简化的两步法细菌内同源重组高效制备腺病毒质粒

目的 :应用简化的两步法细菌内同源重组高效制备腺病毒质粒。方法 :对细菌内同源重组法进行改进和简化 ,先构建含腺病毒基因组质粒pAdEasy 1的BJ5 183细菌 ,筛选出链霉素和氨苄青霉素抗性菌落 ,继而应用氯化钙法制作BJ5 183pAdEasy 1感受态细菌。用PmeⅠ酶使转移质粒pAdtrack CMV TK线性化 ,和BJ5 183pAdEasy 1感受态细菌混合进行转化 ,在含 12 5 μg mL卡那霉素的LB琼脂平皿上培养 ,筛选出卡那霉素抗性的细菌进行质粒抽提纯化 ,获得重组腺病毒质粒。结果 :卡那霉素抗性细菌有 2种 ,一种是含pAdeasy CMV TK(约 34kb) ,另一种含pAdtrack CMV TK(约 10kb) ,两者可经琼脂糖电泳加以鉴别。构建重组腺病毒质粒的成功率达 90 % (9 10 )。结论 :简化的两步法细菌内同源重组是一种简便易行、快速高效的腺病毒质粒构建方法     

简化的两步法细菌内同源重组高效制备腺病毒质粒

目的：应用简化的两步法细菌内同源重组高效制备腺病毒质粒。方法：对细菌内同源重组法进行改进和简化，先构建含腺病毒基因组质粒pAdEasy-1的BJ5183细菌，筛选出链霉素和氨苄青霉素抗性菌落，继而应用氯化钙法制作BJ5183pAdEasy-1感受态细菌。用PmeⅠ酶使转移质粒pAdtrack-CMV-TK线性化，和BJ5183pAdEasy-1感受态细菌混合进行转化，在含12．5μg／mL卡那霉素的LB琼脂平皿上培养，筛选出卡那霉素抗性的细菌进行质粒抽提纯化，获得重组腺病毒质粒。结果：卡那霉素抗性细菌有2种，一种是含pAdeasy-CMV-TK(约34kb)，另一种含pAdtrack-CMV-TK(约10kb)，两者可经琼脂糖电泳加以鉴别。构建重组腺病毒质粒的成功率达90％(9／10)。结论：简化的两步法细菌内同源重组是一种简便易行、快速高效的腺病毒质粒构建方法。     

细胞因子裸质粒DNA的抗肿瘤研究

目的 探讨瘤体内直接注射细胞因子裸质粒DNA(pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15基因)对小鼠肺腺癌的治疗作用。方法 将pcDNA3．1-GM-CSF基因和pcDNA3．0-IL-15基因2种细胞因子基因直接注射到小鼠肺腺癌瘤体内，采用病理分析和免疫组化方法，对pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15转基因治疗后的小鼠肿瘤组织进行分析。结果 应用pcDNA3．1-GM一CSF和pcDNA3．0-IL-15裸质粒DNA，通过直接注射均可抑制肿瘤生长。经pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15基因治疗后，肺癌组织内可见有部分坏死，瘤体内有大量炎性细胞及部分树突状细胞浸润。细胞因子GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15基因在肿瘤组织中有不同程度的表达。结论 细胞因子裸质粒pcDNA3．1-GM-CSF和pcDNA3．0-IL-15直接注射，可以在组织中表达，并具有显著抗肿瘤作用。     

HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞的研究

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病.为了探索乙肝病毒通过卵母细胞垂直传递的可能性,对HBV DNA重组质粒能否转染小鼠卵母细胞进行了研究.材料与方法:将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA重组质粒进行共培养后,分别提取卵母细胞DNA及制备小鼠卵母细胞中期染色体.用PCR、Southern、斑点杂交及FISH技术证实HBV DNA能否转染小鼠卵母细胞.结果:PCR试验在受检样本中观察到HBV DNA阳性条带.Southern试验在受检PCR产物中观察到明显的阳性杂交信号.用每次实验的最后3次洗液进行斑点杂交未发现HBV DNA阳性信号,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性.荧光原位杂交在1 000个卵母细胞中的36个中期相内发现HBV DNA杂交信号.结论:HBV DNA序列能够通过卵母细胞的透明带和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到卵母细胞染色体上.此类卵母细胞与正常精子受精时,有可能作为载体将HBVDNA带进胚胎.     

