最适苦参碱浓度并用冻存保护剂对L-02人肝细胞系冻存保护的效应

目的：观察不同浓度剂量苦参碱与冻存保护剂联用对L-02人肝细胞系液氮冻存复苏后功能的影响，探索一种适合肝细胞保存的新方法。 方法：实验于2005—01／07在南方医科大学中心实验室进行。常规培养的L—02人细胞系用胰酶消化后，将收集的L-02人肝细胞系分别以6种不同的冻存液（10％二甲基亚砜、5％二甲基亚砜＋0mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋0．2mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋2mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱、5％二甲基亚砜＋10mg／L苦参碱）在液氮中冷冻保存1个月。1个月后快速复苏L-02人肝细胞系，进行存活率、形态学及功能检测。结果：03复苏后L-02人肝细胞系的活存率5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组明显高于其他处理组[胰酶刚消化的细胞活率为（96．2&;#177;1．4）％，10％二甲基亚砜组（76．6&;#177;3．8）％，5％二甲基亚砜组（81．9&;#177;2．4）％，5％二甲基亚砜&;#177;0．2mg／L苦参碱组（81．6&;#177;2．4）％，5％二甲基亚砜＋2mg／L苦参碱组（84．7&;#177;2．8）％，5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组（89．6&;#177;3．4）％，5％二甲基亚砜＋10mg／L苦参碱组（86．9&;#177;1．6）％，P〉0．051。②复苏后5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组肝细胞完整性恢复快，肝细胞生长旺盛，细胞膜完整，胞浆内有丰富颗粒，核仁清楚，与未冻存组肝细胞形态相似。③复苏后L-02人肝细胞系培养上清液尿素含量、上清液白蛋白含量5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱组明显高于其他处理组，与对照组无显著差异。 结论：①苦参碱对L-02人肝细胞液氮冻存有保护作用，6mg／L苦参碱是最好的浓度。②苦参碱、二甲基亚砜有协同作用，5％二甲基亚砜＋6mg／L苦参碱联合冻存保护体系显著提高L-02人肝细胞系的冻存质量。     

苦参碱对于人肝细胞冻存保护效应的实验性研究

目的:了解苦参碱对人肝细胞液氮冻存复苏后功能的影响,探索一种改善人肝细胞冻存的新方法。方法:将胎肝细胞及常规培养的L-02人肝细胞系分别以5种不同冻存保护体系犤10%二甲亚砜(DMSO)、5%DMSO+0.2mg/L苦参碱、5%DMSO+2mg/L苦参碱、5%DMSO+6mg/L苦参碱、5%DMSO+10mg/L苦参碱犦在液氮中冷冻保存1个月。1个月后快速复苏,进行存活率、形态学及功能检测。结果:不同冻存保护体系保存的人肝细胞存活率、形态学及功能表现均有所不同。其中5%DMSO+6mg/L苦参碱组效果最好,复苏后细胞存活率、24h贴壁率及细胞功能检测优于其他冻存液组。结论:⑴苦参碱对人肝细胞液氮冻存有保护作用,6mg/L苦参碱是最好的浓度;⑵苦参碱与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用。     

不同冻存液改善人胎肝细胞冻存质量比较

目的:通过对不同冻存液冻存人胎肝细胞进行比较,探索一种效果较好的冻存液以改善冻存肝细胞质量。方法:实验于2004-08/11在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。采用二步灌注法分离人胎肝细胞,将分离后的胎肝细胞分别以3组不同冻存液(H AM F-12,RPM I-1640,DM EM)在液氮中冷冻保存4周。4周后快速复苏胎肝细胞,进行存活率、形态学及尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量检测。结果:①HAM F-12组生存率为(86.0±2.4)%,明显优于RPM I-1640组(81.9±6.5)%和DM EM组(82.1±4.6)%。②H AM F-12组肝细胞极性恢复快,肝细胞生长旺盛,细胞膜完整,胞浆内有丰富颗粒,核仁清楚,少数细胞内出现空泡,与对照组肝细胞形态相似。③用H AM F-12组液冻存人胎肝细胞复苏后,尿素、白蛋白、谷草转氨酶分泌量优于RPM I-1640组和DM EM组。结论:①在其他冻存条件相同下,HAM F-12冻存液显著提高了人胎肝细胞冻存质量,优于RPM I-1640液、DM EM液。②复苏后H AM F-12组肝细胞形态学光镜下观察与刚分离的肝细胞无明显差异,进行原代培养后肝细胞极性恢复较好。     

传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较

目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法。方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行。①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准)。冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5mol/L乙二醇 体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液 0.1mol/L蔗糖)两部分。②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞。胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察。③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察。④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组。⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况。结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P<0.01)。②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48h。③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数>10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P<0.01)。结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率。     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景:目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。目的:观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。方法:取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1mol/L二甲基亚砜,0.1mol/L海藻糖,0.1mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜,0.3mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。结果与结论:免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3mol/L海藻糖+0.1mol/L二甲基亚砜处理和经0.1mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20mol/L。     

