The mechanical study of vascular endothelial growth factor on the prevention of restenosis after angioplasty

Restenosis following percutaneous transluminalcoronary angioplasty ( PTCA) is one of the majorre-search subjects of coronary heart disease( CHD) .The mechanism is quite complicated and not yetclear,buttheimpairmentofendothelium isknown asthe primary evocative factor of the progress ofrestenosis.It is supposed to prevent the restenosisfollowing PTCA by accelerating restoration of en-dothelial integrity and function.In the experimentalstudies,it was proved that exogenic vascular en-dothelial…     

Experimental Study of Adenovirus Vector Mediated-hVEGF165 Gene on Prevention of Restenosis after Angioplasty

This study evaluated the effects of adenovirus vector mediated human vascular endotheli-al growth factor-165 (hVEGF165) gene on prevention of restenosis after angioplasty. Rabbit models of bilateral carotid artery injury were established by balloon denudation. The recombinant adenovi-ruses containing hVEGF165 cDNA was directly injected into left side of the injured carotid arteries.On day 3 and week 3 after transfection the expression of VEGF was observed by RT-PCR and im-munohistochemistry. The thrombokinesis, reendothelialization (rET) and intimal hyperplasia in ca-rotid arteries were evaluated by computerized image analysis system 3 weeks after gene transfer,The changes in the VEGF gene-treated side were compared with the control side. Our results showed that 3 days and 3 weeks after hVEGF165 gene transfer the VEGF mRNA and antigen ex-pression were detected in vivo. 3 weeks after the transfer, the carotid artery rET was markedly better in the VEGF gene-treated group compared with the control. The thrombokinesis, intima are-a/media area (I/M), maximal intimal and medial thicknesses (ITmax and MTmax) demonstrated a statistically significant decrease in arteries treated with VEGF gene as compared with the control group. It is concluded that VEGF gene transfer could be achieved by intra-arterial injection of re-combinant adenoviruses. It might accelerate the restoration of endothelial integrity, inhibit throm-bokinesis and attenuate intimal hyperplasia in the injured arteries after VEGF gene transfer. This procedure could be useful in preventing restenosis after angioplasty.     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Summary To construct the recombinant adenovirus vector containing the cDNA for human vascular endothelial growth factor (hVEGF₁₆₅), the cDNA for hVEGF₁₆₅ was subcloned into pACCMV · pLpA. Subsequently, this recombinant pACCMV · hVEGF was co-transfected into 293 cells together with pJM17 to obtain the replication-deficient recombinant adenovirus containing hVEGF gene — Ad-CMV · hVEGF. The VEGF gene expression was detected by using RT-PCR and Western blot in rabbit aorta vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with AdCMV · hVEGF. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with the conditioned medium (CM) from above mentioned VSMC infected with AdCMV · hVEGF to observe the effect of VEGF on proliferation of HUVEC. 48 h after the infection with AdCMV · hVEGF, VSMC demonstrated VEGF expression, and the expressed VEGF could stimulate the proliferation of HUVECin vitro. Successfully prepared AdCMV · hVEGF₁₆₅ could express biologically active VEGF in infected VSMC, and stimulate proliferation of HUVEC.     

hVEGF基因防治血管成形术后再狭窄

目的 :观察人血管内皮生长因子 (h VEGF)基因对血管成形术后再狭窄的防治作用。 方法 :建立兔颈总动脉球囊损伤模型 ,以先期构建的真核表达质粒 pc DNA3/ h V EGF1 6 5 (5 0 0 μg,n=12 )和真核载体 pc DN A3(5 0 0 μg,n=12 )分别于血管腔内给药 ,给药后 2周、4周先行颈总动脉造影 ,再取材分别行 H- E、VB染色及 Northern blot分析。结果 :给药后 2周、4周颈总动脉造影示治疗组直径狭窄较对照组明显减少 ;病理检测示 2周、4周治疗组管腔狭窄率较对照组显著减轻 [(9.5 8± 1.35 ) % vs(31.72± 1.72 ) % ;(18.0 9± 2 .93) % vs (44 .0 5± 3.2 8) % ,P<0 .0 1];Northern blot分析显示 2周、4周治疗组特异性条带显色较对照组明显增强。 结论 :pc DNA3/ h VEGF1 6 5 裸质粒 DNA血管腔内给药能转染平滑肌细胞并持续表达至少 4周 ,促进了内皮细胞再生 ,减轻了血管成形术后再狭窄程度。     

