釉基质蛋白影响人牙囊细胞生物学特性的实验研究

目的:观察釉基质蛋白(EMPs)对牙囊细胞(HDFC)增殖及碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:利用酶消化联合组织块培养法获得HDFC。以一定浓度的EMPs作用于牙囊细胞,通过四唑盐比色法和酶动力学方法检测对细胞增殖及ALP活性的变化。结果:EMPs对HDFC具有促增殖作用,其中100mg/L的EMPs的促增殖作用最显著,其促增殖作用可持续至第7天;100mg/L的EMPs可上调ALP活性。结论:EMPs可促进HDFC增殖,影响其ALP活性,可能在牙囊细胞的诱导分化中起重要作用。     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞总蛋白含量和超微结构的影响

目的：观察釉基质蛋白对人牙周膜细胞总蛋白含量及超微结构的影响。方法：组织块法培养人牙周膜细胞。考马斯亮蓝法测定人牙周膜细胞的总蛋白含量。透射电镜技术观察细胞超微结构。结果：釉基质蛋白质量浓度在50mg／L时即可明显增加人牙周膜细胞的总蛋白含量，l00mg／L时细胞的总蛋白含量增加到最大，此时，细胞的超微结构显示：核仁明显，粗面内质网及高尔基复合体发达。结论：釉基质蛋白能促进人牙周膜细胞核酸及蛋白质的合成活性。     

釉基质蛋白对牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的：探讨釉基质蛋白对于牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法：采用细胞培养技术,噻唑盐比色测定（MTT）法和酶动力学方法,观察釉基质蛋白对牙周膜细胞的作用。结果：釉基质蛋白组的牙周膜细胞,其增殖活性显著提高,以50mg/L浓度为最佳;其ALP活性也较对照组明显增加,以200mg/L浓度的效果最佳。具有一个合适的剂量范围。结论：釉基质蛋白可促进人牙周膜细胞的增殖和ALP活性。     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞群骨钙素的影响

目的研究人牙周膜细胞群(human periodontal ligament cell populations,hPDLPs)在釉基质蛋白(em-dogain,EMD)诱导下骨钙素(osteocalcin,OCN)表达的改变。方法组织块法分离培养人牙周膜细胞,实验组用含100 mg/L EMD的培养液诱导6 d,对照组不经EMD诱导培养。免疫细胞化学和实时定量聚合酶链反应(polymer-ase chain reaction,PCR)检测成牙骨质细胞矿化相关蛋白OCN的表达。结果免疫细胞化学结果显示,实验组和对照组hPDLPs细胞胞浆均可见黄色或棕黄色颗粒,OCN表达呈阳性;实验组hPDLPs的OCN检测平均光密度值为0.172 43±0.014 85,对照组为0.167 01±0.017 03,组间差异无统计学意义(t=0.757,P=0.459);实时定量PCR检测结果显示,实验组骨钙素相对表达量是对照组的1.13倍。结论 EMD对hPDLPs的OCN表达无明显影响。     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞群在牙骨质上附着与增殖的影响

目的研究釉基质蛋白(emdogain,EMD)对体外培养的人牙周膜细胞群(human periodontal ligament cellpopulations,hPDLPs)在牙骨质片上附着、增殖的影响,为EMD联合hPDLPs应用于牙周组织缺损修复提供实验依据。方法采用组织块法分离培养hPDLPs,制备人牙骨质片,实验组用含100 mg/mL EMD的培养液包被处理牙骨质片,对照组用不含EMD的培养液处理。分别于细胞接种牙骨质片上16 h(观察附着情况)和72 h(观察增殖情况),用噻唑蓝比色法检测牙骨质片上的细胞数;同时,用扫描电镜观察牙骨质片上的细胞数。结果噻唑蓝比色法检测,实验组细胞附着数(t=-3.318,P=0.008)、增殖数(t=-6.499,P<0.001)明显多于对照组,两组之间差异有统计学意义。扫描电镜观察计数,实验组hPDLPs附着数(t=8.001,P<0.001)、增殖数(t=13.046,P<0.001)较对照组多,差异有统计学意义。结论 EMD可促进hPDLPs在牙骨质表面的附着和增殖,提示EMD和hPDLPs可联合应用修复牙周组织缺损。     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞粘附、伸展的影响

