表明高分泌ＩＬ－４的细胞克隆株体内致瘤性显著下降。该结果为进一步研究肿瘤的ＩＬ－４基因治疗打下了基础。     

IL—2激活的肿瘤浸润性淋巴细胞与LAK细胞体内外抗肿瘤作用的比较

本文对TIL与LAK细胞的体外,体内抗肿瘤作用进行了比较。发现TIL对自体肿瘤细胞有选择性地杀伤作用,其杀伤活性强于LAK细胞,但TIL对其他无关的肿瘤细胞的杀伤作用弱于LAK细胞,其对ConA诱导的正常淋巴母细胞无杀伤作用,而LAK细胞对比正常细胞有一定的杀伤作用。能特异性阻断抗B16黑色素瘤细胞CTL活性的单抗能抑制来自B16黑色素瘤的TIL对B16细胞的杀伤作用,提示TIL中富含CTL。体内试验证明,就单个细胞能力来讲,TIL的抗肿瘤作用确比LAK细胞强且对LAK细胞治疗无效的晚期肿瘤仍有一定的治疗效果。本研究证明TIL比LAK细胞更适合应用于肿瘤的过继免疫疗法。     

Heterogeneous susceptibility of human melanoma clones to monocyte cytotoxicity: role of ICAM-1 defined by antibody blocking and gene transfer.

Five clones derived from the same human malignant melanoma lesion were studied for their susceptibility to killing by human monocytes activated by exposure to interferon (IFN)-gamma and lipopolysaccharide. Melanoma clones were heterogeneous in their susceptibility to human monocyte cytotoxicity, with one clone (2/21) exhibiting extremely low levels of lysis. The different levels of susceptibility to monocyte cytotoxicity were not accounted for by susceptibility or resistance to monokines [tumor necrosis factor (TNF), interleukin (IL)-1 and IL-6] because: (a) these effector molecules had little (TNF) or no (IL-1 and IL-6) cytolytic activity under these conditions; and (b) anti-TNF antibodies had marginal effects on cytotoxicity. Monocytes bound less to resistant than to susceptible melanoma cells. Monocyte-resistant 2/21 melanoma cells expressed substantially lower levels of ICAM-1 and VLA-4 than susceptible cells. Anti-CD18 and, to a lesser extent, anti-ICAM-1 mAb inhibited binding and cytotoxicity of human monocytes on malignant melanoma whereas anti-VLA-4 had no inhibitory action. Transfection of the ICAM-1 gene under the control of a constitutive promotor resulted in high levels of expression of ICAM-1 in 2/21 melanoma cells and, concomitantly, in augmented susceptibility to activated monocyte cytotoxicity. The augmented killing of ICAM-1 transfected 2/21 cells was inhibited by anti-ICAM-1 mAb. These results demonstrate that the CD18-ICAM-1 adhesion pathway can play an important role in the expression of human monocyte cytotoxicity on melanoma target cells and that heterogeneity in expression of ICAM-1 can underlie differences in susceptibility to tumoricidal activity.