海藻糖保护同种带瓣大动脉的最适浓度

背景：目前液氮低温保护组织和器官技术已经非常成熟,但其保护剂一直以来争论不一。目的：观察不同冷冻保护剂对液氮深低温冻存同种带瓣大动脉组织细胞凋亡和代谢的影响,寻求最佳的冷冻保护剂及冷冻保护剂的最适浓度。方法：取新西兰大白兔带瓣主动脉、肺动脉标本,将其在液氮中冻存12,15,18个月,冻存液分别使用0.1mol/L二甲基亚砜,0.1mol/L海藻糖,0.1mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.3mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜。标本复温后,免疫组织化学方法检测标本的细胞凋亡情况,葡萄糖消耗量测定法检测组织细胞的代谢水平。结果与结论：免疫组织化学和葡萄糖消耗量测定结果均显示经0.1mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜,0.2mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜冻存液处理的标本冻存效果最好,其次是经0.3mol/L海藻糖＋0.1mol/L二甲基亚砜处理和经0.1mol/L海藻糖单独处理的标本,单独使用0.1mol/L二甲基亚砜处理的标本冻存效果最差。说明海藻糖对液氮深低温保存同种带瓣大动脉活性有很好的保护作用,单独使用海藻糖优于单独使用二甲基亚砜,联合应用海藻糖和二甲基亚砜效果更好,且联合应用的海藻糖最佳浓度范围是0.10~0.20mol/L。     

冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的：观察应用10％牛血清白蛋白＋20％二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后，其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：实验于2004-02／2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后，培养于含10％牛血清白蛋白和20％二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中，在液氮中分别冷冻保存6，12，及18个月后，重新复苏培养于神经干细胞培养液中，并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。 结果：①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后，除少数细胞贴壁死亡外，多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6，12，18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为（15．3&;#177;3．4）％，（16．2&;#177;1．8）％，（15．6&;#177;2．2）％，（16．7&;#177;2．8）％，方差分析显示各组间差异无显著性（F=1．799，P〉0．05）。 结论：冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。     

组织深低温冻存中保护剂的应用

背景：深低温冻存可以使离体组织的活性及功能最大限度的保留,对医学研究、临床治疗起到巨大能动作用。但在复合组织深低温冻存中,保护剂及应用还存在着很多问题有待解决。目的：综述近年国内外深低温冻存中保护剂应用的研究进展。方法：第一作者应用计算机检索2003年1月至2012年12月PubMed数据库、中国期刊全文数据』万方数据库相关文章,英文检索词为“cryopreservation,cryoprotectant,compositetissues,vitrificatiion,transplantation”;中文检索词为“深低温保存,保护剂,复合组织,玻璃化,移植”。共检索到1篇相关文献,67篇文献符合纳入标准。结果与结论：自上世纪开始国内外许多学者经过大量动物细胞和组织的基础实验研究,不断探寻各科胞组织的冻存方法,采用了多种多样的冻存技术,使用的保护剂种类繁多,取得一定的研究成果,发保护剂的应用在深低温组织冻存中起到了至关重要的作用,深低温冻存在组织工程、生殖医学、移植领域已有广泛的应用。但目前复合组织深低温冻存保护剂的应用尚处于研究阶段,保护剂的种类、浓以及导入洗脱方法均直接影响最终组织保存的成败。     

冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的:观察应用10%牛血清白蛋白 20%二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后,其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。方法:实验于2004-02/2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后,培养于含10%牛血清白蛋白和20%二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中,在液氮中分别冷冻保存6,12,及18个月后,重新复苏培养于神经干细胞培养液中,并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。结果:①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后,除少数细胞贴壁死亡外,多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后,免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6,12,18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为(15.3±3.4)%,(16.2±1.8)%,(15.6±2.2)%,(16.7±2.8)%,方差分析显示各组间差异无显著性(F=1.799,P>0.05)。结论:冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。     

瘦素对人L-02脂肪变肝细胞胆固醇流出的影响

目的 观察瘦素对人L-02脂肪变肝细胞胆固醇流出及小凹蛋白（cavdin-1）、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ASCAI）mRNA表达的影响，探讨瘦素在非酒精性脂肪性肝病发生、发展中的作用。方法 用20％的医用脂肪乳配制成10％的浓度，与10％的胎牛血清培养基共同培养细胞，造模时间24h，造模后分别用瘦素处理，浓度分别为10^-5、10^-6、10^-7mol／L，处理24h。每纽均行油红“O”染色。用RT—PCR测定cavelin—1、ABCA1mRNA表达。结果 油红“O”染色显示，10％的脂肪乳处理24h能成功制造肝细胞脂肪变性模型。RT—PCR显示肝细胞脂肪变性后cavelin-1及ABCA1mRNA表达增加。模型组加入瘦素处理后cavelin-1、ABCA1mRNA表达明显增加，且与瘦素浓度呈正相关。结论 10％的脂肪乳能导致肝细胞脂肪变性，肝细胞脂肪变性时，10^-7-10^-5mol／L浓度的瘦素能上调cavdin—1、ABCA1mRNA表达，促进细胞内胆固醇的逆转运。提示瘦素对治疗非酒精性脂肪肝病有一定作用。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景:获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的:比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法:贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论:随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞(P<0.01);细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异(P>0.05)。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞(P<0.01)。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞(P<0.01)。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞(P<0.01)。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景：获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的：比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法：贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论：随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞（P〈0.01）;细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异（P〉0.05）。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞（P〈0.01）。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞（P〈0.01）。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞（P〈0.01）。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。     