目的：了解釉基质蛋白对人牙周膜细胞黏附，伸展的影响。方法：改良组织块法培养人牙周膜细胞，固相结合分析方法观察釉基质蛋白对人牙周膜细胞黏附，伸展的影响。结果：实验组PDLC黏附率与对照组无差别，实验组PDLC伸展率高于对照组。结论：EMPs对PDLC黏附无影响，但可促进其伸展。     

釉基质蛋白对猪骨髓基质细胞黏附、伸展及增殖的影响

目的：研究釉基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）对体外培养的猪骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）黏附、伸展和增殖活性的影响。方法：抽取猪髂骨骨髓．全血培养法获得骨髓基质细胞。培养液中EMPs的浓度分别为25、50、100、200μg／ml,以不加EMPs为对照。用比色法检测不同浓度EMPs对BMSCs黏附的影响。通过计数预定视野中伸展的细胞数,计算BMSCs在培养1h、3．5h、6、5h后的伸展率。MTT法测定各组细胞的增殖活性。对实验数据行单因素方差分析和SNK法组间比较。结果：猪BMSCs在含有EMPs的培养液中生长良好。对照组以及不同浓度EMPs实验组对细胞黏附的影响无统计学差异。在1h、3．5h、6．5h．各组细胞的伸展率无显著不同。EMPs对BMSCs的促增殖作用呈浓度和时间依赖性．200μg／ml浓度的EMPs从实验的第3天开始．显著促进猪BMSCs的增殖。结论：EMPs对体外培养的猪BMSCs的黏附和伸展无显著影响．200μg／ml浓度的EMPs可显著促进猪BMSCs增殖,为联合应用EMPs和BMSCs修复牙周组织缺损提供了理论依据。     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞合成骨桥蛋白、骨涎蛋白的影响

目的:观察釉基质蛋白对体外培养的人牙周膜细胞合成骨桥蛋白、骨涎蛋白能力的影响.方法:乙酸法提取猪釉基质蛋白,改良组织块法原代培养人牙周膜细胞,免疫细胞化学方法和图像分析方法观察细胞合成骨桥蛋白、骨涎蛋白的能力.结果:人牙周膜细胞胞浆骨桥蛋白、骨涎蛋白染色阳性,200、100、50mg/L釉基质蛋白作用下可以使细胞胞浆骨桥蛋白、骨涎蛋白染色不同程度地加深.人牙周膜细胞在釉基质蛋白作用下,最早从第3d开始骨桥蛋白表达增加、从第7d开始骨涎蛋白表达增加.结论:一定浓度的釉基质蛋白在特定的时间可以促进牙周膜细胞合成骨桥蛋白、骨涎蛋白.     

釉基质蛋白与不同化学方式联合处理根面对牙周膜细胞附着、增殖的影响

目的：观察釉基质蛋白（enamel matrix proteins，EMPs）与不同的化学方式联合处理牙周炎患牙根面后对牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）附着和增殖的影响，为牙周炎患牙体外牙周组织构建奠定基础。方法：收集因晚期牙周炎拔除的患牙60个，经刮治和根面平整后，制备5mm&#215;5mm&#215;1mm大小的根片并随即分成3组，分别用20g/L盐酸四环素、240g／LEDTA、生理盐水（对照组）处理3min后，再使用100ug／mL EMPs处理2h。人PDLCs体外培养后接种于各组根片并于24h后在扫描电镜下、HE染色观察细胞的附着状况，分别在1、3、5、7d用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖，并对数据进行双因素方差分析，检测水准α=0．05。结果：两实验组采用化学处理与EMPs联合应用后，PDLCs在根片上的附着良好，可见细胞间大量丝状伪足相连，HE染色显示细胞沿根片呈连续排列，优于单纯使用EMPs的对照组。接种第3天开始，240g／LEDTA＋EMPs组的细胞量，比对照组有显著增多（P〈0．05），接种第5天开始，20g/L盐酸四环素＋EMPs组的细胞量比对照组有显著增多（P〈0．05），而两实验组之间无显著性差异。结论：EMPs与不同化学处理方式联合处理牙周炎患牙根面相比，单纯使用EMPs更有利于PDLCs在根面的附着和增殖，而240g／LEDTA与EMPs配伍使用有助于PDLCs在根面的早期增殖。     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞形成I型胶原、Ⅲ型胶原的影响