脂质体介导质粒DNA细胞转染的优化研究

Objective:The development of gene carriers for efficient gene delivery into cells has attracted growing attention in recent years.The aim of this study was to achieve a better outcome of AAV-293 cells transfection by plasmid DNA.Methods:We studied the optimal condition for higher efficiency of cationic lipid-mediated cell transfection.Four experimental groups were set.Plasmid DNA and liposome were mixed in each groups at different ratios(μg:μL),1:2.5,1:3.5,1:4.0 and 1:5.0,respectively.LacZ gene functioned a...     

脂质体介导质粒DNA体外细胞转染的优化研究

[目的]研究脂质体介导质粒DNA转染293细胞的优化条件。[方法]通过改变DNA和脂质体的比例来进行优化,设为4个组,各组中DNA和脂质体的比例（μg∶μl）依次设定为1∶2.5、1∶3.5、1∶4.0和1∶5.0,以LacZ为报告基因,测定不同实验组的细胞转染率。[结果]当DNA/脂质体（μg∶μl）=1∶3.5时细胞转染率最高,1∶2.5（脂质体说明书推荐的比例）时细胞转染率最低,两者差异有统计学意义（P〈0.05）。[结论]通过优化转染条件可以显著提高脂质体介导质粒DNA的转染率。     

用质粒DNA复制子载体增强肿瘤特异性免疫反应

为增强核酸疫苗的免疫原性 ,我们使用了包含有从原型α 病毒 (Ｓｉｎｄｂｉｓ)和另一α 病毒 (Ｓｅｍｌｉｋｉ森林病毒 )衍生来的复制子的质粒ＤＮＡ载体。当转染细胞或直接注入动物肌肉后 ,这些质粒发出一种自身复制的ＲＮＡ载体 (复制子 ) ,然后此载体指导一种模型肿瘤抗原的表达。用低于常规ＤＮＡ质粒 10 0到 10 0 0倍的剂量的质粒ＤＮＡ复制子便可激发免疫反应 ,并且能够有效地治疗了荷有这一模型抗原表达的实验肿瘤小鼠。然而 ,含复制子的ＤＮＡ质粒并不产生更多的抗原 ;相反 ,抗原的产生仅在质量上有差别。质粒ＤＮＡ复制子介导了在…     

人Cot—1DNA的制备

目的分离制备人Ｃｏｔ┐１ＤＮＡ，用于肝癌相关基因的定位克隆研究。方法通过羟基磷灰石柱层析分离制备人Ｃｏｔ┐１ＤＮＡ。结果分离得到Ｃｏｔ值等于１的人基因组ＤＮＡ。结论采用羟基磷灰石柱层析法，可方便、快速、经济地分离得到人Ｃｏｔ┐１ＤＮＡ。     

质粒制备和反应温度对嵌套缺失技术的影响

背景与目的：探讨影响嵌套缺失反应的重要因素，找出相应的解决方案。材料与方法：以构建好的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)基因5’端调控区质粒pGLB-G36为研究对象，采用碱裂解法、聚二乙醇纯化法及QIAGEN试剂盒等3种不同方法制备该质粒，分别研究ExoⅢ对它们进行非特异性切割的敏感性，选出对ExoⅢ不敏感的质粒制备方法；在22℃和37℃分别进行缺失反应，琼脂糖凝胶电泳监控，以确定缺失反应是否已经发生；应用PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子。结果：QIAGEN试剂盒制备的质粒对ExoⅢ的非特异性切割最不敏感，可用于进行下一步的缺失反应；在22℃进行缺失反应时，电泳鉴定发现DNA片段的长度没有明显的变短，而在37℃时，同一反应体系的DNA片段长度明显缩短；进一步用限制性内切酶酶切可筛除PCR中的假阳性，获得准确的缺失子。结论：质粒的质量是确保进行特异性缺失反应的关键因素，通过QIAGEN试剂盒制备的质粒质量较好；设立一个37℃缺失对照管可作为判断低温条件下是否发生缺失的标准；PCR技术与限制性内切酶酶切相结合的方法鉴定缺失子，可确保获得特异的缺失子。     