转导血管内皮生长因子预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)预防血管成形术后再狭窄。方法建立动脉粥样硬化兔模型,利用球囊在该模型腹主动脉导入pcDNA3.0/hVEGF165(n=10),对照组导入空载体(n=10)。采用RT-PCR法检测外源VEGF基因的表达。术后2、4周观察转导外源基因对血管内皮修复的影响。术后1、2、4周行MRI检查,观察左肾动脉开口处上段被扩张腹主动脉的管腔面积变化。结果利用球囊导管能成功转导pcDNA3.0/hVEGF165,治疗组和对照组完成内皮修复的时间分别为2周和4周,术后2周治疗组和对照组的管腔面积分别为(7.95±1.42)mm2和(6.74±1.01)mm2,术后4周分别为(7.40±2.29)mm2和(2.21±1.44)mm2。结论在动脉粥样硬化兔模型局部血管利用球囊导管能成功地转导VEGF基因,有效促进局部血管内皮细胞的生长,取得抑制局部血管管腔狭窄的作用,这对于防止血管介入术后再狭窄发生具有十分重要的意义。     

野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型ｐ５３基因逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体介导，将野生型ｐ５３基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１ｄ后观察其对新生内膜形成的影响，并检测ｐ５３蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型ｐ５３基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中表达；用逆转录病毒载体转导野生型ｐ５３基因至大鼠球囊损伤的颈动脉，免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型ｐ５３蛋白，且与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４４％。结论人野生型ｐ５３基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Thedevelopmentofgene therapieshas renderedits clinical application feasible.Vascular endothelialgrowth factor( VEGF) hasbeen approved to be usedfor clinical trials.VEGF plays an important role inangiogenesis and prevention of restenosis[1-8] ,butthelow efficiency of plasmid vector restricts its clinicalapplication.In this study,the h VEGF165c DNA wassubcloned into p ACCMV .p Lp A and subsequentlythis recombinant was co- transfected into 2 93cellswith p JM1 7to obtain the replication- …     

腺病毒载体介导的VEGF165基因治疗大鼠缺血皮瓣的实验研究

目的 探讨局部应用以腺病毒为载体的血管内皮生长因子(Ad-VEGF165)基因治疗对大鼠缺血皮瓣生存的影响.方法 选用SD大鼠30只,体重350～400 g,随机分成3组,每组10只,在其背部形成8 cm×2 cm的全厚随意型皮瓣.于皮瓣远端皮下分别注射携带血管内皮生长因子基因的腺病毒(Ad-VEGF165目的基因组,简称VEGF165组),携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-GFP基因组对照,简称GFP组),磷酸盐缓冲液(PBS空白对照组,简称PBS组),48 h后按原设计掀起皮瓣并原位缝合,术后7天,测量皮瓣的成活面积,计算成活面积百分比,并采集成活皮瓣组织行免疫组化、组织学检查等.结果 皮瓣成活面积百分比VEGF165组为(69.4±1.3)%,GFP组为(52.2±1.7)%,PBS组为(52.9±2.9)%,VEGF165组皮瓣成活面积百分比明显高于GFP组和PBS组(P＜0.01).免疫组化显示VEGF165组毛细血管周围VEGF沉积,组织切片微血管密度明显高于GFP组和PBS组(P＜0.01).结论 局部皮下注射Ad-VEGF165可诱导局部VEGF蛋白表达,促进新生血管的形成,提高缺血皮瓣的成活面积,是一种简单有效的基因治疗方法.     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础     