目的：观察釉基质蛋白对体外培养的人牙周膜细胞形成I型胶原、Ⅲ型胶原的影响。方法：改良组织块法培养人牙周膜细胞，免疫细胞化学方法和图像分析方法观察细胞形成I型胶原、Ⅲ型胶原的能力。结果：50、100、200mg/L的釉基质蛋白可以促进牙周膜细胞合成I、Ⅲ型胶原，其中，以100mg/L釉基质蛋白的促I型胶原合成作用最明显，50mg/L釉基质蛋白的促Ⅲ型胶原合成作用最明显。但是，这种促进作用有一定的时间性。结论：一定浓度的釉基质蛋白可以促进牙周膜细胞形成I型胶原、Ⅲ型胶原。     

牙周韧带细胞在纯钛表面的附着特征

目的　观察牙周韧带细胞在商用纯钛表面的附着特征。方法　MTT法分析牙周韧带细胞在商用纯钛表面的早期粘附 ,采用落射荧光观察细胞的粘附形态。结果　牙周韧带细胞在纯钛表面的早期粘附 2h达到饱和态 ,且呈现不同的粘附时相。细胞之间逐渐以丝状结构联接 ,丝状结构与钛片的打磨走向一致 ,最后融合成片。结论　牙周韧带细胞在纯钛表面的粘附具有规律性 ,纯钛的表面处理方法对细胞的生长极性有明显影响     

釉基质衍生物对人牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的研究釉基质衍生物对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响并探究其可能的机制。方法原代培养人牙周膜干细胞,经过流式鉴定后选取第3代细胞进行实验。采用CCK-8试剂盒检测不同浓度(0、20、50、100 mg·L^-1)的釉基质衍生物对人牙周膜干细胞增殖的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测不同浓度(0、20、50、100 mg·L^-1)釉基质衍生物对人牙周膜干细胞成骨分化的影响;通过Trichrome染色和Von Kosa’s染色检测不同浓度(0、20、50、100 mg·L^-1)釉基质衍生物对人牙周膜干细胞胶原合成和矿化结节形成的影响;不同浓度釉基质衍生物和DDK1作用人牙周膜干细胞之后,通过Western blot和qRT-PCR检测β-连环蛋白、RunX2、CaMKⅡ及NLK表达情况。结果釉基质衍生物对人牙周膜干细胞的增殖具有明显的促进作用,并呈现剂量和时间依赖性;釉基质衍生物处理人牙周膜干细胞之后,矿化结节形成和胶原合成显著增多,骨钙素、Ⅰ型胶原、RunX2的表达明显增多;另外,釉基质衍生物处理能显著增加β-连环蛋白、RunX2、CaMKⅡ和NLK的表达,且该作用可被DDK1抑制。结论釉基质衍生物对体外培养的人牙周膜干细胞有促进增殖和成骨分化的作用,其作用可能是通过Wnt/β-连环蛋白实现的。     

釉基质蛋白对牙周膜细胞增殖和牙骨质相关蛋白基因表达的影响

目的 通过研究釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMP)对人牙周膜细胞增殖及牙骨质相关蛋白基因表达的影响,探讨EMP促进牙骨质形成的机制.方法 分别用质量浓度为0(对照组)、50、100、200、300 mg/L的EMP作用于培养的人牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLC),在培养的第1、3、5、7天用甲基噻唑基四唑法检测细胞增殖活性;在培养的第7天用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法检测各组细胞牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein,CAP)和牙骨质蛋白23(cementum protein-23,CP-23)mRNA表达量.结果 EMP质量浓度在50 ～ 200 mg/L范围内可以促进人PDLC增殖,在300 mg/L时抑制细胞增殖;EMP质量浓度为100、200 mg/L时可以显著促进CAP mRNA(分别为4.661 ±0.154、5.923±0.788)和CP-23mRNA的表达(分别为1.222±0.089、3.795±0.640)与对照组(CAP:1.006±0.062,CP-23:1.012±0.163)相比差异均有统计学意义(P＜0.05),且以200 mg/L EMP的促表达效果最佳.结论 EMP在一定浓度范围内能促进人PDLC增殖及CAP和CP-23基因表达,提示EMP可能通过促进细胞增殖和牙骨质相关蛋白的表达促进牙骨质的形成.     