简化人全血细胞DNA非程序合成检测化学致癌物研究

细胞的DNA非程序合成(简称UDS)作为一种反映DNA修复合成的指标,已广泛应用于研究化学物质和物理因子的细胞遗传毒理作用,并已被认为可用作致癌物的快速筛选。过去,研究者曾采用体外培养的人外周血淋巴细胞、人成纤维细胞、HeLa细胞、大鼠肝原代培养细胞等,成功地显示了由致癌性化合物所诱导的UDS,其中人外周血淋巴细胞的UDS,由于其取材方便,已在国内许多实验室建立。但以往的方法,常用PHA激活淋巴细胞,需时较长,操作较繁琐。本     

表达白细胞介素-12质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用

目的 探讨瘤内注射mIL-12质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用。方法：构建真核表达质粒载体pDC511mIL-12，ELISA方法检测质粒载体在真核细胞中的表达，淋巴母细胞增殖法检测mIL-12的生物学活性；分别于小鼠肝癌H22皮下移植瘤内直接注射质粒DNA，观察各组小鼠存活时间、肿瘤体积变化及各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(CTL)的活性：注射质粒DNA后1月进行瘤体组织病理学观察：结果：mIL-12基因治疗组与空载体对照组相比，肿瘤生长显著受抑制(F=4．10，P=0．03)，小鼠存活期显著延长(X^2=4．48，P=0．03)．并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强。质粒DNA瘤内注射1月后，pDC511mIL-12组肿瘤病灶炎性细胞浸润明显，病灶内肿瘤细胞广泛坏死。结论：瘤内注射mIL-12表达质粒DNA可抑制小鼠肝癌皮下移植瘤生长，能提高机体抗肿瘤免疫应答。     

TGFβ1质粒DNA直接瘤内注射地小鼠肿瘤生长的影响

目的探讨裸ＤＮＡ质粒ＰＭＡＭｎｅｏ－ＴＧＦβ１小人直接注射后的表达及其对肿瘤生长的影响。方法 肺腺癌细胞株ＬＭ３小鼠背部皮下接种,两周后瘤。瘤体内多点多次直接注入质粒ＤＮＡＰＭＡＭｎｅｏＴＧＦβ１,并设空质粒和生理盐水注射组为对照,观察肿瘤生长情况。于第８周将小鼠处死,取新鲜的铰瘤组织提取ＲＮＡ,行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,并病理制片观察肿瘤组织结构的变化。结果ＴＧＦβ基因治疗组肿瘤生长速度增快,但各     

穿梭质粒pSP189快速提取和转染的方法

本文采用基于ＳＶ４０病毒的新型穿梭质粒ｐＳＰ１８９，作为ＰＺ１８９的衍生质粒其独特性在于ｐＳＰ１８９是一个质粒群每个质粒在其靶基因ｓｕｐＦＴＲＮＡ的３’端都所插入一段随机产生的８－ｂｐ的标识序列，通过对突变子靶基因ＳｕｐＦ和标识序列同时测序可以临别出一个转染细胞瓶中两个靶基因序列改变相同的突变子是独立突变还是同胞突变。胞中回收纯化的方法，结果表明，用我们的一步法从细菌中提质粒和改良的Ｈｉｒｔ法从细     

DNA的异常构型及检测方法

自从B-DNA右手双螺旋模型揭示以后,人们又陆续在质粒、原核细胞、真核细胞中发现了其它非B-DNA的构型。采取这些构型的是各种重复序列,尤其是串联重复序列。因非B-DNA构型不太常见,故又称之为异常构型。它们的作用涉及DNA重组、复制起止、基因转录及染色体浓缩等方面,也可能是各种诱变剂的作用热点。DNA构型与功能可能象蛋白质结构与功能一样,是颇有意义的研究领域。 1.DNA异常构型的存在 异常构型的存在是以重复序列的存在为     

以质粒为载体的小片段DNA做荧光原位杂交进行基因定位及检测

目的 建立以质粒为载体小片段ＤＮＡ的荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）基因定位及检测方法。方法 采用切口平移法以载有目的基因的质粒直接标记生物素制成探针,用ＦＩＳＨ法于外周血淋巴细胞中期分裂相定位新基因１Ａ６在卵巢癌和胃癌细胞株上检测癌基因ｃ－ｍｅｔ,ｃ－ｅｒｂＢ２,１Ａ６和抑癌基因ＡＰＣ,Ｒｂ。结果 新基因１Ａ６初步定位于Ｃ组某一染色体长臂远端,上述癌基因,抑癌基因在卵巢癌和胃癌细胞株中的获得清晰的杂交信     