支架携带pSV-VEGF_(165)基因促进内皮修复的实验研究

目的评估通过支架向兔颈动脉壁转染pSV -VEGF165基因促进内皮修复的疗效。　方法采用自制支架导送系统 ,由生物凝胶介导 ,将携带质粒 pSV -VEGF165的支架植入兔一侧颈动脉段 ,对侧植入携带质粒 pSV - β- gal的支架作对照。通过RT -PCR、免疫组化染色及扫描电镜 ,观察局部动脉壁外源VEGF基因、蛋白的表达及内皮修复情况。　结果RT -PCR检测证实 ,支架植入术后 1d ,VEGF基因转染动脉段有VEGFmRNA的表达 ;7d表达达高峰。免疫组化染色显示 ,术后 3d外源VEGF蛋白表达 ,表达时间延迟于基因表达 ,但表达趋势与基因表达一致。扫描电镜显示 ,治疗组内皮完全修复时间提前至术后 1月。　结论采用支架携带基因的方法能成功将 pSV -VEGF165基因转移至血管壁 ,血管壁细胞能摄取基因 ,并表达具有生物学功能的蛋白质 ,促进内皮修复。     

VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用

目的构建血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF165）真核表达载体,研究其对胃癌生成的作用. 方法用DNA重组方法,将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中,构建VEGF165 mRNA真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术,将重组体转入人胃癌细胞（SGC-7901）省系;观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标. 结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强. 与未转染细胞相比,转染细胞的G2/M期细胞增加(0.44)而S期细胞减少(0.17),克隆形成率(9.0%)明显高于未转染细胞(4.0%). 瘤细胞接种裸鼠后33 d,过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积（2351±638) mm3明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长,另外,VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

新法制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒

目的 应用简化的细菌内同源重组法高效制备含血管内皮细胞生长因子(VEGF)启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。方法 先以氯化钙法替代电穿孔法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌,制备BJ5183pAdEasy-1细菌;再以后者作感受态细菌,与线性化的转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK,转染293细胞,制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为60%(6/10)。转染293细胞后7~12d可收获病毒。结论 简化的细菌内同源重组法简便易行,重组效率较高,易于推广应用。     

Experimental Study of Salvia Miltiorrhiza on the Prevention of Restenosis after Angioplasty

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｓａｌｖｉａ　Ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ　ａｆｔｅｒ　ＡｎｇｉｏｐｌａｓｔｙＺＨＯＵＸｉａｏ－ｍｉｎｇ，ＬＵＺａｉ－ｙｉｎｇａｎｄＷＡＮＧＤａｏ...     

携hVEGF165基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF165)基因的重组腺病毒载体。方法　将hVEGF165cDNA亚克隆到腺病毒中间载体pACCMV·pLpA ,再与pJM17共转染人胚肾 2 93细胞 ,获得载hVEGF165基因的复制缺陷型重组腺病毒 ,感染体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) ,通过RT PCR和Westernblot检测VEGF表达情况 ,并观察表达产物VEGF对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖的影响。结果　重组腺病毒感染VSMC 4 8h后有VEGFmRNA转录及蛋白质的表达 ,并呈剂量依赖性地促进HUVEC增殖。结论　构建的重组腺病毒载体在VSMC中能够有效表达目的基因 ,且能有效促进HUVEC增殖 ,为hVEGF165基因的实际应用奠定了基础。     

野生型Rb基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的：探讨人野生型Rb基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法：通过逆转录病毒载体介导，将野生型Rb基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，21天后观察其对新生内膜形成的影响，并检测Rb蛋白表达水平。结果：成功地构建和包装了人野生型Rb基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中成功表达；免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型Rb蛋白，与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了49％。结论：人野生型Rb基因治疗时血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

Ad-VEGFP-CD/TK系统诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨腺病毒介导的VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系(Ad-VEGFP-CD/TK)对胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤作用.方法 用重组腺病毒Ad-VEGFP-CD/TK体外感染表达VEGF的SGC-7901细胞,荧光显微镜观察其感染效率,然后给予前药GCV和5-FC,用光镜、透射电镜观察及流式细胞术等方法观察细胞凋亡、细胞周期、细胞内DNA含量及钙离子浓度的变化.结果 腺病毒的感染率随病毒滴度的增高而递增,在感染复数为100时,前药GCV和5-FC在一定浓度搭配范围内呈剂量和时间依赖性地诱导SGC-7901细胞凋亡,电镜下可见细胞凋亡的典型改变.用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰;细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多,G2-M及S期细胞减少;此外,前药还可以引起细胞内Ca2 浓度持续增加.结论 VEGF启动子可调控双自杀基因系统选择性诱导表达VEGF的SGC-7901细胞凋亡,其机制与细胞内钙离子浓度升高有关.     

VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用

目的 探讨VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFP-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用.方法 分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞,给予前药5-FC、GCV,测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应.结果 与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用,并可见较明显的旁观者效应.而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用无显著性差异.结论 VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似.     

经心包腔转染腺病毒血管内皮生长因子165基因对猪冠脉血管形成的影响

目的:探讨以腺病毒为载体的血管内皮生长因子165(Ad-VEGF165)基因经心包腔转染的表达规律、合适的剂量及对缺血心肌血管生成的作用.方法:随机将20头中华小型猪分为实验组和对照组,每组10头.采用球囊堵塞前降支第一对角支远端建立心肌梗死模型.构建后即刻,实验组采用经皮剑突下穿刺,中心静脉导管插入心包腔内,以含胶原酶1 200 u及透明质酸酶3 000 u的生理盐水2 ml预处理心包后,在心包腔内注入含Ad-VEGF165基因2.0×109pfu的生理盐水1 ml;对照组同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 ml.注射后3 d(n=2)、7 d(n=2)及28 d(n=6)分别用免疫组化、超声心动图检测缺血心肌血管新生情况及心功能,并以酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血浆及心肌组织中Ad-VEGF165的表达.结果:Ad-VEGF165基因经心包腔转染缺血心肌组织后,在心肌组织中呈高表达,于7 d达到高峰,28 d降至基线水平,血浆中无目的基因的表达;28 d时,实验组缺血心肌微血管密度(MVD)、心功能均明显高于对照组(MVD(517.00±75.70)mm-2vs(226.50±54.10)mm-2,P=0.009;LVEF(%)(72.11±5.20)w(55.14±4.37),P=0.005).结论:用胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,经其转染Ad-VEGF165可以诱导急性心肌梗死模型局部VEGF蛋白表达,促进缺血心肌组织血管新生并能改善心功能.     

VEGF165基因转染EPCs移植对大鼠阿霉素肾病组织学的影响

目的 构建含血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒(Ad-VEGF165),转染血管内皮祖细胞(EPCs)后,观察其对阿霉素肾病大鼠肾脏组织学的影响.方法 用细菌内同源重组法构建含VEGF165基因的重组腺病毒Ad-VEGF165,通过PCR和Western blot鉴定所构建的腺病毒.贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs,Ad-VEGF165体外转染EPCs,检测转染后目的基因的蛋白表达.大鼠阿霉素肾病模型形成过程中,尾静脉注射转染Ad-VEGF165的EPCs,在第16周时观察肾脏组织学变化.结果 PCR和Western blot证实构建的重组腺病毒含有目的基因,滴度为1.4×1010PFU/ml;培养第6天的EPCs用于Ad-VEGF165转染,转染后24 h,培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加.转染了VEGF165基因的EPCs移植后第12周(切肾术后16周),转染组的肾小球硬化和肾小管间质纤维化的程度明显较肾病组轻.结论 转染了VEGF165基因的EPCs可以减轻阿霉素肾病的肾小球和肾小管的损伤程度,为VEGF在慢性肾脏病治疗提供了实验基础.     

Rapid Construction of EGFP Labled Recombinant Adenovirus Containing hVEGF165 and Its Expression in Haematopoietic Cells

Vascular endothelial growth factor(VEGF) isan endothelial cell specific mitogen that plays an im-portantrole in normal and pathological angiogenesis.More and more reports have revealed the significantregulation of embryonic and postnatal hematopoiesisby VEGF[1— 4 ] .Though the application of recombi-nant VEGF in many studies hasmade some inspiringresults,there still exists problems such as the expen-sive price and difficulties in procession of delivery.However,by using adenoviral vector,…