牙周韧带细胞及成骨样细胞在纯钛表面附着的形态学比较

目的：从形态学上比较牙周韧带细胞及成骨样细胞在纯钛表面的附着及增殖情况。方法：在相同的培养条件下，商用纯钛表面分别接种牙周韧带细胞和成骨样细胞，采用倒置显微镜及扫描电镜进行形态学观察。结果：两种细胞在纯钛表面均附着、生长良好，7天后细胞即连接成片，并在钛片边缘存在“细胞聚集”现象，呈现复层生长。扫描电镜显示两种细胞附着早期呈“伪足”样伸展，附着后期形成大量的细胞外基质成份。两种细胞在细胞形态、“伪足”形态及钛片周边聚集形态上均存在明显差异。结论：牙周韧带细胞和成骨样细胞与纯钛均有良好的生物相容性，在体外培养过程中，呈现不同细胞形态、“伪足”形态及钛片周边聚集形态，提示两种细胞在分化过程中可能存在差异。     

纯钛表面牙周韧带细胞牙骨质附着蛋白的表达

目的以牙骨质附着蛋白为分化指标，分析牙周韧带细胞在纯钛表面的分化趋势，并探讨诱导矿化对牙周韧带细胞牙骨质附着蛋白表达的影响。方法第三代牙周韧带细胞在商用纯钛表面接种后，分别进行常规培养和矿化液诱导矿化培养，通过免疫荧光原位检测牙骨质附着蛋白的表达，并比较诱导矿化对牙骨质附着蛋白表达的影响。结果牙周韧带细胞在纯钛表面初期呈条纹状生长，常规培养和诱导矿化培养务件下均能表达牙骨质附着蛋白，诱导矿化对牙骨质蛋白的表达无明显影响。结论在常规培养务件和诱导矿化培养条件下，纯钛表面生长的牙周韧带细胞能高度表达牙骨质附着蛋白，提示纯钛表面体外培养的牙周韧带细胞具有形成牙骨质的分化趋势，从而可为种植体周构建牙周韧带结构提供在种植体侧的锚着点。     

Autocrine growth factors in human periodontal ligament cells cultured on enamel matrix derivative

OBJECTIVE: Enamel extracellular matrix proteins in the form of the enamel matrix derivative EMDOGAIN (EMD) have been successfully employed to mimic natural cementogenesis to restore fully functional periodontal ligament, cementum and alveolar bone in patients with severe periodontitis. When applied to denuded root surfaces EMD forms a matrix that locally facilitates regenerative responses in the adjacent periodontal tissues. The cellular mechanism(s), e.g. autocrine growth factors, extracellular matrix synthesis and cell growth, underlying PDL regeneration with EMD is however poorly investigated. MATERIAL AND METHODS: Human periodontal ligament (PDL) cells were cultured on EMD and monitored for cellular attachment rate, proliferation, DNA replication and metabolism. Furthermore, intracellular cyclic-AMP levels and autocrine production of selected growth factors were monitored by immunological assays. Controls included PDL and epithelial cells in parallel cultures. RESULTS: PDL cell attachment rate, growth and metabolism were all significantly increased when EMD was present in cultures. Also, cells exposed to EMD showed increased intracellular cAMP signalling and autocrine production of TGF-beta1, IL-6 and PDGF AB when compared to controls. Epithelial cells increased cAMP and PDGF AB secretion when EMD was present, but proliferation and growth were inhibited. CONCLUSION: Cultured PDL cells exposed to EMD increase attachment rate, growth rate and metabolism, and subsequently release several growth factors into the medium. The cellular interaction with EMD generates an intracellular cAMP signal, after which cells secrete TGF-beta1, IL-6 and PDGF AB. Epithelial cell growth however, is inhibited by the same signal. This suggest that EMD favours mesenchymal cell growth over epithelium, and that autocrine growth factors released by PDL cells exposed to EMD contribute to periodontal healing and regeneration in a process mimicking natural root development.