顺铂、卡铂和双环铂对pBR322质粒DNA的断裂作用

目的：研究铂类抗癌药顺铂、卡铂和双环铂对pBR322质粒DNA的致断性。 方法：用琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析方法 结果：顺铂、卡铂、双环铂均可诱发pBR322质粒DNA断裂,对质粒DNA的半数致断剂量分别为33.71 μmol/L、3.31 mmol/L和1.61 mmol/L。 结论：对pBR322质粒DNA的致断性强弱依次为：顺铂>双环铂>卡铂。     

存活素siRNA表达质粒mU6／survivin的抑癌机制研究

目的：在本课题组报导存活素siRNA表达质粒（mU6／survivin质粒）能高效剔降乳腺癌细胞MCF-7中存活素表达的基础上,进一步探讨其抑癌机制。方法：采用MTT法、流式细胞术、Hoechst细胞形态染色和Westernblotting等检测mU6／survivin质粒对乳腺癌MCF-7细胞多项生物学指标的影响。结果：mU6／survivin质粒作用后,MCF-7细胞的增殖明显地受到抑制;细胞周期被阻滞在G1期,细胞呈现多核化、巨核化;caspase-3被激活,表达升高;IκBα、Cyt C和P21^WAF1蛋白表达升高,NF—κB（p65）蛋白表达无明显改变。结论：mU6／survivin质粒沉默MCF-7细胞中存活素表达后,DNA受损细胞停滞在G1期,细胞增殖受到抑制,此过程与Caspase级联放大、线粒体凋亡通路以及细胞周期调控等有关。细胞逃逸有丝分裂关卡的检查,阻断有丝分裂导致的细胞裂亡是其死亡的主要方式。     

TGFβ_1质粒DNA直接瘤内注射对小鼠肿瘤生长的影响

探讨裸ＤＮＡ质粒ＰＭＡＭｎｅｏ－ＴＧＦβ１小鼠瘤内直接注射后的表达及其对肿瘤生长的影响。方法肺腺癌细胞株ＬＭ３小鼠背部皮下接种，两周后成瘤。瘤体内多点多次直接注入质粒ＤＮＡＰＭＡＭｎｅｏＴＧＦβ１，并设空质粒和生理盐水注射组为对照，观察肿瘤生长情况。于第８周将小鼠处死，取新鲜的瘤组织提取ＲＮＡ，行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，并病理制片观察肿瘤组织结构的变化。结果ＴＧＦβ１基因治疗组肿瘤生长速度增快，但各组间肿瘤转移的差异无显著性。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实，注入到瘤体内的ＴＧＦβ１基因获得了高效表达。结论ＴＧＦβ１基因的瘤内表达可能通过某种机制刺激肿瘤的生长；裸ＤＮＡ质粒直接瘤内注射法作为ｉｎｖｉｖｏ基因转移手段有其不可低估的应用前景。     

存活素siRNA表达质粒mU6/survivin的抑癌机制研究

目的:在本课题组报导存活素siRNA表达质粒(mU6/survivin质粒)能高效剔降乳腺癌细胞MCF-7中存活素表达的基础上,进一步探讨其抑癌机制.方法:采用MTT法、流式细胞术、Hoechst细胞形态染色和Western blotting等检测mU6/survivin质粒对乳腺癌MCF-7细胞多项生物学指标的影响.结果:mU6/survivin质粒作用后,MCF-7细胞的增殖明显地受到抑制;细胞周期被阻滞在G1期,细胞呈现多核化、巨核化;caspase-3被激活,表达升高;IκBα、Cyt C和 P21WAF1蛋白表达升高,NF-κB(p65)蛋白表达无明显改变.结论:mU6/survivin质粒沉默MCF-7细胞中存活素表达后,DNA受损细胞停滞在G1期,细胞增殖受到抑制,此过程与Caspase级联放大、线粒体凋亡通路以及细胞周期调控等有关.细胞逃逸有丝分裂关卡的检查,阻断有丝分裂导致的细胞裂亡是其死亡的主要方式.     

一种简化改良的脑胶质瘤干细胞培养方法

背景与目的:目前对胶质瘤干细胞(brain glioma stem cells,BGSCs)的研究仍以细胞实验研究为主,因此培养出大量合格的BGSCs是所有相关研究的首要步骤.本实验用一种新的较简化的方法从临床人脑胶质瘤标本中进行脑胶质瘤干细胞的培养纯化.方法:对17例脑胶质瘤患者的手术标本进行处理,无血清悬浮培养法进...