雷公藤甲素配伍芍药苷对L-02细胞毒性的影响

目的:研究芍药苷配伍雷公藤甲素对L-02细胞毒性的影响。方法:采用MTT法比较雷公藤甲素单用与雷公藤甲素配伍芍药苷对人肝细胞L-02细胞存活率的影响,以研究芍药苷对雷公藤甲素的减毒作用。结果:雷公藤甲素对L-02细胞的无毒范围在6.250 0 ng/ml以下,芍药苷对L-02细胞的无毒范围在1 000.0μg/ml以下。芍药苷与雷公藤甲素以1 000:1的比例配伍可降低雷公藤甲素对L-02细胞的毒性作用,减少雷公藤甲素对L-02细胞损伤,提高细胞存活率。结论:配伍芍药苷可降低雷公藤甲素的细胞毒性,这为后期研究和药物比例选择提供了依据。     

苦参胶囊联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的临床研究

目的:观察苦参胶囊联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的临床疗效。方法:34例HBeAg与HBVDNA均阳性的慢性乙肝患者接受苦参胶囊联合拉米夫定治疗12个月,并与30例单用拉米夫定治疗的患者进行对比。结果:疗程结束时,观察组HBVDNA阴转率为82.3%与对照组76.7%相比无明显差异(P>0.05)。观察组HBeAg阴转率为58.8%明显高于对照组36.7%(P<0.01)。疗程结束后随访6个月观察组HBeAg与HBVDNA持续阴转率为61.8%、85.4%明显高于对照组的33.3%、73.3%(P<0.01)。观察组HBeAg与HBVDNA的复发率明显低于对照组(P<0.05)。结论:苦参胶囊与拉米夫定联合应用有协同作用,可提高疗效,减少病毒耐药,降低复发率。     

A method for the cryopreservation of red blood cells using hydroxyethyl starch as a cryoprotectant

A simple, quick, inexpensive and long term method of cryopreserving human red cells using hydroxyethyl starch (HES) as a cryoprotectant is described. No sophisticated equipment or skilled labour is required. As HES is a plasma expander, it does not have to be removed prior to transfusion, thereby obviating the requirement for a washing stage. This allows 60 units/h to be prepared. As the microbiological integrity of the system is maintained, there is potential for prolonged storage post-thaw at 4 degrees C. Recoveries of 99% and 30 min saline stabilities in excess of 91% have been consistently achieved. P50O2 and 2,3DPG values are not significantly decreased.     

纳米石墨碳对人L-02细胞系生长状况的影响

目的研究纳米石墨碳对人正常肝细胞系L-02生长状况的影响。方法电子显微镜观察纳米石墨碳颗粒的形态,激光粒度分析仪测定其粒径及Zeta电位;流式细胞术检测纳米石墨碳作用24 h对L-02肝细胞生长周期的影响;电镜观察细胞剖面,用以考察纳米石墨碳颗粒对L-02肝细胞亚显微结构的影响。结果电镜下纳米石墨碳颗粒呈微小球形,粒径在20～50 nm,表面带负电荷,电位值为-14.8 mV;流式细胞检测结果示实验组L-02肝细胞G0/G1细胞百分数低于对照组,G2/M细胞百分数高于对照组,S期细胞百分数高于对照组;电镜观察纳米石墨碳在细胞质和细胞核内均有分布,实验组肝细胞内的线粒体与对照组无明显差异,胞膜核膜均完整。结论纳米石墨碳颗粒促进了L-02肝细胞的增殖,纳米石墨碳颗粒可以很好地进入到L-02肝细胞内部,未见其对细胞亚显微结构造成损伤。     

苦参素与黄芪注射液联合治疗慢性乙肝疗效观察

目的探讨苦参素与黄芪注射液联合治疗慢性乙型肝炎的疗效。方法将100例慢性乙型肝炎患者随机分为治疗组52例与对照组48例。治疗组在支持治疗的基础上采用苦参素注射液和黄芪注射液进行治疗,疗程90d;对照组采用胸腺肽注射液、甘草酸二铵注射液进行治疗,疗程90d。两组在用药前后分别观察肝功、乙肝病毒指标及肝纤维化指标的变化。结果治疗90d末,A/G复常率治疗组80%(28/35),对照组53.5%(15/28);HBV DNA阴转率治疗组38.5%(20/52),对照组18.8%(9/48);HBeAg阴转率治疗组38.5%(20/52),对照组20.8%(10/48);肝纤维化指标治疗组较对照组明显改善(P<0.01)。结论苦参素与黄芪注射液具有良好的保肝、抗乙肝病毒、抗肝纤维化作用,治疗慢性乙型肝炎疗效确切。